Name: Experimentelle Modelle für das Studium der retinalen Pigmentepithelzellen Physiologie und Pathophysiologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Lernen Sie die Kultur menschlicher fetaler retinaler Pigmentepithelzellen (hfRPE) als Modell zur Untersuchung von Augenerkrankungen. Diese Methode ermöglicht zuverlässige in-vitro-Studien und präklinische Forschung.

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Wir danken Lab Mitglieder Jeffrey Adijanto, Tina Banzon, Rong Li, Qin Wan, Congxiao Zhang, Jing Zhao, Connie Zhi, Awais Zia, Natalia Strunnikova um Hilfe bei der Charakterisierung dieser Zellkulturen. Besonderer Dank geht an Jing Zhao, Connie Zhi und Tina Banzon für ihre Hilfe bei der Aufrechterhaltung große Bestände von Zellkulturen. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Intramural Research Program unterstützt.

1. Humane, fötale Gewebe Alle menschlichen Gewebe Forschung folgt den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki und der NIH Institutional Review Board. Fetal Augen sind von einem unabhängigen Auftraggeber, Advanced Bioscience Resources (ABR, Alameda, CA) erhalten, aus zufälligen Spender bei 16 bis 22 Wochen der Schwangerschaft, in RPMI-1640 Medium mit Röhren (von ABR) gestellt, auf Eis gepackt, und geliefert von einem über Nacht Priorität Lieferservice. Gewebe lebensfähig bleiben bis zu 48 Stunden nach der Enukleation. 2. Zellkulturmedium MEM-alpha modifiziertes Medium (Sigma-Aldrich) als Basismedium verwendet werden, um 5% vorbereiten und 15% Serum-haltigen Medien für die Kultivierung von RPE-Zellen (RPE Medium; Tabelle 1 unten). <table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Sigma </td><td> Gibco </td><td> Betrag </td><td> Lagerung </td></tr><tr><td> MEM, Alpha-Modifikation </td><td> M-4526 </td><td></td><td> 500 mL </td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td> N1 ergänzen </td><td> N-6530 </td><td></td><td> 5 mL </td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td></td><td> 15140-148 </td><td> 5 mL </td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td> Glutamax - I </td><td></td><td> 35050 </td><td> 5 mL </td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td> Nicht essentielle Aminosäuren </td><td> M-7145 </td><td></td><td> 5 mL </td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td> THT * </td><td></td><td></td><td></td><td> -80 ° C </td></tr><tr><td> Taurin </td><td> T-0625 </td><td></td><td> 125 mg </td><td></td></tr><tr><td> Hydrocortison </td><td> H-0396 10 </td><td></td><td> 10 ug </td><td></td></tr><tr><td> Triiod-thyronin </td><td> T-5516 </td><td></td><td> 0,0065 pg </td><td></td></tr><tr><td> Rinderfötenserum ** </td><td></td><td></td><td> 5% oder 15% </td><td> -80 ° C </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Humanem fötalen RPE Medium Komponenten zur Darstellung von 500 mL Medium * THT wird durch Auflösen von Taurin-Hydrocortison-Triiod-thyronin in 1 1,5 mL PBS, bevor Sie das Medium aus. Mehrere Aliquots hergestellt und bei -80 ° C bis Kultivierung Vorbereitung des Kulturmediums zu vereinfachen. ** Fötales Rinderserum ist nicht von Sigma-Aldrich oder Gibco erhalten. Rinderfötenserum in Medien Herstellung verwendet wird aus Atlanta Biologicals (Norcross, GA) erhalten. Jede Flasche des Serums hitzeinaktiviertem (56 ° C für 1 Stunde) vor dem Gebrauch. Um sicherzustellen, Zellkultur Konsistenz große Mengen an Serum aus der gleichen Charge gekauft und in -20 ° C bis sie für die Vorbereitung von Medien verwendet werden. Oder 12 - - Well-Platten für ein paar Wochen in Medien mit 20% FBS aus verschiedenen Chargen dünn gesät Zellen aus einer bestimmten Charge von hfRPE Zellen sind in 24 angewachsen. Der am schnellsten wachsende melanated Zellen mit den meisten klassischen RPE Morphologie (Kopfsteinpflaster) deuten auf eine geeignete Serum viel, dass für die Zellkultur eingesetzt werden können. Zellkulturmedium enthält außerdem: N1 Supplement (Sigma-Aldrich) 1:100 mL / mL, Glutamax / Penicillin-Streptomycin 1:100 mL / mL (Gibco) und essentielle Aminosäure-Lösung (Sigma-Aldrich) 1:100 mL / mL. Darüber hinaus Hydrocortison (20 ug / L), Taurin (250 mg / L) und Triiod-thyronin (0,013 g / L) (THT) ist vor durch Auflösen dieser drei Komponenten in PBS bis zu einer Endkonzentration von 1:500 vorbereitet (ml / ml). Aliquots von THT sind bei 80 ° C gelagert, bis auf die RPE zugesetzt. 