Name: Fate Mapping von humanen embryonalen Stammzellen durch Teratom Formation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-01T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Erfahren Sie die in vivo Differenzierung humaner embryonaler Stammzellen durch Nierenkapsel-Transplantation bei immunsupprimierten Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Analyse gewebespezifischer Zellschicksale mittels Teratom-Bildung und Immunhistochemie.

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Diese Arbeit wurde durch ein umfassendes Research Grant aus dem California Institute for Regenerative Medicine (RC1-00104), eine Public Health Service Grant (HL085377) aus NHLBI, und ein Geschenk aus dem Pollin-Stiftung unterstützt HSB

Die schriftliche Protokoll unten auf der veröffentlichten Parametern von den Autoren berichteten, mit einigen Änderungen auf. Das Protokoll ist mit der Genehmigung durch die UCSF Institutional Animal Care und Use (IACUC) und Stammzellforschung Oversight (scro) Ausschüsse durchgeführt. I. Kultur von humanen embryonalen Stammzellen (hES) <ol><li> Wachsen hESCs in Standard-6-well (3,5 cm Durchmesser Brunnen)-Platten. </li><li> Mindestens 12 Stunden vor der Passage Zellen, Samen embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF, erhalten ab CF1 Tag E12.5 timed-gepaart Mäuse, bei 1000 Ci bestrahlt) Feeder-Zellen auf Platten mit 1% Gelatine (6,7) beschichtet. MEFs sollte bei 50-60% Konfluenz oder 4 beschichtet werden x 10 5 Zellen pro 3,5 cm Durchmesser gut (Abbildung 1). </li><li> Passage-Zellen, wenn Kolonien haben ~ 70% Konfluenz (Abbildung 2) erreicht. </li><li> Um Passage der Zellen, absaugen KSR Wachstumsmedium (6) aus den Vertiefungen und ersetzen mit 0,5 ml Medium mit Collagenase IV in KSR bei einer Konzentration von 1 mg / ml. </li><li> Die Platten mit Collagenase IV bei 37 ° C / 5% CO 2 für 5 Minuten oder bis Rändern der Kolonien beginnen, von der Platte zu heben. </li><li> Entfernen Collagenase IV von der Platte, 0,5 ml KSR in jede Vertiefung und manuell kratzen Zellen vollständig von der Platte zu entfernen. </li><li> Sammeln Sie die Zellsuspension aus jeder Vertiefung, in einem 15 ml konischen Rohr, und erlauben Zellen durch die Schwerkraft für 5 Minuten ruhen lassen. </li><li> Entfernen Sie den Überstand aus der Röhre, so dass die Zellen und Medium in einem Gesamtvolumen von ~ 300μl. </li><li> Mit einem 200 ul Mikro-Pipette eingestellt bei voller Lautstärke, sanft Pipette die Zellsuspension 5-6 mal die Auflösung der Kolonien. </li><li> Bringen Sie die Zellsuspension auf ein Gesamtvolumen von 9 ml pro Original gut von Zellen mit KSR Medium (dh, wenn man gut ist, geerntet werden, sollte das Röhrchen 9 ml enthalten). Supplement das Medium mit rekombinanten humanen basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) auf eine Konzentration von 12,5 ng / ml. </li><li> Nach dem Waschen der neue Brunnen mit MEF-Zellen (siehe Punkt 2) mit Dulbecco-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (DPBS), um alle Serum zu entfernen, 3 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Ändern KSR Medium mit bFGF 24 Stunden nach dem Durchgang, und jeder 24-48 Stunden, bis die Zellen bereit, wieder passagiert werden. </li></ol> II. Vorbereitung der hESC Pellet für die Transplantation <ol><li> Nach 24 Stunden vor der Transplantation, fügen ROCK-Inhibitor, die KSR Medium bis zu einer Endkonzentration von 10 um, um die Lebensfähigkeit der Zellen (8) zu erhöhen. Ein gut von Zellen bei ~ 70% Konfluenz (5 x 10 5 Zellen) erzeugt zwei Pellets, mit zwei Pellets pro Nierenkapsel eingefügt. </li><li> Zur Vorbereitung Zellpellets für die Transplantation (9), inkubieren