Primer-Free Aptamer Selection mit einem zufälligen DNA-Bibliothek

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Aber aus einer Zufallsbibliothek zu identifizieren, die spezifisch an ein Zielprotein binden, in diesem Fall das S 100 B-Protein. Dies wird erreicht, indem zunächst die Bibliothek mit Restriktionsendonuklease verdaut wird, um zufällige Sequenzen aus flankierenden festen Primersequenzen zu befreien. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die zufälligen Bibliothekssequenzen an das gereinigte S 100 B-Protein zu binden und zurückzugewinnen.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, gebundene Sequenzen mit fixierten Primersequenzen durch Hybridisierung und Ligation wieder zu vereinen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die ligierten Produkte zu transkribieren, um eine R-T-P-C-R-Reamplifikation des gebundenen Pools von Kandidatenabern zu ermöglichen, gefolgt von weiteren Runden dieses Auswahlverfahrens. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine spezifische Bindung ausgewählter Aber an das S 100 B-Protein zeigen.

Hier werden beispielsweise Sandwich-Binding-Assays mit Microarrays durchgeführt und fluoreszenzmarkierte Second-Abers-Assays werden auch mit funktionalisierten Nanodrähten und Second-Abers-Assays durchgeführt, die an 15-Nanometer-Gold-Nanopartikel gekoppelt sind. Heute zeigen wir ein Verfahren zur Auswahl optimaler Proteine, die an S hundert B-Proteine aus einer zufälligen Bibliothek von D-Sequenzen binden. Wir nutzen dieses Verfahren in unserem Labor für eine Vielzahl von Zwecken, unter anderem für die Entwicklung einer Sensorplattform zur Früherkennung von Krebs.

Also lasst uns loslegen. Um dieses Verfahren zu starten, generieren Sie eine primerfreie oder PF-DNA-Bibliothek, wie zuvor beschrieben. Die Spaltung der doppelsträngigen DNA-Bibliothek, gefolgt von der Gelreinigung mit einem 10%igen denaturierenden Polyacrylamid-Gel, führt zu einem 32-Nukleotid-Fragment von fünf Prime-Phosphaten in 30 cm³ und einem 30-Nukleotid-Fragment von fünf Prim-Phosphaten in 30, das als 32-plus- bzw. 30-plus-Fragment bezeichnet wird.

Das 32 plus-Fragment enthält die 30-Nukleotid-Zufallsdomäne mit der minimalen CC-Flankensequenz am drei Primzahlende, während das 30-plus-Fragment nur aus der 30-Nukleotid-Zufallsdomänensequenz besteht. Um die DNA-Fragmente der PF-Bibliothek für die aptr-Selektion vorzubereiten, wird jedes der 32 plus- und 30 plus-Fragmente in 40 Mikrolitern von 20 Millitris, HCL pH 7,4, reanimiert. Anschließend erhitzen Sie die Proben nach der Inkubation drei Minuten lang bei 85 Grad Celsius.

Abkühlen lassen, die Proben drei Minuten lang in einen 37 Grad Celsius heißen Wasserbad-Inkubator legen, dann auf 760 Mikroliter Auswahl, puffern und drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach drei Minuten wird die Probe 10 Minuten lang bei Raumtemperatur aufbewahrt. Nach der Inkubation wird die Lösung durch eine Säule geleitet, die Nickel-NTA-Agro-Kügelchen enthält, die mit Selektionspuffer vorgewaschen sind.

Um unspezifische DNA zu entfernen, sammeln Sie die DNA-Fragmente der PF-Bibliothek, die nicht an die Säule binden, und legen Sie sie für später beiseite. Um die gebundenen S 100 B-Kügelchen herzustellen, werden zunächst 400 Mikroliter Nickel-NDA-Kügelchen drei Sekunden lang in einer Mikrozentrifuge geschleudert und der Überstand entsorgt. Waschen Sie dann die Kügelchen mit 400 Mikrolitern Bindepuffer, indem Sie fünfmal vorsichtig pipettieren.