3. Cell Culture Nach Erhalt intakt sind Globen in der Antibiotika-Antimykotikum-Lösung gespült (verdünnt auf 10X;.. Kat.-Nr. 15240-096; Invitrogen) plus Gentamicin (1 mg / mL) für 3 bis 5 Minuten (Abbildung 1 unten). <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Nach der Inkubation Antibiotika off zweimal mit Medium wie HBSS oder PBS gespült. Ein Auge Globus an der Zeit ist, 10 cm Petrischale mit beschichtet mit Sylgard-184 (WPI) übertragen und gesichert mit 27G Nadeln. Mit Clearcut Sideport Messer (Alcon) wird ein Schnitt durch die Lederhaut unter dem Ziliarkörper (3.1 der Entfernung vom Auge Äquator an der vorderen Fläche) hergestellt. Dieser Schnitt wird verwendet, um einen kreisförmigen Schnitt zur Entfernung der vorderen Augenabschnitt zu starten. Dieser Schnitt erfolgt mit einem Wolfram-Karbid beschichtet gebogenen Iris Schere mit einem Messer Wellenschliff (FST). Vor der Entfernung des vorderen Teil des Auges, ist ein Schnitt durch den Glaskörper, um zu verhindern Lösen der retina aus der RPE am hinteren Pol. In 5% Serum enthaltenden Medium für 40-60 Minuten; Nach dem vorderen Teil des Auges entfernt wird, wird der hintere Pol mit Dispase-I-Lösung (.. Roche Diagnostics, Indianapolis, IN 2 U / mL, Kat. Nr. 04942086001) inkubiert in 37 ° C-5% CO 2. Nach Dispase Behandlung werden die hinteren Pole eine HBSS in Petrischalen mit Silikon-Polsterung (Sylgard 184; Dow Corning, Midland, MI) übertragen und seziert in Quadranten oder größere Stücke ausreichend abflachen Gewebe. Dann wird die Netzhaut ist vorsichtig mit einer Pinzette entfernt. Einzel-Zell-RPE-Schichten wurden aus in Blätter geschält und direkt in kaltes Trypsin-EDTA (Gibco, # 25200-056)-Lösung gesammelt. Nach dem RPE erhoben werden, sind Rohre mit Gewebe in Trypsin-EDTA versiegelt und in Wasserbad für 10-15 Minuten bei 37 ° C. Nach 10 Minuten Inkubation werden die Rohre kräftig geschüttelt, um RPE in kleinen Gruppen zu trennen. Wenn die Trennung nicht vollständig ist, werden die Rohre wieder in Wasserbad für weitere 5 Minuten gesetzt. Nach Trypsin-EDTA Inkubation werden die Rohre für möglich un-gelösten gemischt Zellhaufen inspiziert. Jede beobachtete Cluster entfernt werden mit feinen Spitzen Glas Pasteur Pipette. Nach Abzentrifugieren (1,4 Umdrehungen pro Minute auf klinischen Zentrifuge für 4 min), sind hfRPE Zellen in 15% RPE Medien resuspendiert und dann in Flaschen Primaria (Beispiel: Kat.-Nr. 08-772-45; Fisher Scientific, Pittsburgh, PA.. ). Dieses Medium ist nach 1 Tag mit 5% Serum-haltigen RPE Medium ersetzt, und nachträgliche Änderungen vorgenommen wurden alle 2 bis 3 Tagen. Nach 3 bis 4 Wochen wurde die Zellen konfluent und gleichmäßig pigmentiert. Sie werden dann in 0,25% Trypsin-EDTA für 10 bis 15 Minuten mit Trypsin behandelt, in 15% Serum-haltigen RPE Zellkulturmedium resuspendiert und ausgesät auf klare Zellkultureinsätzen bei 150 bis 200K Zellen pro Well (Transwell; Corning Costar, Corning, NY), mit 12-mm Durchmesser Einsätze, 0,4-um Poren-, Polyester-Membranen (Beispiel: Kat.-Nr. 07-200-161, Fisher Scientific)... Vor der Aussaat wurden die Vertiefungen mit menschlichen extrazellulären Matrix (.. 10 ug in 150 ul HBSS pro Loch, Kat. Nr. 354237; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) beschichtet und gehärtet mit UV-Licht in der Motorhaube für 2 Stunden. In einigen Fällen wurde die Trypsinierung Verfahren für ein zweites Mal wiederholt, um die Zellen, die nicht nach dem ersten Trypsinierung habe lösen zu sammeln. Das gleiche Protokoll (ohne Beschichtung mit ECM) wurde zur Kultivierung von Zellen auf den Flaschen verwendet, um die P1 Population von Zellen zu generieren. Diese Zellen wurden in Experimenten verwendet werden, wenn sie insgesamt Gewebewiderstand von ≥ 200 Ω • cm 2 hatten und gleichmäßig pigmentiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2032/2032fig1full.jpg">Bitte hier klicken für ein größeres Bild 1</a> . 