Sphere Formation Assay: Eine In-vitro-Methode zur Identifizierung von Stammzellen von Bauchspeicheldrüsenkrebs und Screening-Therapien

- Das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC) enthält eine Untergruppe von ausschließlich tumorigenen Krebsstammzellen (CSC). CSCs sind selbsterneuerbar, pluripotent und in der Lage, Tumore zu bilden. Sie exprimieren anti-apoptotische Proteine und enthalten auch multiresistente Gene, die sie resistent gegen Chemotherapie machen. Um Krebsstammzellen zu identifizieren und die Wirkung von Medikamenten auf sie zu untersuchen, führen wir einen Kugelbildungsassay durch.

Suspendieren Sie zunächst die extrahierten Krebsstammzellen in dem gewünschten Zellkulturmedium. Als nächstes säen Sie die Zellsuspension in eine Multiwell-Platte und inkubieren Sie sie für die gewünschte Dauer. Geben Sie eine erforderliche Menge des interessierenden Medikaments in einige Vertiefungen und ein Placebo in andere Vertiefungen als Negativkontrolle. Inkubieren Sie die Zellen für die gewünschte Dauer. Krebsstammzellen bilden kugelförmige Kolonien in einer nicht adhärenten Kulturumgebung.

Nach der Inkubation pipettieren Sie eine kleine Menge Zellsuspension auf ein Hämozytometer und geben Sie sie in einen automatisierten Zellzähler. Zählen Sie nun die Anzahl der gebildeten Kugeln. Die medikamentös behandelten Zellen zeigen in der Regel eine deutliche Verringerung der Größe und Anzahl der Kugeln. Im folgenden Protokoll werden wir einen Kugelbildungsassay durchführen, um Stammzellen von Bauchspeicheldrüsenkrebs zu identifizieren und die Wirkung von Metformin zu bewerten.

- Um die Bildung der Tumorsphäre für die Anreicherung von Krebsstammzellen zu erleichtern, verdünnen Sie die Zellen in dem entsprechenden Volumen des Krebsstammzellmediums auf eine Endkonzentration von 2 mal 10 bis 3 Zellen pro Milliliter und kühlen Sie sie einige Minuten lang auf Eis. Nachdem Sie 500 Mikroliter PBS in die erste und letzte Reihe einer 24 Zellplatten mit extrem niedriger Bindung gegeben haben, resuspendieren Sie die Zellen durch Pipettieren und säen Sie 1 Milliliter Zellen pro Vertiefung in die leeren Vertiefungen der Platte.

Behandeln Sie vier Zellvertiefungen mit dem interessierenden Arzneimittel und mindestens vier Negativkontrollvertiefungen mit Vehikel. Dann inkubieren Sie die Zellen eine Woche lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Geben Sie jeden zweiten Tag eine frische Behandlung oder ein Vehikel in jede der Vertiefungen.

Bestimmen Sie am 5. oder 7. Tag die Anzahl der gebildeten Tumorkugeln mit einem automatisierten Zellzähler, der die Identifizierung größerer Strukturen ermöglicht. Für die serielle Passage der Tumorkugeln wird am 7. Tag ein 40-Mikrometer-Zellsieb verwendet, um die Kugeln zu entnehmen. Als nächstes drehen Sie die Kugeln herunter und inkubieren sie 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in 1 Milliliter Trypsin, um das Pellet in eine einzellige Suspension zu dissoziieren. Expandieren Sie dann die Zellen für weitere sieben Tage, wie gerade gezeigt.