ROCK-Inhibitor-behandelten Kulturen mit Collagenase IV für 5 Minuten bei 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Saugen Sie die Collagenase IV aus dem Brunnen und ersetzen mit 1 ml DPBS mit 10% Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep). </li><li> Manuelles kratzen die Kolonien von der Platte, spülen Sie die auch mit einer zusätzlichen 1 ml DPBS mit Pen / Strep, und übertragen jeweils 1ml Aliquot der Zellsuspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Spin Mikrozentrifugenröhrchen kurz bei 8.000 x g, saugen Sie den Überstand und resuspendieren die Pellets in 500μl DPBS mit Pen / Strep. </li><li> Um binden die Zellen für die Transplantation zusammen, fügen Sie 100 &amp;mgr; 1 mg / ml Phaseolus vulgaris Lectin (PHA) in DPBS in jedes Röhrchen. </li><li> Inkubieren der Zelle / PHA-Suspension bei Raumtemperatur für 5 Minuten, dann für 2 Minuten bei 8.000 x g Spin. Drehen der Rohre um 180 ° in ihrem Rotor Brunnen und Spin wieder für 2 Minuten bei 8.000 x g. </li><li> Vorsichtig absaugen Überstand Verlassen des Pellet intakt. </li><li> Verdrängen die Zellpellets aus den Röhrchen durch vorsichtiges Pipettieren 200 ul KSR neben dem Rand des Pellet, bis sie hebt langsam. </li><li> Sobald verdrängt, sofort in den Pellets zu 0.4μm Millicell Einsätze in 3,5 cm Durchmesser Brunnen mit 3 ml KSR gelegt, und inkubieren für 2 Stunden bis über Nacht bei 37 ° C / 5% CO 2. </li></ol> III. Nierenkapsel Pfropfen <ol><li> Führen Sie alle tierischen Verfahren in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts unter angemessenen aseptischen Bedingungen. </li><li> Anesthetize SCID beige Mäusen (CB17.Cg-Prkdc scid Lyst bg / CRL), im Alter von 8-12 Wochen, mit einer Kombination von inhalativen 3% isoflurane/0.5% O2 und intraperitonealer Tribromethanol (Avertin, 25 mg / kg frisch zubereitet). Zwei Zellpellets pro Maus eingepflanzt Verwendung beschriebenen Techniken (10) werden. </li><li> Nach der Platzierung der Maus auf ein Heizkissen, um eine Unterkühlung zu verhindern, rasieren Bereich des Einschnitts, dann desinfizieren mit Chlorhexidin. Machen Sie einen 2,5 cm Schnitt durch die Haut nur aus der Mitte, sondern parallel zur Wirbelsäule. </li><li> Keeping the Einschnitt Bereich feucht mit steriler saline, einen kleineren Schnitt durch den Muskel, gerade unterhalb der Rippen und ~ 1 cm von der Wirbelsäule. Der Schnitt sollte gerade groß genug, um die Niere durch zu ziehen, aber klein genug, dass die Niere wird nicht wieder in die Bauchhöhle ohne Gewalt. </li><li> Ziehen Sie die Niere vorsichtig durch den Muskel Schnitt mit einem Glas Pasteur Pipette, die in der Form eines stumpfen, leicht gebogene Haken gezogen worden ist. </li><li> Wet die Niere mit steriler DPBS, um die Kapsel vor dem Austrocknen zu verhindern. Dies kann notwendig sein, um während des gesamten Verfahrens zu wiederholen, als die Kapsel ist sehr zerbrechlich. </li><li> Mit Dumont Nr. 5 Pinzette vorsichtig die Kapsel aus der Niere und eine 2 mm Schnitt mit Vannas Frühjahr Schere. </li><li> Mit einem weiteren Glaspipette, die in eine sehr feine, stumpfe Sonde gezogen worden ist, machen Sie eine kleine Tasche zwischen der Kapsel und der Niere. </li><li> Mit einer großen Blende Pipettenspitze auf einem Einweg-Transferpipette platziert, nehmen Sie eine einzelne Zelle Pellet aus der Millicell einzufügen. Achten Sie darauf, möglichst wenig zusätzliche Medien zusammen wie möglich, wie überschüssige Medien mit dem Pellet Übertragung stören können. </li><li> Halten Sie den Rand des Einschnitts, um die Tasche zu schaffen, ganz sanft das Pellet neben der Öffnung und schieben Sie sie in die Tasche zu einem Pol der Niere mit der Pipette gezogen. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang mit einem zweiten Pellets. Legen Sie diese unter der Kapsel der gleichen Niere, sondern auf dem entgegengesetzten Pol. </li><li> Vorsichtig die Kapsel zurück auf die Pellets. Die Pellets sollen in der Tasche bleiben, und keine Nähte erforderlich sind, um die Kapsel zu schließen. </li><li> Schieben Sie die Niere wieder in die Bauchhöhle und in der Nähe des Muskels Wand mit 4-0 Seidenfäden (oder kleiner) mit angeschlossenem Reverse-Schneidnadel. Der Schnitt sollte so klein sein, dass nur eine einzige Naht notwendig ist. </li><li> Schließen Sie die Haut mit einer Reihe von 4-5 unterbrochen Stiche, mit dem gleichen Nahtmaterial. </li><li> Bevor Sie mit der Maus zurück in seinen Käfig, verwalten 0,05 mg / kg Buprenorphin (11,12) und 5 mg / kg Ketoprofen (12,13) ​​als kurzfristige und langfristige Analgetika bzw.. Geregelte Stoffe dürfen nur in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts verwendet werden. </li><li> Übertragen Sie die Tiere wieder in seinen Käfig und lassen Sie sie aus der Narkose auf einem Heizkissen erholen. Dies sollte etwa 20-30 Minuten in Anspruch nehmen. </li><li> Sobald die Maus ist voll gehfähig, kann es für das Tier Wohnanlage zurückgegeben werden. </li></ol> IV. Teratom Ernte, Fixierung und Schneiden <ol><li> Bei 8-12 Wochen nach der Operation sollte es eine kaum spürbare Teratom in der Nähe der Niere. Large, mit Flüssigkeit gefüllte Zysten wird oft als gut entwickeln, beginnend bei 6-8 Wochen. Diese kann es erforderlich eine frühere Ernte, wenn sie Not, um das Tier zu verursachen. Da Teratome bei langsameren Raten als Zysten wachsen, jedoch werden Sie wollen so lange wie möglich warten, um ein Teratom von ausreichender Größe für die Analyse (dh mindestens 8 Wochen) zu erhalten. </li><li> Entfernen Sie die Niere, Teratom, und alle umliegenden Zysten als ein Block von Gewebe aus der Bauchhöhle mit der gleichen chirurgischen Ansatz, bei dem die Nieren ursprünglich zugegriffen wurde (siehe Abschnitt III, die Schritte 1-4 oben). </li><li> Platzieren Sie den gesamten Block von entfernten Gewebes in ein Röhrchen mit 10% gepuffertem Formalin. </li><li> Lassen Sie das Teratom über Nacht fix bei 4 ° C. </li><li> Am folgenden Tag, entfernen Sie das Teratom aus der Tube. Dissect weg keine Zysten und so viel Nieren wie möglich, ohne die Teratom selbst (Abbildung 3). Größere Teratome können in zwei Hälften geschnitten werden, um Dissektion und Einbettung zu erleichtern. </li><li> Prozess der Teratom mit einem Standard-Paraffin-Verfahren zur Fixierung. Automatisierte Geräte sind (zB Shandon Hypercenter): <table border="0"><tbody><tr><td> I. </td><td> 80% Flex Alkohol </td><td> 2 Stunden </td></tr><tr><td> II. </td><td> 80% Flex Alkohol </td><td> 1 Stunde </td></tr><tr><td> III. </td><td> 85% Flex Alkohol </td><td> 1,5 Stunden </td></tr><tr><td> IV. </td><td> 95% Flex Alkohol </td><td> 1 Stunde </td></tr><tr><td> V. </td><td> 100% Flex Alkohol </td><td> 1 Stunde </td></tr><tr><td> VI. </td><td> 100% Flex Alkohol </td><td> 1 Stunde </td></tr><tr><td> VII. </td><td> 100% Flex Alkohol </td><td> 1 Stunde </td></tr><tr><td> VIII. </td><td> Clear-Rite 3 </td><td> 1 Stunde </td></tr><tr><td> IX. </td><td> Clear-Rite 3 </td><td> 1 Stunde </td></tr><tr><td> X. </td><td> Clear-Rite 3 </td><td> 1 Stunde </td></tr><tr><td> XI. </td><td> Paraffin (TissuePrep) </td><td> 2 Stunden </td></tr><tr><td> XII. </td><td> Paraffin (TissuePrep) </td><td> 2 Stunden </td></tr></tbody></table></li></ol> V. Immunhistochemie und Analyse <ol><li> Einmal in Paraffin, Abschnitt der Teratom in 5 um serielle Scheiben mit einem Rotationsmikrotom und Float Schnitte auf Objektträgern