4. Step by Step Procedures <ol><li> Bereiten 12-Well-Platte mit mehreren Lösungen (für jedes Auge 4 Brunnen erforderlich): <ol class="lalpha"><li> add 10x Antibiotika Antimykotika-Lösung - 1 gut / Auge </li><li> add PBS / HBSS-Lösung für Spülen - 2 Brunnen / Auge </li><li> add Dispase-Lösung - 1 gut / Auge </li></ol></li><li> Bereiten Sie sezieren Petrischale mit dem Auspacken 5 Fixierung Nadeln und füllte es mit HBSS </li><li> Entpacken Sie die Augen und legen Sie sie in Antibiotika-Antimykotikum-Lösung für 3-5 Minuten (hergestellt in Schritt 1) </li><li> Spülen Sie die Augen in zwei Brunnen (hergestellt in Schritt 1) ​​mit PBS / HBSS, übertragen Sie sie anschließend zu zerlegen Gericht. </li><li> Trim übermäßigen Muskel-und Bindegewebe um das Auge herum </li><li> Mit 27G Nadeln sichern (Pin auf Silizium-Basis) in den Augen seziert Gericht passen sie in einer Weise, wo Hornhaut nach oben zeigt. </li><li> Mit Sideport Messer machen Schnitt unterhalb Hornhaut, wo Rundschnitt beginnt </li><li> Mit Iris Schere machen um das Auge herum geschnitten, dann mit derselben Schere durch Glaskörper schneiden und heben vorderen Teil des Auges entfernt. Hinweis: in den Schritten 3 bis 8 vermeiden übermäßige mechanische Druck auf Augapfel. </li><li> Transfer offenen Auges in Dispase-Lösung (hergestellt in Schritt 1) </li><li> Inkubieren Augenmuschel für 40-60 Minuten bei 37 ° C mit 5% CO 2 </li><li> Ersetzen HBSS-Lösung in Sezieren Schüssel mit frischem eins. </li><li> Transfer-Auge von Dispase Lösung Sezieren Gericht. </li><li> Position Auge in Petrischale (Augapfel Tasse nach oben) und mit zwei 27G Nadeln. </li><li> Heben teilweise getrennt Netzhaut und mit Retina-Schere Netzhaut weg von den Sehnerv. Discard Netzhaut. </li><li> Mit Iris Schere machen einen Einschnitt von der Peripherie des Auges in Richtung des Sehnervs. </li><li> Mit allen fünf 27G Nadeln flach Auge macht RPE Schicht schön gestreckt. </li><li> Mit der Netzhaut Schere machen kreisförmigen Schnitt um Sehnerv Trennung RPE-Schicht von der Bindung an Sehnerv. Hinweis: Schritte 13-17 können mit geringer Vergrößerung oder ohne Stereo-Mikroskop durchgeführt werden </li><li> Passen Stereomikroskop 250x Vergrößerungoder mehr und finden Rand des RPE Blatt in der Nähe des Sehnervs entlang der Schnittlinie von Iris Schere gemacht. </li><li> Mit zwei Zangen separaten RPE-Bruch-Membran von der Aderhaut Gewebeschicht. Sie kann verlangen, ein paar Versuche, entlang der Kante, wo die Verbindung von RPE und Aderhaut am schwächsten ist zu finden. </li><li> Legen Sie RPE Blatt in kaltes Trypsin-EDTA-Lösung in 15 ml-Röhrchen </li><li> Nach dem RPE, Kappe und Transfer Rohre mit Gewebe in Trypsin-EDTA in Wasserbad für 10-15min gesammelt werden, bei 37 ° C. </li><li> Nach 10 min Inkubation, kräftig schütteln 15 ml Röhrchen RPE in kleinen Gruppen zu trennen. Wenn die Trennung nicht vollständig ist, statt Röhren wieder in Wasserbad für weitere 5 Minuten. </li><li> Überprüfen Sie die Rohre für möglich un-gelösten gemischt Zellhaufen. Jeder beobachtet Clustern sollten entfernt mit feinen Spitzen Glas Pasteurpipette werden. </li><li> Spin down (1,4 Umdrehungen pro Minute auf klinischen Zentrifuge für 4 min) hfRPE Zellen zu entfernen Überstand und resuspendieren Zellen in 15% RPE Medien (9 mL insgesamt) </li><li> Legen Sie 3 ml Zellsuspension in Primaria Flaschen 2 mL frisches 15% RPE Medien, statt Kolben in Inkubator bis zum nächsten Tag (37 ° C, 5% CO 2) </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Funktionelle Validierung von hfRPE Zellkultur In früheren Experimenten haben wir diese primären Kulturen verwendet, um den Ausdruck, Polarisation und Funktion der Plasmamembran Transportproteine ​​ermitteln und die spezifische Signalwege, die RPE-Funktion zu regulieren 1-11 Diese Eigenschaften, wie sie gesammelt sind, stellen eine Validierung von Eigenschaften, die angewendet werden können zu jeder Zelle Generation. Die Experimente im Folgenden zusammengefasst identifizieren die Proteine, die transepithelialen Transport von Flüssigkeiten und die Integrität des parazellulären Weg zu bestimmen. Diese in-vitro-Experimente wurden in einem Tiermodell der Netzhaut wieder Wiederbefestigung 6 wurde bestätigt. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Lokalisierung von CFTR in hfRPE Zellen Left oberen Platte:. CFTR wurde in hfRPE Zellen mit Membran-angereicherten Extrakten nachgewiesen. M, Molekulargewichtsmarker, Spur 1, große reifen (Band C) und unreife (Bänder A und B) Center unten: Immunfluoreszenz Lokalisation von CFTR (grünes Etikett) Top rechte Tafel: vergrößerte Querschnittsansicht durch die z-Ebene zeigen.. Maximum-Intensitäts-Projektion durch die z-Achse. ZO-1 (gekennzeichnet als rot) dient als Tight Junction-Marker Abgrenzung apikalen und basolateralen Seiten des RPE. DAPI (blau) beschriftet die Kerne in der Nähe der Basalmembran. ZO-1 wird als gelb / orange, seit seiner roten Etikett Überschneidungen grüne Fluoreszenz von CFTR. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. IFNy-induzierten physiologischen Veränderungen in hfRPE A:. Zugabe von IFN &amp;ggr; auf die basale Bad erhöhten transepithelialen Transport von Flüssigkeiten (J v) über Monoschicht von primären, kultivierten Zellen hfRPE J v als Funktion der Zeit in der oberen Kurve und Netto-Flüssigkeit aufgetragen. Absorption (apikal basal Bad) ist durch positive Werte angegeben; transepithelialen Potenzial (TEP) und Gesamt-Widerstand des Gewebes (R T) als Funktion der Zeit in der unteren Spuren gezeichnet. B: Zugabe von CFTRinh-172 (5 pM), um die basale Bad hemmte die IFNy-stimulierte J v erhöhen. Unten ist ein Beispiel für Tiermodell Experimente bestätigt hfRPE in vitro-Befunde. In diesem Experiment wurde künstlich geschaffen Netzhautablösung deutlich nach Zugabe von IFNg nach außen Augenoberfläche (Abbildung 4 A, B) reduziert. Dieser Effekt kann teilweise durch blockiert werden: (1) Zugabe von cAMP-Blocker (Abbildung 4D), (2) vollständig nach Zugabe von JAK + cAMP-Blocker blockiert. Bilder unten sind unter Verwendung Oktober Scanner. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. In vivo Netzhautablösung Experimente. Die Verfahren für diese in vivo Experimente wurden bereits im Detail 6 beschrieben. In diesen Experimenten wurden Netzhautablösungen in Ratte Auge durch Injektion von 0,5-3 ul modifizierter PBS-Lösung in den subretinalen Raum (SRS), allein oder mit einer Kombination von JAK-STAT-und PKA-Inhibitoren geschaffen. Jedes Experiment hatte eine erste Kontrolle Zeitraum von 40-70 min nach der Erstellung der Netzhautablösung. Während dieser Zeit war die Änderungsrate der Blase Volumen gemessen, um bleb Stabilität zu gewährleisten. Optische Kohärenz Tomographie (Institut für Angewandte Physik der Russischen Akademie der Wissenschaften, Nischni Nowgorod, Russland) wurde verwendet, um den zeitlichen Verlauf der Änderung der Lautstärke in SRS messen. Der zeitliche Verlauf der re-attachment volume Änderung wurde durch die optische Kohärenztomographie (OCT) gemessen. OCT-Bilder aus 4 verschiedenen Experimenten (Platten auf der linken Seite; AD), dass eine Veränderung in Ablösung Größen zeigen (Pfeile in A, B und D) nach der Zugabe von IFN &amp;ggr; an der vorderen Fläche für 40-70 min. Die Abbildungen A und B zeigen, dass IFNy Jv erhöhte sich von seiner Kontrolle Rate (≈ 2 ul • cm 2 • h -1), um 14 und 12 ul • cm 2 • h-1 bzw.. Nach Zugabe von JAK-STAT Signalweg und PKA-Inhibitoren (C und D), die IFNy - induzierte Absorption lagen deutlich auf 0,2 und 7,9 reduziert ul • cm 2 • h-1 bzw.. Die Pfeile zeigen die Grenze der Blase zum Vergleich mit dem Bereich innerhalb der gestrichelten Linie umgeben, (ab Band). Rechten Seite von Abbildung: top panel-Zusammenfassung der gemessenen Jv Raten von mehreren Experimenten, Mitteltafel-Film ( <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2032/Bleb%205.wmv">hier klicken</a> ); unteren Panel-3D Abschnitte des Experiments in B. Pseudofarben in blau zusammengefasst zeigt die räumliche Ausdehnung der Ablösung zum Zeitpunkt t = 0 und 40 min nach der Zugabe von INFγ. Alle Tierexperimente wurden in Übereinstimmung mit der Association for Research in Vision and Ophthalmology Aussage durchgeführt. Das Protokoll wurde von der Animal Care und Verwenden des Ausschusses der National Institutes of Health zugelassen.