Dann die Kügelchen nach unten drehen und den Überstand wegwerfen. Wiederholen Sie dies. Zweimal waschen.

Als nächstes armes, zuvor gereinigtes Histidin markiertes Protein über die Kügelchen. Hier bindet humanes S 100 Calcium. Protein B wird verwendet: Pipettieren Sie die Lösung vorsichtig fünfmal alle drei Minuten für insgesamt 15 Minuten auf und ab.

Nach 15 Minuten die Perlen drehen und den Überstand wegwerfen. Zum Schluss waschen Sie den perlengebundenen S 100 B mit 400 Mikrolitern Selektionspuffer, indem Sie dreimal vorsichtig auf und ab streichen. Schleudere die Perlen wieder nach unten und wirf den Überstand weg.

Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, um insgesamt drei letzte Waschungen für S 100 B gebundene Waschgänge auszuwählen. Rufen Sie die Fragmente über 32 und 30 zurück, die zuvor beiseite gelegt wurden. Geben Sie die Fragmente in das perlengebundene S 100 B.Dann inkubieren Sie die Probe 15 Minuten lang.

Mischen Sie alle drei Minuten, indem Sie nach 15 Minuten vorsichtig auf und ab pipettieren, schleudern Sie die Kügelchen kurz herunter, entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie dann den S 100 BDNA-Komplex mit 800 Mikrolitern Selektionspuffer durch vorsichtiges Pipettieren. Dann die Perlen nach unten drehen und den Überstand wegwerfen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal.

Zur Rückgewinnung des S 100 werden bei 200 Mikrolitern 20 Millimolar Tris, HCL pH 7,4 zu den Kügelchen gewählt. Dann erhitzen Sie die Gülle drei Minuten lang bei 85 Grad Celsius. Nach der Inkubation.

Drehen Sie die Perlen eine Minute lang und drehen Sie sie nach unten. Übertragen Sie dann den Überstand in ein frisches Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal und kombinieren Sie die Überstände.

Reinigen Sie abschließend die ausgewählten DNA-Fragmente. Extrahieren Sie die PCR-Produkte zweimal mit einem äquivalenten Volumen an Phenylchloroform, Isopropylalkohol. Sie werden mit 250 Millimolar Natriumchlorid und dem 2,5-fachen Volumen von 100%igem Ethanol bei minus 70 Grad Celsius für 15 Minuten ausgefällt.

Schleudern Sie bei 21.000 GS bei vier Grad Celsius für 15 Minuten. Entsorgen Sie dann den Überstand. Spülen Sie das Pellet effizient mit 75% Ethanol.

Schleudern Sie bei 21.000 GS bei vier Grad Celsius für fünf Minuten herunter und werfen Sie den Überstand ab. Trocknen Sie das Pellet nach 10 Auswahlrunden drei Minuten lang im Schnellvakuum. Klonieren Sie die resultierenden PCR-amplifizierten DNA-Fragmente in den PCR 2.1-Topovektor, der aus einem vitrogenen Kern gewonnen wurde.

Dann sequenzieren Sie zwischen 40 und 50 Einzelkolonien für jedes der ausgewählten N 30 cc- und N 30-Fragmente mit dem M 13 Forward Primer. Richten Sie die ausgewählten Sequenzen mit der infomax vector NTI-Software aus. Bestimmen Sie dann die Konsenssequenzen basierend auf den Alignments.

Sobald die Konsensussequenzen identifiziert wurden, wird der Konsensus gekauft, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Das erste Aptamer, synthetisiert mit einem Amin C mit sechs Primzahlen in Druckpuffer, wird auf eine Endkonzentration von 15 Mikromolaren suspendiert. Erkennen Sie dann die Aptamer-Lösung auf Code-Link-aktivierten Folien mit einem apogen discoveries Microgrid-Array.

Befolgen Sie den empfohlenen Code-Link-Protokollen. Drucken Sie jede Folie mit 12 Arrays. Verwenden Sie ein Format von zwei x acht.