eingebettet. </li><li> Vor der Färbung, backen die Folien für mindestens eine Stunde. </li><li> Stain die Folien mit Hämatoxylin und Eosin unter Verwendung von Standardverfahren, um Gewebestrukturen Vertreter jeder der drei embryonalen Keimblätter (Abb. 4) zu identifizieren: <table border="0"><tbody><tr><td> I. </td><td> Xylol waschen </td><td> 3-5 Minuten </td></tr><tr><td> II. </td><td> Xylol </td><td> 3-5 Minuten </td></tr><tr><td> III. </td><td> 100% Alkohol </td><td> 3-5 Minuten </td></tr><tr><td> IV. </td><td> 100% Alkohol </td><td> 3-5 Minuten </td></tr><tr><td> V. </td><td> 95% Alkohol </td><td> 3-5 Minuten </td></tr><tr><td> VI. </td><td> 80% Alkohol </td><td> 3-5 Minuten </td></tr><tr><td> VII. </td><td> Wasser waschen (mehrere Änderungen) </td><td> 2 Minuten </td></tr><tr><td> VIII. </td><td> Gill Hämatoxylin # 3 </td><td> 2-5 Minuten </td></tr><tr><td> IX. </td><td> Wasser waschen (mehrere Änderungen) </td><td> bis das Wasser klar </td></tr><tr><td> X. </td><td> Scott ist Wasser (blau Kerne) </td><td> 3 Minuten oder mehr </td></tr><tr><td> XI. </td><td> Wasser waschen (mehrere Änderungen) </td><td> 1-2 Minuten </td></tr><tr><td> XII. </td><td> Eosin Y </td><td> 1 Minute </td></tr><tr><td> XIII. </td><td> Wasser waschen (mehrere Änderungen) </td><td> 30 Sekunden </td></tr><tr><td> XIV. </td><td> 80% Alkohol </td><td> 1 Minute </td></tr><tr><td> XV. </td><td> 95% Alkohol </td><td> 2 Minuten </td></tr><tr><td> XVI. </td><td> 95% Alkohol </td><td> 2 Minuten </td></tr><tr><td> XVII. </td><td> 100% Alkohol </td><td> 3 Minuten </td></tr><tr><td> XVIII. </td><td> 100% Alkohol (clean) </td><td> 3 Minuten </td></tr><tr><td> XIX. </td><td> Xylol </td><td> 2 Minuten oder mehr </td></tr><tr><td> XX. </td><td> Xylol </td><td> 2 Minuten oder mehr </td></tr></tbody></table></li><li> Montieren Sie ein Deckglas auf jeder Folie mit Permount. </li></ol> VI. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Plating bestrahlter CF1 embryonalen Maus-Fibroblasten als Feeder-Schicht für die Kultivierung undifferenzierter hESCs. MEFs sind bei ~ 50% Konfluenz vernickelt, wie hier gezeigt, oder 4 x 10 5 Zellen pro 3,5 cm Durchmesser und in einer 6-well Kulturschale. Bar, 100 um. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Beispiel subkonfluenten Kultur von undifferenzierten hESCs auf einem MEF Feeder-Schicht. HESCs auf MEF Feederschichten bis ~ 70% konfluent gewachsen, wie hier gezeigt, dann passagiert, wie beschrieben. Bar, 100 um. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Beispiel explantierten Teratome. Nach der Explantation, die Teratom-, Nieren-und Zubehörteilen Gewebe als ein Block in Formalin fixiert, dann die Nieren-und Zubehör-Gewebe werden sorgfältig entfernt, bevor die Einbettung in Paraffin geschnitten. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Teratome aus undifferenzierten hESCs abgeleitet enthalten Gewebe Vertreter aller drei Keimblätter in vivo. Ein Teratom, wie in Abbildung 3 dargestellt, wurde geschnitten und gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin, embryonale Gewebe zu identifizieren. hESCs führen zu Gewebe aller drei embryonalen Keimblätter (Ektoderm (A, B), Mesoderm (C), Endoderm abgeleitet (D). (A) Nascent Neuralrohr Struktur. (B) Primitive Plattenepithel. (C) Knorpelschäden Kapsel der kondensierten Mesenchym umgeben. (D) Glandular Darm-Struktur. Bar, 100 um. Bilder mit freundlicher Genehmigung des Autors abgedruckt. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Teratom Analyse kann verwendet werden, um das Schicksal der markierten, undifferenzierte hES Karte sein. Wie bereits veröffentlicht (9), eine Mischung aus speziell markiert hESCs mit untagged hESCs verwendet werden, um das Schicksal der markierten Zellen in ein Teratom-Assay Karte. Wie hier gezeigt wurden undifferenzierte hES Ausdruck der Oberfläche Marker CD133 und markiert mit Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP), mit untagged, undifferenzierte hES gemischt. Diese wurden verwendet, um Teratome von Nierenkapsel Pfropfen bilden. Immunhistochemische Analyse der Hämatoxylin und Eosin-gefärbten Teratom Abschnitte mit anti-eGFP-Antikörper zeigt die neuroektodermalen Schicksal der CD133 + hESCs. Teratome wurden wie in Abbildung 4 verarbeitet und gegengefärbt mit anti-eGFP-Antikörper (braun) zu lokalisieren Derivate von CD133 + GFP +-Zellen im Gewebe. CD133 +-abgeleiteten Zellen (Pfeile) wurden in den Geweben aus embryonalen Ektoderm, insbesondere neuronale Epithel (links) und im Entstehen begriffenen Neuralrohr-ähnlichen Strukturen (rechts) beobachtet. Bar, 100 um. Bilder mit freundlicher Genehmigung des Autors abgedruckt. Gelatine <ul><li> 0,1% Gelatine vom Schwein </li><li> 99,9% DPBS <ul><li> Add Gelatine DPBS, bei 37 ° C für eine Stunde oder bis alle Gelatine in Lösung geht und Filter sterilisieren (0,22 &amp;mgr; m) vor dem Gebrauch zu inkubieren. </li></ul></li></ul> MEF-Medium <ul><li> 10% fötalem Rinderserum (qualifiziert) </li><li> 90% Dulbecco Modified Essential Medium (D-MEM) </li><li> 1x L-Glutamin </li><li> 1x Pen / Strep <ul><li> Filter vor Gebrauch zu sterilisieren. </li></ul></li></ul> KSR (Knockout Serum Replacement) Medium <ul><li> 20% KnockOut Serum Ersatz </li><li> 80% KnockOut D-MEM </li><li> 1x L-Glutamin </li><li> 1x nicht essentielle Aminosäuren </li><li> 0,1 mM β-Mercaptoethanol / </li><li> 12,5 ng / ml bFGF <ul><li> Filter sterilisieren. </li><li> Lagerung bei 4 ° C, aber warm bis 37 ° C vor der Zugabe zu den Zellen. </li><li> Add bFGF unmittelbar vor dem Gebrauch. </li></ul></li></ul> Collagenase IV <ul><li> 1 mg / ml in KSR Medium, indem bei 37 ° C für 1-2 Stunden oder bis alle Pulver in Lösung geht. </li><li> Filter sterilisieren. </li></ul> Avertin <ul><li> 0,25 g 2,2,2-Tribromethanol </li><li> 0,25 ml 2-Methyl-2-Butanol <ul><li> Bei 37 ° C über Nacht auf 100% ig. </li><li> Einige Stunden vor der Operation, zu verdünnen, um 2,5% funktionierende Lösung mit DPBS und bei 37 ° C für mindestens 1 Stunde. </li><li> Filter sterilisieren und aliquote. </li><li> Tribromethanol ist sehr lichtempfindlich, so vor Licht zu schützen in allen Phasen der Herstellung und Verwendung. </li><li> Bereiten Sie nicht mehr als 12-24 Stunden vor dem Gebrauch. </li></ul></li></ul> Buprenorphin <ul><li> 1 mg / ml Stammlösung in Methanol <ul><li> Verdünnen auf 0,015 mg / ml Arbeitslösung mit sterilem H 2 O. </li><li> Lagerung bei -20 ° C bis zu 1 Monat. </li></ul></li></ul> Ketoprofen <ul><li> 0,5 mg / ml Arbeitslösung in DPBS <ul><li> Add DPBS inkubieren über Nacht bei 37 ° C für 1-2 Stunden oder bis alle Pulver in Lösung geht. </li><li> Filter sterilisiert und bei 4 ° C. </li></ul></li></ul>

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</ol>

Wir haben eine hocheffiziente Teratom-Assay für die Zwecke der Kartierung das Schicksal der Differenzierung hESCs in einem In-vivo-Umgebung angepasst. Eine kleine Anzahl von speziell ausgewählten hESCs ist mit undifferenzierten Wildtyp hESCs und Phaseolus vulgaris Lectin ein Zellpellet vermischt. Dies ist unter der Nierenkapsel in einem immundefizienten Maus gepfropft. Das Schicksal der ursprünglich ausgewählten hESCs dann durch Immunhistochemie (Abbildung 5) bestimmt werden, wie bereits berichtet (9). Diese Methode bietet ein wertvolles Werkzeug für die Identifizierung und Generierung Gewebe-spezifische Reagenzien für zell-basierte Therapien.