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</ol>

In den vorliegenden Experimenten beschreiben wir zusätzliche Änderungen unserer bereits veröffentlichten Techniken 3 ausgelegt, mehrere Schritte notwendig, um konsistente hfRPE primären Kulturen mit einer höheren Anzahl von verfügbaren Zellen pro Auge produzieren zu rationalisieren. Jede Änderung in der ursprünglichen Verfahren wurde rigoros in mehreren Physiologie und Molekularbiologie Experimenten getestet, um sicherzustellen, dass die Änderungen nicht vorstellen Artefakte und wird ständig von vielen anderen Labors die Verwendung dieser Zellen getestet. Schließlich wurden weitere Experimente die In-vitro-Ergebnisse auf ähnliche Störungen vergleichen in Tiermodellen durchgeführt.

Instruments benötigt für die Präparation Protokoll <ol><li> Stereo-Mikroskop - jeder mit arbeiten Vergrößerung x250 für die Präparation benötigt </li><li> Dissecting Gericht - zB Kimble 100 x 20 mm # 23062 (eine pro-Dissektion) jeder beliebigen Quelle </li><li> Sylgard 184 - WPI Cat. # SYLG184 * * Zur Vorbereitung Sezieren Gericht folgen Sylgard 184 enthalten Mischanleitung, pour gemischte Flüssigkeit Elastomer in Petrischale bis 5-8mm bilden. Lassen Elastomer für mindestens 24 Stunden aushärten. Dish mit ausgehärteten Elastomeren kann sterilisiert mit 70% Ethanol und wieder verwendet werden können (~ 100 mal) </li><li> 27 G Nadeln von BD PrecissionGlide 1 ¼ Länge (5 pro Sektion) einer beliebigen Quelle </li><li> HBSS 1X Lösung mit Ca und Mg-Salze - GIBCO Cat # 14025 500ml (gut für mehrere Sektionen). </li><li> Iris Schere Hartmetall Wellenschliff, gebogen - FST Cat # 14559-11 (eins). </li><li> Retinal Schere - Katena Cat # K4-5300 (eins). </li><li> Pinzetten - z. B. Dumont Pinzette # 5 mit polierten Tipps von WPI Cat # 500085 (2 Stück). </li><li> Sideport Messer - Alcon, Clearcut 1mm, Dual Bevel, abgewinkelt Cat # 8065921540. </li><li> Zentrifugenröhrchen 15ml - (einer pro Auge) einer beliebigen Quelle </li><li> Pasteur Glaspipette - (einer pro-Dissektion) jeder beliebigen Quelle </li><li> Die Platte 12 auch (einer pro-Dissektion) jeder beliebigen Quelle </li><li> Primaria 25cm 2-Kolben - (2-3 pro Auge) einer beliebigen Quelle </li></ol>

experimentelle modelle für das studium der retinalen pigmentepithelzellen physiologie und pathophysiologie

 Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

Wir haben eine Zellkultur Verfahren, das große Mengen an konfluente Monolayer von primären humanen fötalen retinalen Pigmentepithels (hfRPE) Kulturen mit morphologischen, physiologischen und genetischen Eigenschaften des nativen humanen RPE produzieren kann entwickelt. Diese hfRPE Zellkulturen weisen schwere Pigmentierung und Elektronenmikroskopie zeigen umfangreiche apikalen Membran Mikrovilli. Die junctional Komplexe wurden mit Immunfluoreszenz Kennzeichnung von verschiedenen Tight Junction-Proteine ​​identifiziert. Epitheliale Polarität und Funktion dieser leicht reproduzierbar primären Kulturen ähneln zuvor Säugetieren Modelle von nativen RPE, einschließlich der menschlichen untersucht. Diese Ergebnisse wurden durch die Entwicklung von therapeutischen Interventionen in mehreren Tiermodellen für menschliche Auge Krankheit verlängert. Wir haben uns auf Strategien zur Beseitigung von abnormalen Flüssigkeitsansammlung in der Netzhaut oder subretinalen Raum konzentriert. Die extrazelluläre subretinalen Raum trennt die Photorezeptor äußeren Segmente und der apikalen Membran des RPE und ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Netzhaut-Anhänge und eine ganze Reihe von RPE / Netzhaut-Interaktionen.

Wir bieten eine reproduzierbare Methode zur Kultivierung konfluente Monolayer von menschlichen fetalen retinalen Pigmentepithelzellen (hfRPE) Zellen, die Morphologie, Physiologie, Polarität und Protein-und Genexpression von adulten nativen Gewebe aufweisen. Diese Arbeit hat zu einem Tiermodell verschiedener Augenerkrankungen erweitert worden.

