Fluoreszierendes orthotopes Mausmodell: Implantation von GFP-exprimierenden Krebszellen in eine Maus zur Beurteilung der Tumorprogression in vivo

- Krebszellen, die grün fluoreszierendes Protein oder GFP exprimieren, ermöglichen die Überwachung des Tumorwachstums und der Metastasierung durch nicht-invasive optische Bildgebung. In der Regel implantieren wir diese Zellen in ein orthotopes Modell, das die Nachbildung der Tumormikroumgebung ermöglicht und die Interaktion von Tumorzellen mit ihrer Umgebung nachahmt.

Beginnen Sie damit, eine betäubte Maus auf ein warmes Heizkissen zu legen. Führen Sie nun seine Nase in eine Nasenmaske ein, um Sauerstoff und Isofluran, ein Betäubungsmittel, zu versorgen. Machen Sie mit einer Schere einen kleinen Schnitt und schneiden Sie das Gewebe auf. Ziehe die Milz zusammen mit der Bauchspeicheldrüse vorsichtig heraus und lokalisiere den Bauchspeicheldrüsenschwanz.

Laden Sie eine Spritze mit fluoreszierender Krebszellensuspension und injizieren Sie sie vorsichtig in den Pankreasschwanz. An der Injektionsstelle erscheint eine oberflächliche Blase, die die erfolgreiche Implantation bestätigt. Legen Sie die Organe wieder in die Körperhöhle und verwenden Sie eine sterile Naht, um den Schnitt zu schließen. Setzen Sie nun die Maus wieder in einen Käfig ein und überwachen Sie sie bis zur Wiederherstellung.

Platzieren Sie die Maus nach der gewünschten Dauer in einer Bildgebungskammer und nehmen Sie Bilder auf. Der Lichtstrahl trifft auf die Krebszellen und regt das GFP an, was wiederum eine grüne Fluoreszenz erzeugt. Im folgenden Protokoll werden wir die chirurgische Implantation von GFP-exprimierenden Pankreaskarzinomzellen in einem orthotopen Mausmodell der Maus durchführen.

Um die Zellen zu implantieren, tragen Sie zunächst Salbe auf die Augen einer betäubten Maus auf und legen Sie das Tier auf ein Heizkissen, das mit einem sterilen Tuch bedeckt ist. Desinfizieren Sie dann die Flanke des Tieres vorsichtig mit drei Jodpeelings, gefolgt von drei Spülungen mit 70 % Ethanol. Nachdem Sie bestätigt haben, dass Sie nicht auf das Einklemmen der Zehen reagieren, laden Sie etwa 200 Mikroliter der vorbereiteten Zellen in eine vorgekühlte 1-Milliliter-TB-Spritze, die mit einer 18-Gauge-Nadel ausgestattet ist.

Ersetzen Sie die 18-Gauge-Nadel durch eine 27-Gauge-Nadel und legen Sie die Zellen wieder auf Eis. Lokalisieren Sie dann den allgemeinen Bereich der Milz im oberen linken Quadranten des Bauches. Kneifen Sie mit einer Pinzette die Haut über der Milz zusammen und machen Sie einen etwa 1 Zentimeter langen Schnitt, um eine Tasche zu schaffen. Kneifen Sie dann den glatten Muskel auf die Milz und schneiden Sie durch das Gewebe, um Zugang zur Bauchhöhle zu erhalten.

Fassen Sie dann vorsichtig das kaudale Ende der Milz und ziehen Sie es aus der Körperhöhle. Spreizen Sie mit einem feuchten, sterilen Wattestäbchen die Bauchspeicheldrüse, die am Ende der Milz befestigt ist, um den Bauchspeicheldrüsenschwanz zu lokalisieren. Geben Sie 50 Mikroliter der Zellen in den Schwanz der Bauchspeicheldrüse. Drehen Sie dann die Nadel langsam aus der Bauchspeicheldrüse.

Eine erfolgreiche Implantation sieht aus wie eine oberflächliche Blase ohne Lecks. Bringen Sie die Organe wieder in die Bauchhöhle zurück und umschließen Sie alles mit dem Muskel und der Haut. Verwenden Sie dann eine 6-0-Naht, um den Schnitt zu schließen. Injizieren Sie anschließend den Tieren Ketoprofen und überwachen Sie sie, bis sie vollständig genesen sind. Verwenden Sie zum geeigneten Versuchszeitpunkt ein kommerzielles Kleintierbildsystem, um das Tumorwachstum im lebenden Tier unter Narkose abzubilden, und wählen Sie die geeigneten Anregungs- und Emissionsfilter aus.

Als Nächstes erhalten Sie ein erstes Bild nur mit weißem Licht. Halten Sie das Tier in der gleichen Position, wechseln Sie zu den GFP-Filtern und nehmen Sie ein zweites Bild auf. Um das Tumorwachstum zu analysieren, überlagern Sie die weißen und fluoreszierenden Bilder, um die Fluoreszenzfläche und -intensität der Tumorzellen zu beurteilen.