<table><tbody><tr><td>2-Methyl-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240486</td><td>Avertin</td></tr><tr><td>2,2,2-Tribrom&amp;#8211;thanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td>Avertin</td></tr><tr><td>4-0 Seidennaht</td><td>Ethicon Inc.</td><td>641G</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233FB</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7536</td><td></td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046-341</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Dupont #5 Pinzette</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500233</td><td>Nierenkapsel</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245-658</td><td></td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum (qualifiziert)</td><td>Invitrogen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Flex-Alkohol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046344</td><td></td></tr><tr><td>Gill&amp;rsquo;s Hämatoxylin #3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-204</td><td></td></tr><tr><td>Hämostat, gerade</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501241</td><td>Allgemeine Chirurgie</td></tr><tr><td>Irisscheren</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>15914</td><td>Allgemeine Chirurgie</td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2012</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut D-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serumersatz</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25020-081</td><td></td></tr><tr><td>MILLICELL-Einlagen</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Nichtessentielle Aminosäuren</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Operationschirurgische Schere</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501754</td><td>Allgemeine Chirurgie</td></tr><tr><td>Paraffin (TissuePrep)</td><td>Fisher Scientific</td><td>8002-74-02</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>PHA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1668</td><td></td></tr><tr><td>Schweinegelatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6144</td><td></td></tr><tr><td>ROCK-Inhibitor</td><td>Calbiochem</td><td>Y-27632</td><td></td></tr><tr><td>SCID beige Mäuse</td><td>Charles River Laboratories</td><td>250</td><td></td></tr><tr><td>Scott&amp;rsquo;s Wash</td><td>Fisher Scientific</td><td>6697-32</td><td>Ricca Chemicals</td></tr><tr><td>Vannas-Springer-Scheren</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>14003</td><td>Nierenkapsel</td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapto&amp;#8211;thanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr></tbody></table>

fate mapping von humanen embryonalen stammzellen durch teratom formation

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation 

Humane embryonale Stammzellen (hES) haben eine unbegrenzte Kapazität zur Selbsterneuerung und die Fähigkeit, sich in Zellen aller drei embryonalen Keimblätter (1) abgeleitet unterscheiden. Gerichtete Differenzierung von hES zu spezifischen Zelltypen hat viel Interesse im Bereich der regenerativen Medizin (z. B. (2-5)) erzeugt wird, und Methoden zur Bestimmung der<em&gt; In vivo</em&gt; Schicksal ausgewählt oder manipuliert hESCs sind unerlässlich, um dieses Unterfangen. Wir haben eine hocheffiziente Teratom-Assay für diesen Zweck hergerichtet. Eine kleine Anzahl von speziell ausgewählten hESCs ist mit undifferenzierten Wildtyp hESCs und Phaseolus vulgaris Lectin ein Zellpellet vermischt. Dies ist unter der Nierenkapsel in einem immundefizienten Maus gepfropft. So wenig wie 2,5 x 10<sup&gt; 5</sup&gt; HESCs sind nötig, um eine 16 cm Form<sup&gt; 3</sup&gt; Teratom innerhalb von 8-12 Wochen. Das Schicksal der ursprünglich ausgewählten hESCs kann dann durch Immunhistochemie bestimmt werden. Diese Methode bietet ein wertvolles Werkzeug für die Charakterisierung von Gewebe-spezifischen Reagenzien für zell-basierte Therapien.

Gerichtete Differenzierung von hES-Zellen in spezifische hat viel Interesse in der regenerativen Medizin erzeugt. Wir bieten Ihnen eine präzise, ​​Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Bestimmung des<em&gt; In vivo</em&gt; Schicksal der ausgewählten hESCs, dass ein wertvolles Werkzeug für die Charakterisierung von Gewebe-spezifischen Reagenzien für zell-basierte Therapien zur Verfügung stellt.