Experimentelle Modelle für das Studium der retinalen Pigmentepithelzellen Physiologie und Pathophysiologie

Wir haben ein Zellkulturverfahren entwickelt, mit dem große Mengen konfluenter Monolagen aus primären menschlichen fetalen retinalen Pigmentepithelzellen gewonnen werden können ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Kulturen menschlichen fetalen Retinapigments, Epithels oder RPE zu erzeugen, die als Modell verwendet werden können. Bei Untersuchungen von Erkrankungen des menschlichen Auges werden Gewebe von Spendern als intakte Augäpfel erhalten. Der erste Schritt des Verfahrens besteht darin, überschüssige Muskulatur und Bindegewebe zu entfernen und das Auge anschließend zu öffnen, indem die Hornhaut und die Linse entfernt werden.Das Auge wird mit Dispa behandelt und abgeflacht, anschließend wird die RPE-Einzelschicht vom Choroidea-Disseziert abgel&ouml;st. RPE-Zellen werden in Kolben ausges&auml;t und mehrere Wochen lang kultiviert, bis sie konfluente Monolagen bilden und Pigment entwickeln. Die Zellkulturen werden in funktionellen In-vitro-Experimenten verwendet.Erfolgreiche In-vitro-Experimente werden an präklinischen Tierversuchsmodellen wiederholt, bei denen RPE-Antworten in komplexeren Signalumgebungen besser bewertet werden können. Das hier vorgestellte Modell wird zu einem besseren Verständnis der RPE-Physiologie und neuen therapeutischen Ansätzen zur Behandlung von Augenerkrankungen führen. Hallo, mein Name ist Sheldon Miller.Mein Labor befindet sich im National Eye Institute, das Teil der National Institutes of Health auf dem Bethesda-Maryland-Campus ist. Hallo, ich bin Arki vom Miller-Labor. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Herstellung primärer Kulturen menschlicher fetaler retinaler Pigmentepithelzellen.Diese Zellen werden als konfluente Monolagen vorbereitet, die in modifizierten Ussing-Kammern montiert werden können. Wir verwenden diese isolierten humanen Pigmentepithelzellen außerdem für biochemische und genetische Untersuchungen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um Primärkulturen von Epithelzellen anzulegen, um die Funktion und Regulation physiologischer und pathophysiologischer Prozesse zu untersuchen und klinische Tiermodelle von Krankheiten zu entwickeln.Wir konzentrieren uns auf das retinale Pigmentepithel (RPE), das sich im hinteren Teil des Auges befindet und Netzhaut und choroidale Blutversorgung voneinander trennt. Diese schematische Darstellung des Auges zeigt die Lage des RPE-Blättchens im hinteren Augenabschnitt direkt neben den Photorezeptoren. Die Einlage zeigt die Zellen der Netzhaut mit den Photorezeptoren rechts und den Ganglienzellen links.Dieses Epithel ist metabolisch äußerst aktiv. Es phagozytiert kontinuierlich auf tageszeitlichem Rhythmus die Photorezeptoren und speichert, verarbeitet sowie transportiert das Sehpigment Vitamin A zu den Photorezeptoren. Im visuellen Zyklus wirkt es homöostatisch, um die chemische Zusammensetzung und das Volumen der umgebenden extrazellulären Räume aufrechtzuerhalten.Eine entscheidende Eigenschaft von Epithelien ist ihre Polarität. Die kontinuierliche asymmetrische Verteilung von Proteinen zu den apikalen und basolateralen Membranen ist ein regulierter Prozess, der es dem Epithel ermöglicht, den gerichteten Transport von Metaboliten, Ionen und Flüssigkeit von einem extrazellulären Raum zum anderen durchzuführen. Diese Aktivität hilft dem Epithel, die Gesundheit und Integrität der neuralen Netzhaut aufrechtzuerhalten.Die hier beschriebene In-vitro-Präparation ermöglicht die Analyse von Transportproteinen, Rezeptoren und Signalwegen, die die epitheliale Polarität und Funktion bestimmen, bevor mit der Dissektion begonnen wird. Bereiten Sie eine 12-Loch-Platte in einer laminarer Luftstromwerkbank mit Lösungen bei Raumtemperatur vor. Jedes Auge benötigt ein Loch mit 10× Antibiotikum-Antimykotikum-Lösung, zwei Löcher mit 1× PBS und ein Loch mit zwei Einheiten pro Milliliter Disc-Raum, verdünnt in 5 % RPE-Medium mit Serum. Füllen Sie eine silikonbeschichtete Dissektionschale mit 1× H-B-S-S, lassen Sie die Flüssigkeit ab und überführen Sie jedes Auge in ein Loch mit Antibiotikum-Antimykotikum-Lösung.Je nach Raumtemperatur drei bis fünf Minuten inkubieren. Vermeiden Sie jeglichen übermäßigen Druck auf den Augapfel. Spülen Sie das Auge in zwei aufeinanderfolgenden Mulden mit jeweils 1 × PBS, um