Experimentelle Modelle für das Studium der retinalen Pigmentepithelzellen Physiologie und Pathophysiologie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Kulturen von menschlichem fetalem Netzhautpigment, Epithel oder RPE zu erzeugen, die als Modell verwendet werden können. Bei der Untersuchung von Erkrankungen des menschlichen Auges werden Gewebe von Spendern als intakte Augenkugeln erhalten. Der erste Schritt des Eingriffs besteht darin, überschüssige Muskeln und Bindegewebe abzuschneiden und dann das Auge zu öffnen, indem die Hornhaut und die Linse entfernt werden.

Das Auge wird mit Dispa behandelt und abgeflacht, dann wird die RPE-Monoschicht von der Aderhaut abgezogen. Seziert. RPE werden in Kolben ausgesät und mehrere Wochen lang gezüchtet, bis sie konfluente Monoschichten erreichen und Pigmente entwickeln. Zellkulturen werden in in vitro funktionellen Experimenten eingesetzt.

Erfolgreiche In-vitro-Experimente werden in präklinischen Versuchstiermodellen wiederholt, in denen RPE-Antworten in komplexeren Signalumgebungen besser bewertet werden können. Das hier demonstrierte Modell wird zu einem besseren Verständnis der RPE-Physiologie und zu neuen therapeutischen Interventionen zur Behandlung von Augenerkrankungen führen. Hallo, mein Name ist Sheldon Miller.

Mein Labor befindet sich im National Eye Institute, das Teil der National Institutes of Health auf dem Bethesda Maryland Campus ist. Hallo, ich bin Arki von Miller Lab. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Herstellung von Primärkulturen von humanen fetalen retinalen Pigmentepithelzellen.

Diese Zellen werden als konfluente Monoschichten präpariert, die in modifizierten Singkammern montiert werden können. Wir werden diese isolierten menschlichen RPE-Zellen auch für Studien in der Biochemie und Genetik verwenden. Mit diesem Verfahren etablieren wir in unserem Labor Primärkulturen von Epithelzellen, um die Funktion und Regulation physiologischer und pathophysiologischer Prozesse zu untersuchen und ein klinisches Tiermodell für Krankheiten zu entwickeln.

Wir konzentrieren uns auf das retinale Pigmentepithel oder RPE, das im hinteren Teil des Auges sitzt und die neuronale Netzhaut und die Aderhautblutversorgung trennt. Dieses schematische Diagramm des Auges zeigt die Position des RPE-Blattes im hinteren Teil des Auges, direkt neben den Photorezeptoren. Der Einsatz zeigt die Zellen der Netzhaut mit den Photorezeptoren auf der rechten Seite und den Ganglienzellen auf der linken Seite.

Dieses Epithel ist metabolisch äußerst aktiv. Es phagozytose-Photorezeptoren kontinuierlich auf Tagesbasis, und es speichert Reis, miziert und transportiert das visuelle Pigment Vitamin A zu den Photorezeptoren. Im visuellen Zyklus wirkt es homöostatisch, um die chemische Zusammensetzung und das Volumen der umgebenden extrazellulären Räume zu erhalten.

Eine entscheidende Eigenschaft von Epithelen ist ihre Polarität. Die fortlaufende asymmetrische Abgabe von Proteinen an die apikale und basale laterale Membran ist ein regulierter Prozess, der es dem Epithel ermöglicht, den vektoriellen Transport von Metaboliten, Ionen und Flüssigkeit von einem extrazellulären Raum in einen anderen durchzuführen. Diese Aktivität trägt dazu bei, dass das Epithel die Gesundheit und Integrität der neuronalen Netzhaut erhält.

Das hier beschriebene In-vitro-Präparat ermöglicht die Analyse von Transportproteinen, Rezeptoren und Signalwegen, die die Polarität und Funktion des Epithels bestimmen, bevor mit der Dissektion begonnen wird. Bereiten Sie eine 12-Well-Platte in einer Laminar-Flow-Haube mit Lösungen bei Raumtemperatur vor. Jedes Auge benötigt eine Vertiefung mit 10 x antibiotischer antimykotischer Lösung, zwei Vertiefungen mit einem XPBS und eine Vertiefung mit zwei Einheiten pro Milliliter Scheibenraum, verdünnt in 5%igem RPE-Medium mit Serum. Füllen Sie eine mit Silikon gepolsterte Präparierschale mit einem X-H-B-S-S, lassen Sie die Flüssigkeit ab und geben Sie jedes Auge in eine Vertiefung mit antibiotischer antimykotischer Lösung.