Fate Mapping von humanen embryonalen Stammzellen durch Teratom Formation

Humane embryonale Stammzellen (hESCs) besitzen eine unbegrenzte Fähigkeit zur Selbsterneuerung sowie die Fähigkeit, sich in Zellen zu differenzieren, die von allen drei ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, humane embryonale Stammzellen in vivo zu differenzieren und ihre gewebespezifischen Schicksale zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Pellet aus genetisch markierten Zellen der gewünschten Art erzeugt wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das Pellet chirurgisch unter die Nierenkapsel einer immundefizienten Maus zu implantieren.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, das Zellpellet acht bis zwölf Wochen unterhalb der Kapsel der Mausniere differenzieren zu lassen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Gewinnung des resultierenden Teratoms, dessen Fixierung in Formalin und die Analyse des Schicksals der markierten Zellen mittels Immunhistochemie. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, wie sich die markierten Zellen durch Histologie und Immunhistochemie der resultierenden Teratome in eine oder mehrere der drei Keimblätter entwickeln.Hallo, ich bin Carissa Ritner aus dem Labor von Dr. Harold Bernstein am Cardiovascular Research Institute der University of California in San Francisco. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Erzeugung von Teratomen mittels Engraftment unter der Nierenkapsel. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Differenzierung embryonaler Stammzellen zu untersuchen, sowohl um sicherzustellen, dass jede Zelllinie, mit der wir arbeiten, in alle drei Keimblätter differenzieren kann, als auch um das Schicksal genetisch markierter Stammzellen in vivo zu verfolgen.Alle Verfahren, die wir Ihnen zeigen, werden mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee der UCSF durchgeführt. Außerdem erfolgt jegliche Arbeit mit humanen embryonalen Stammzellen mit Genehmigung des Stem Cell Research Oversight Committee der UCSF. Beginnen wir also.Um Kulturen menschlicher embryonaler Stammzellen vorzubereiten, ziehen Sie bitte den Textteil dieses Protokolls heran. Für Notizen in einer Lamina-Flow-Haube behandeln Sie die mit Rock-Inhibitor behandelten Kulturen menschlicher embryonaler Stammzellen mit einem Milligramm pro Milliliter Kollagenase IV und inkubieren Sie fünf Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid; anschließend saugen Sie die Kollagenase IV aus dem Probengefäß ab. Ersetzen Sie diese durch ein Milliliter DPBS mit Raumtemperatur, ergänzt mit 10 % Penicillin-Streptomycin.Verwenden Sie einen flachen Zellabheber, um die Kolonien von der Platte abzukratzen, und überführen Sie 0,5 Milliliter der Zellsuspension in je ein Mikrozentrifugenröhrchen. Spülen Sie die Vertiefung mit einem Milliliter DPBS aus und überführen Sie jeweils 0,5 Milliliter der Spülflüssigkeit in jedes Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 20 Sekunden lang bei 8.000 × g, aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie jedes Pellet in 500 Mikrolitern frischem DPBS mit 100 Mikrolitern einer Ein-Milligramm-pro-Milliliter-Lösung.Fügen Sie Fasi-vulgaris-Lektin in DPBS zu jedem Reagenzglas hinzu, um die Zellen für die Transplantation zusammenzuhalten. Inkubieren Sie die Zellsuspension bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Zentrifugieren Sie die Zellen mit 8.000 × g für zwei Minuten, um den Pellet zu homogenisieren.Drehen Sie die Röhrchen um 180 Grad in ihren Rotorschächten. Anschließend erneut bei 8.000 × g für zwei Minuten zentrifugieren.Aspirieren Sie vorsichtig das SUP nasin, wobei die Pellets intakt bleiben sollen, um die Pellets aus dem Röhrchen zu lösen. Pipettieren Sie sanft 200 Mikroliter KSR-Medium neben den Rand des Pellets, bis es sich langsam löst. Sobald das Pellet gelöst ist, ziehen Sie das Medium sofort in eine 0,4-Mikrometer-Millicell ein. Geben Sie in eine Vertiefung drei Milliliter KSR.Medium. Inkubieren Sie zwei Stunden bis über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Legen Sie eine anästhesierte immundefiziente Maus auf eine Heizplatte, um eine Hypothermie zu verhindern.Verwenden Sie Operationschere und Irispinzette, um einen 2,5 cm langen Schnitt durch die Haut parallel zur Wirbelsäule, jedoch leicht seitlich davon, durchzuführen. Führen Sie einen kleineren Schnitt durch die Muskulatur direkt unterhalb der Rippen und etwa einen Zentimeter von der Wirbelsäule entfernt aus.Der Schnitt sollte groß genug sein, um die Niere hindurchzuziehen, aber klein genug, damit die Niere ohne äußere Kraft nicht zurück in die Bauchhöhle gleitet. Ziehen Sie die Niere mit einer Pasteurpipette, die zu einem stumpfen Haken geformt wurde, vorsichtig durch den Muskelschnitt. Befeuchten Sie die Niere regelmäßig mit sterilem DPBS, um zu verhindern, dass die