überschüssiges Antibiotikum zu entfernen.Verwenden Sie dann eine Pinzette, um das Präparat unter einem Stereomikroskop in eine Petrischale mit 1× H-B-S-S zu überführen. Entfernen Sie mit Iris-Scheren überschüssige Muskulatur und Bindegewebe um das Auge herum. Richten Sie das Auge so aus, dass die Hornhaut nach oben zeigt.Verwenden Sie zwei sterile 27-Gauge-Nadeln, um das Auge durch das Bindegewebe, ohne die Sklera zu beschädigen, auf der Silikonunterlage zu fixieren. Verwenden Sie in dieser Position ein Seitenportmesser, um einen Schnitt durch die Sklera durchzuführen. Der Schnitt sollte ein Drittel der Distanz vom Augenäquator zur vorderen Augenfläche entfernt liegen.Verwenden Sie Iris-Scheren, um den Schnitt kreisförmig um das Auge herum fortzusetzen, um Schäden am retinalen Pigmentepithel (RPE) durch die Anziehung des Glaskörpers auf die Retina zu vermeiden. Verwenden Sie dieselbe Schere, um durch den Glaskörper zu schneiden und die vordere Augenklappe vom Augenbecher zu trennen.Heben Sie den vorderen Teil des IOA an und entsorgen Sie ihn. Verwenden Sie eine Pinzette, um das geöffnete Auge in die Vertiefung der Dys. zu überführen. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen im Auge befinden.Cup.30 bis 60 Minuten bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubieren. Übertragen Sie das Auge aus der Petrischale zurück in die Präparierschale, die mit frischer Raumtemperatur einge X-H-B-S-S gefüllt wurde. Positionieren Sie das Auge mit der Mulde nach oben und fixieren Sie es mit zwei Nadeln der Größe 27. Verwenden Sie unter dem Stereomikroskop feine Pinzetten, um die teilweise gelöste Netzhaut vorsichtig mit Netzhautschere anzuheben. Schneiden Sie die Netzhaut vom Sehnerv ab. Entsorgen Sie die Netzhaut mit der Irischere. Schneiden Sie vom Augenrand bis zum Sehnerv einen Einschnitt. Fixieren Sie das Auge mit fünf Nadeln der Größe 27 Gauge. Um die Pigmentepithelschicht zu dehnen, führen Sie mit einer retinalen Schere einen kreisförmigen Schnitt um den Sehnerv herum durch.Trennen Sie die RPE-Schicht, indem Sie auf eine Vergr&ouml;&szlig;erung von 250x oder mehr umstellen. Suchen Sie die Kante des RPE-Blattes entlang des Schnitts, der mit der Iris-Schere nahe am Sehnerv gemacht wurde. Verwenden Sie zwei Paar Pinzetten, um die RPE- und Bruch-Membran von der choroidalen Gewebeschicht zu l&ouml;sen.Probieren Sie mehrere Stellen entlang der Schnittkante aus, um die Stelle zu finden, an der die Verbindung zwischen dem retinalen Pigmentepithel (RPE) und der Aderhaut am schwächsten ist. Lösen Sie die Membran vorsichtig ab, um sie vollständig zu entfernen. Geben Sie die RPE-Blätter in ein 15-Milliliter-Konischglas, das mit Raumtemperatur-Trips in EDTA gefüllt ist.Wenn alle Scheiben gesammelt sind, verschließen Sie das Röhrchen und inkubieren Sie die Röhrchen 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Wasserbad. Schütteln Sie das Röhrchen kräftig, um das retinale Pigmentepithel in kleine Zellhaufen zu zerlegen. Keine dunklen Zellklumpen bedeuten, dass die Trennung abgeschlossen ist.Bringen Sie das Röhrchen für weitere fünf Minuten in das Wasserbad zurück. Entfernen Sie mithilfe eines Pasteurspipetten und sanften Saugens alle unverdauten Gewebestücke. Zentrifugieren Sie die Zellen vier Minuten lang bei 280 ×g.Entfernen Sie den Überstand. Füllen Sie das Endvolumen mit 15 % RPE-Medium auf neun Milliliter auf und pipettieren Sie, um den Pellet aufzususpenderen. Pipettieren Sie drei Milliliter der Zellsuspension in einen 25 cm²-Flaschenkolben.Geben Sie zwei Milliliter frisches, auf Raumtemperatur abgekühltes Kulturmedium mit 15 % RPE hinzu. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Während die Kulturen reifen, nimmt ihre Pigmentierung nach drei bis vier Wochen zu.Erfolgreiche Kulturen sind konfluent und gleichmäßig intensiv pigmentiert. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man humane primäre Netzhautepithel-Kulturen aus fetalem Gewebe herstellt. Das war's.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur retinalen Pigmentepithels (RPE) Pigmentzellen aus menschlicher pluripotenter Stammzellen tragen Patienten abgeleitet Mutationen zu unterscheiden. Die mutierten Zelllinien können für Funktionsanalysen einschließlich Immunoblotting, Immunfluoreszenz und Patch-Clamp verwendet werden. Dieser Krankheit im Gericht Ansatz umgeht die Schwierigkeit, native menschlichen RPE-Zellen.