Drei bis fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Vermeiden Sie es, übermäßigen Druck auf den Augapfel auszuüben. Spülen Sie das Auge in zwei aufeinanderfolgenden Vertiefungen mit einem XPBS, um überschüssiges Antibiotikum zu entfernen.

Dann wird es mit einer Pinzette in die mit einem X-H-B-S-S gefüllte Präparierschale unter einem Präparierstereomikroskop übertragen. Verwenden Sie eine Irisschere, um überschüssige Muskeln und Bindegewebe um das Auge herum zu entfernen. Richten Sie das Auge so aus, dass die Hornhaut nach oben zeigt.

Verwenden Sie zwei sterile 27-Gauge-Nadeln, um das Auge mit dem Bindegewebe zu fixieren, ohne die Sklera an das Silikonpad zu beschädigen. Verwenden Sie in dieser Ausrichtung ein Messer mit seitlichem Port, um einen Schnitt durch die Sklera zu machen. Der Schnitt sollte ein Drittel des Abstands vom Äquator des Auges bis zur vorderen Fläche betragen.

Verwenden Sie eine Irisschere, um den Schnitt kreisförmig um das Auge herum fortzusetzen, um Schäden am Netzhautpigment zu vermeiden. Epithel, abgekürzt RPE durch glasartige Retina-Anziehung. Verwende die gleiche Schere, um den Glaskörper zu durchtrennen, um die vordere Augenklappe von der Augenmuschel zu trennen.

Heben Sie den vorderen Teil des IOA an und entsorgen Sie ihn. Benutze eine Pinzette, um das offene Auge in die Vertiefung von dys zu übertragen. Achte darauf, dass sich keine Luftblasen im Auge befinden. Tasse.

40 bis 60 Minuten bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubieren. Übertragen Sie das Auge aus dem Disspace zurück in die Präparierstale, die mit frischem Raumklima befüllt wurde. Positionieren Sie das Loch mit dem Becher nach oben und befestigen Sie es mit 2 Nadeln der Stärke 27.

Unter dem Präpariermikroskop wird die teilweise getrennte Netzhaut mit einer Netzhautschere mit einer feinen Pinzette sanft angehoben. Schneide die Netzhaut vom Sehnerv weg. Entsorgen Sie die Netzhaut mit der Irisschere.

Machen Sie einen Schnitt von der Peripherie des Auges zum Sehnerv. Stecke das Öhr mit 5 Nadeln im Kaliber 27 fest. Um die RPE-Schicht zu dehnen, machen Sie mit einer Netzhautschere einen kreisförmigen Schnitt um den Sehnerv.

Trennen der RPE-Schicht Umschalten auf 250-fache Vergrößerung oder mehr. Finde die Kante des RPE-Blattes entlang des Schnitts mit der Irisschere und in der Nähe des Sehnervs. Verwenden Sie zwei Pinzettenpaare, um die RPE- und Brus-Membran von der Aderhautgewebsschicht zu trennen.

Probieren Sie mehrere Bereiche entlang der Schnittkante aus, um herauszufinden, wo die Verbindung zwischen RPE und Aderhaut am schwächsten ist. Ziehen Sie die Membran vorsichtig zurück, um sie vollständig zu entfernen. Legen Sie die RPE-Blätter in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen, das mit EDTA-Trips bei Raumtemperatur gefüllt ist.

Wenn alle Blätter gesammelt sind, verschließen Sie das Röhrchen und inkubieren Sie die Röhrchen 10 Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Schütteln Sie das Röhrchen kräftig, um das RPE in kleine Cluster zu teilen. Keine Klumpen der dunklen Zellen bedeuten, dass die Trennung vollständig ist.

Stellen Sie die Tube für weitere fünf Minuten wieder in das Wasserbad. Verwenden Sie einen Teiger, eine Pipette und ein sanftes Absaugen, um unverdaute Gewebereste zu entfernen. Schleudern Sie die Zellen in einer Zentrifuge bei 280 5G für vier Minuten.

Entfernen Sie den Überstand. Erhöhen Sie das Endvolumen auf neun Milliliter mit einer 15 %igen RPE-Mediumpipette zum Resuspendieren. Die Zellen pipettieren drei Milliliter der Zellsuspension in einen 25 Zentimeter großen quadratischen Kolben.

Fügen Sie zwei Milliliter frische Raumtemperatur mit 15 % RPE-Mittelkultur hinzu. Die Zellen übernachten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Wenn die Kulturen reifen, nimmt ihre Pigmentierung nach drei bis vier Wochen zu.

Erfolgreiche Kulturen sind konfluent und gleichmäßig intensiv pigmentiert. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie humane fetale RP-Primärkulturen vorbereiten können. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.