empfindliche Kapsel mit feinen Pinzetten austrocknet.Ziehen Sie die Kapsel vorsichtig vom Nierenkörper weg. Verwenden Sie Venetianische Frühlingsscheren, um einen zwei Millimeter langen Einschnitt in die Kapsel zu machen. Führen Sie in der Mitte der Niere eine Pasteurpipette, die zu einer sehr feinen stumpfen Sonde ausgezogen wurde, zwischen die Kapsel und das Nierengewebe ein, und bewegen Sie sie sanft hin und her, um eine kleine Tasche zu bilden. Wiederholen Sie dies auf der gegenüberliegenden Seite der Niere, sodass zwei Taschen entstehen.Je einer an jedem Pol der Niere. Mit einer Pipettenspitze mit großem Durchmesser an einer Einweg-Transferpipette heben Sie ein einzelnes Pellet aus dem Milli-Cell-Einsatz. Entnehmen Sie so wenig Medium wie möglich, da überschüssiges Medium die Pellet-Übertragung stören kann. Halten Sie mit einer Pinzette den Rand der Tasche an der Niere fest. Platzieren Sie die Pellet vorsichtig neben der Öffnung und schieben Sie sie mit der gezogenen Pipettenspitze in die Tasche hinein, in Richtung eines Pols der Niere.Platzieren Sie ein zweites Pellet in die Tasche in Richtung des gegenüberliegenden Pols. Setzen Sie die Kapsel vorsichtig wieder auf die Pellets. Zum Verschließen der Kapsel sind keine Nähte erforderlich.Verwenden Sie eine hakenförmige Pipette, um die Niere vorsichtig in die Bauchhöhle zurückzuschieben. Der Muskelanschnitt sollte klein genug sein, um ihn mit einer einzelnen Seidennaht verschließen zu können. Verschließen Sie die Haut mit vier bis fünf Einzelknopfnähten und lassen Sie das Tier nach der Operation ausreichend Zeit zur Genesung, bevor es acht bis zwölf Wochen nach der Operation in die Tierhaltung zurückgebracht wird.Entfernen Sie das Nierenteratom und alle umgebenden Zysten gemeinsam als Gewebeprobe aus der Bauchhöhle. Legen Sie die gesamte Gewebeprobe in ein 50-Milliliter-Polypropylenröhrchen, das 10 % gepufferte Formalinlösung enthält. Lassen Sie das Teratom über Nacht bei vier Grad Celsius fixieren.Entfernen Sie das Teratom aus dem Röhrchen und legen Sie es auf eine Unterlage. Dissezieren Sie mit einem Skalpell alle Zysten und so viel Nierengewebe wie möglich ab, ohne das Teratom selbst zu beschädigen. Größere Teratome können zur Erleichterung der Dissektion und Einbettung halbiert werden.Verarbeiten Sie das Teratom mit der Standard-Paraffineinbettungstechnik und färben Sie Schnittpräparate auf Objektträgern zur Analyse und Bildgebung. Weitere Einzelheiten finden Sie in den Anmerkungen im Textteil des Protokolls. Hier zeigen wir Ihnen Gewebeschnitte eines typischen Teratoms.Dieses Teratom wurde mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt, um embryonale Gewebe nachzuweisen, die für alle drei Keimblätter repräsentativ sind, und zeigt eine anfängliche Neuralrohrstruktur, die für das Ektoderm charakteristisch ist. Dieser Abschnitt liefert ein weiteres Beispiel für Ektoderm, in diesem Fall primitives Plattenepithel. Hier repräsentiert Knorpel, umgeben von einer Kapsel aus kondensiertem Mesenchym, Gewebe, die aus dem embryonalen Mesoderm hervorgehen. Schließlich zeigt dieser Abschnitt mit einer dr&uuml;senf&ouml;rmigen Darmstruktur das Ende des dermalen Gewebes innerhalb des Teratoms, um den Entwicklungsweg genetisch markierter Stammzellen nachzuverfolgen. Dazu wurden Teratome mit einer Mischung aus Wildtyp- und CD133-positiven menschlichen embryonalen Stammzellen besiedelt. Die durch Pfeile gekennzeichneten, von CD133-positiven Zellen abgeleiteten Zellen wurden in Geweben beobachtet, die aus dem embryonalen Entoderm hervorgingen, insbesondere in Neuroepithel und neu entstehenden, neuralrohr&auml;hnlichen Strukturen. Ich bin Dr. Harold Bernstein.Carissa hat Ihnen gerade gezeigt, wie man Teratome aus menschlichen embryonalen Stammzellkulturen erzeugt, um einen In-vivo-Entwicklungsassay durchzuführen. Bei dieser Methode ist es wichtig, vorsichtig mit den Zellen umzugehen und auf die aseptische Technik zu achten. Das war's also.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Zebrafisch-Transplantation ermöglicht die Kombination von Genetik und Embryologie an gewebespezifischen Chimären zu erzeugen. Dieses Video zeigt Gastrula inszeniert zelltransplantationen, dass es unserem Labor auf den Rollen von astroglialen Bevölkerung und spezifische Anleitungen Cues während Kommissur Bildung im Vorderhirn zu untersuchen.

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Humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) haben die intrinsische Fähigkeit zu differenzieren und sich selbst zu organisieren in verschiedene Gewebemuster; obwohl dies erfordert die Darstellung der räumlichen Umweltgradienten. Wir präsentieren Schablone Mikro als einfache und robuste Methode biochemische und mechanische Gradienten zu erzeugen, für HPSC Differenzierungsmuster zu steuern.

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