Differenzierung, Wartung und Analyse der menschlichen Retina Pigment Epithelzellen: eine Krankheit im Gericht-Modell für BEST1 Mutationen

Hier stellen wir eine Methode zur Aufzeichnung lichtevokierter elektrischer Reaktionen des retinalen Pigmentepithels (RPE) bei Mäusen vor, die eine Technik verwendet, die als DC-ERGs bekannt ist und von Marmorstein, Peachey und Kollegen in den frühen 2000er Jahren beschrieben wurde.

Direktgekoppeltes Elektroretinogramm (DC-ERG) zur Aufzeichnung der lichtbeschworenen elektrischen Reaktionen des retinalen Pigmentepithels der Maus

Dieses Protokoll, das ursprünglich von Fernandez-Godino et al. im Jahr 20161berichtet wurde, beschreibt eine Methode zur effizienten Isolierung und Kultur von Maus-RPE-Zellen, die innerhalb einer Woche auf Transwell-Platten eine funktionelle und polarisierte RPE-Monoschicht bilden. Das Verfahren dauert ca. 3 Stunden.

Effiziente Dissektion und Kultur der primären Maus retinalen Pigmentepithelzellen

Dieses Protokoll stellt und beschreibt Schritte zur Isolierung, Dissektion, Kultivierung und Färbung von Netzhautexplantaten, die aus einer erwachsenen Maus gewonnen wurden. Diese Methode ist als Ex-vivo-Modell für die Untersuchung verschiedener neurovaskulärer Netzhauterkrankungen wie der diabetischen Retinopathie von Vorteil.

Netzhautexplantat der adulten Mausnetzhaut als Ex-vivo-Modell zur Untersuchung neurovaskulärer Netzhauterkrankungen

Wir beschreiben eine Methode, um retinales Pigmentepithel (RPE) effizient von der Netzhaut im menschlichen Auge zu trennen und ganze RPE/Aderhaut-Flatmounts für histologische und morphometrische Analysen des RPE zu generieren.

Effiziente und konsistente Generierung von retinalen Pigmentepithel-/Aderhaut-Flatmounts aus dem menschlichen Auge für die histologische Analyse

Wir beschreiben eine einfache und effiziente Methode zur Isolierung von Zellen der retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) aus den Augen junger pigmentierter Meerschweinchen. Dieses Verfahren ermöglicht molekularbiologische Folgeuntersuchungen am isolierten RPE, einschließlich Genexpressionsanalysen.

Isolierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus Meerschweinchenaugen

Mausmodelle können nützliche Werkzeuge sein, um die Biologie des retinalen pigmentierten Epithels (RPE) zu untersuchen. Es wurde festgestellt, dass Mäuse eine Reihe von RPE-Pathologien entwickeln können. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Phänotypisierungsprotokoll zur Aufklärung und Quantifizierung von RPE-Pathologien in Mäusen mittels Licht-, Transmissionselektronen- und konfokaler Mikroskopie.

Ein Protokoll zur Bewertung und Quantifizierung von retinalen pigmentierten Epithelpathologien in Mausmodellen der altersbedingten Makuladegeneration

Degenerative Augenerkrankungen, die die retinale Pigmentepithelschicht des Auges betreffen, sind monogenen und polygenen Ursprungs. Mehrere Krankheitsmodelle und eine Softwareanwendung, LipidUNet, wurden entwickelt, um Krankheitsmechanismen sowie mögliche therapeutische Interventionen zu untersuchen.

LipidUNet-Machine-Learning-basierte Methode zur Charakterisierung und Quantifizierung von Lipidablagerungen unter Verwendung von iPSC-abgeleitetem retinalem Pigmentepithel

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Gewinnung und Kultivierung von primären retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) aus lokal gewonnenen Schweineaugen. Diese Zellen dienen als hochwertige Alternative zu Stammzellen und eignen sich für die In-vitro-Netzhautforschung .

Isolierung von primären retinalen Pigmentepithelzellen von Schweinen für die In-vitro-Modellierung

Das retinale Pigmentepithel (RPE) fungiert als entscheidende Barriere zwischen Aderhaut und Netzhaut und fördert die Gesundheit und Funktion von retinalen Zelltypen, wie z. B. Photorezeptoren. Darin beschreiben wir ein einfaches und effektives Protokoll zur Isolierung und Kultivierung adulter muriner RPE.

Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen

Lernen Sie die Kultur menschlicher fetaler retinaler Pigmentepithelzellen (hfRPE) als Modell zur Untersuchung von Augenerkrankungen. Diese Methode ermöglicht zuverlässige in-vitro-Studien und präklinische Forschung.

Experimentelle Modelle für das Studium der retinalen Pigmentepithelzellen Physiologie und Pathophysiologie

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