Microarray-Hybridisierungskassette für die Hybridisierung. Verdünnen Sie das S 100 B-Protein auf die entsprechende Konzentration in 70 Mikrolitern PBS. Tragen Sie dann die Lösung auf die Vertiefungen der Microarray-Kassette auf.

Versiegeln Sie die Microarray-Kassette mit einer nukleasefreien, selbstklebenden Deckenfolie, um eine Verdunstung zu verhindern. Lassen Sie das Protein an die auf dem Code-Link aufgedruckten Abers binden. Nach der individuellen Inkubation eine Stunde lang bei Raumtemperatur gleiten.

Waschen Sie die Vertiefungen der Kassette dreimal mit PBS fünf Millimolar Magnesiumchlorid oder PBSM. Als nächstes verdünnen Sie die fluoreszenzmarkierten Sekundenaber auf 0,125 Mikromolar in 70 Mikrolitern PBSM. Erhitze die Mischung drei Minuten lang bei 85 Grad Celsius.

Anschließend die beschrifteten ABERS auf Eis abkühlen lassen. Tragen Sie die Abers drei Minuten lang auf die Vertiefungen der Microarray-Kassette auf. Verschließe die Kassette wieder mit der Klebefolie und inkubiere sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur.

Wieder individuell. Waschen Sie die Vertiefungen nach dem Waschen dreimal mit PBSM. Zerlegen Sie die Kassette und spülen Sie den gesamten Objektträger mit PBSM aus.

Anschließend trocknet man den Objektträger durch Zentrifugieren gründlich ab. Scannen Sie abschließend den Objektträger mit einem Scan-Array von Packard Biosciences. Die Bindung von 4.000 XL wurde für gamma P 32 A TP mit fünf Prime-markierten Aptameren an das S 100 B-Protein bestimmt und gegen die Konzentration für die KD-Bestimmung aufgetragen.

Repräsentative kds liegen nach etwa sieben Auswahlrunden typischerweise im Bereich von 10 bis minus sieben molaren Molekülen. Fünf Hauptziele: Die ersten Aptamere wurden an Code-Link-Microarrays gekoppelt: Das gereinigte S 100 B-Protein wurde an den ersten Optimator gebunden und LOR 5 46 markierte an den zweiten. Optimer wurde an die ersten optimer S 100 B Komplexe gebunden.

Die Fluoreszenz wurde mit einem Scan-Array-Scanner quantifiziert. Die mittlere Reihe zeigt die Sandwich-Bindung, die durch additive Bindung in KD-Assays in den Reihen darüber und unten gekennzeichnet ist. Es gibt keine Sandwichbindung für Aber, fünf Prime-Thiol-derivatisierte erste Aber wurden mit Hilfe der Standard-Thile-Chemie an Goldnanodrähte gekoppelt.

Zweite Aber wurden auf die gleiche Weise an 50 NMO- oder Gold-NPs gekoppelt. Das gereinigte S 100 B-Protein wurde dann zuerst an die abgeleiteten Nanodrähte gebunden, das zweite Aptamer 50 Nanomolgold mps wurde anschließend an die ersten Aptamer-Nanodraht-S 100 B-Komplexe gebunden. Gebundene Sandwichkomplexe wurden mit F FE SEM visualisiert. Hier.

Eine Negativkontrolle ist für einen Bindungsassay zu sehen, der mit dem HTRA one Protein anstelle des S 100 B Proteins durchgeführt wurde. Okay, eines der wichtigsten Dinge an dem Verfahren ist, dass wir einen primerfreien Ansatz verwenden, bei dem wir keine festen Sequenzen haben, die zu falsch positiven und falsch negativen Ergebnissen führen können, basierend auf den Sequenzen, die den Zufallsbereich überwältigen. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sicherzustellen, dass die DNA-Matrize vor jeder reversen Transkriptionsreaktion zerstört wird, und darauf zu achten, dass das spezifische R-T-P-C-R-Produkt nach jeder erneuten Amplifikation isoliert wird.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.