Oligo Messe Profiling (OLIMP) der extrazellulären Polysacchariden

Das hier gezeigte Experiment des Oligo-Mass-Profilings oder der Olympischen Spiele ermöglicht es, schnelle Einblicke in die Struktur von Polymeren in der extrazellulären Matrix oder Zellwand eines Organismus zu gewinnen. Im vorliegenden Fall werden Zellwände aus Pflanzenkeimlingen präpariert, indem zunächst zelluläre Bestandteile mit 70%Ethanol entfernt werden. Das Zielwandpolymer wird als nächstes mit einer spezifischen Hydrospitze aufgeschlossen, die bestimmte Wandkomponenten in Form aller Bänder auflöst.

Ein alternativer Ansatz besteht darin, die Zellwand mit dem Enzym in C zwei direkt auf dem Gewebe zu verdauen. Die relative Häufigkeit der Freisetzungsbänder wird mittels MALDI mittels Massenspektrometrie und statistischer Analyse bestimmt. Hallo, ich bin Marcus Polly vom Energy Biosciences Institute hier an der University of California in Berkeley.

Hallo, ich bin Marcus Re.Und ich bin Asha Giller. Ebenfalls vom Energy Biosciences Institute. Organismen sind von extrazellulären Matrizen umgeben, die je nach Organismus aus komplexen Polymernetzwerken bestehen.

Eine schnelle und empfindliche Methode zur Beurteilung der extrazellulären Matrix ist eine Methode, die wir Oli Mass Profiling Short Oleum nennen und die wir Ihnen heute vorstellen werden. Dieses Verfahren kann auch direkt am Pflanzengewebe durchgeführt werden. Also lasst uns loslegen.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die extrazelluläre Matrix oder Zellwand von Pflanzengeweben isolieren. Ernten Sie fünf Arabidopsis-Sämlinge oder die entsprechende Menge an anderem Pflanzenmaterial und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen. Stellen Sie sicher, dass das Material am Boden des Rohrs platziert wird.

Geben Sie zwei drei Millimeter große Metallkugeln in das Reaktionsröhrchen und frieren Sie es in flüssigem Stickstoff ein. Anschließend wird die gefrorene Probe mit einer Kugelmühle 2,5 Minuten lang bei 25 Hertz gemahlen. Nach dem Mahlen des Materials geben Sie einen Milliliter 70%iges wässriges Ethanol in die Probe.

Entfernen Sie die Metallkugeln mit einem Magneten und wirbeln Sie sie gründlich ein. Bei dieser Behandlung werden die meisten Proteine und Zellorganellen gelöst, die Probe wird 10 Minuten lang bei 14.000 U/min zentrifugiert, um den unlöslichen Alkoholrückstand zu pelletieren. Stellvertretend für das Zellwandmaterial saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.

Geben Sie einen Milliliter Chloroform-Methanollösung zu dem im Röhrchenwirbel verbleibenden Pellet gründlich. Um das Pellet zu resuspendieren und zu zentrifugieren, extrahiert das Chloroform-Methanol hydrophobe Verbindungen wie Lipide. Entfernen Sie nach der Zentrifugation die Schlinge und trocknen Sie das Pellet vollständig Mit einer Vakuumzentrifuge wird die Isolierung des Zellwandmaterials abgeschlossen, das nun zu spezifischen Bändern aufbereitet werden kann.

Das hier demonstrierte Beispiel ist die Solubilisierung von Xlo-Glucan, der wichtigsten Hemicellulose, die in den Zellwänden von Dikotyledonenpflanzen wie Arabidopsis vorhanden ist. Xlo-Glucan ist ein Polymer, das aus einem Glucan-Rückgrat besteht, das für die Solubilisierung dieses Polymers stark mit anderen Zuckerresten substituiert ist. Ein Pilz-Endo-Glucan wird verwendet, um dieses Hemicellulose-Resus zu lösen, das trockene isolierte Zellwandpellet in 25 Mikrolitern 50 millimolare Ammoniumformiate mit einem pH-Wert von 4,5 zu suspendieren und 0,2 Einheiten Endogluconat hinzuzufügen. Wirbeln Sie die Suspension vor und schleudern Sie die Flüssigkeit nach unten.

Legen Sie das Röhrchen in einen Mixer und lassen Sie die Wände 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter Schütteln verdauen. Bei 300 U/min. Wenn der Aufschluss der isolierten Zellwand abgeschlossen ist, entfernen Sie das Lösungsmittel mit einer Vakuumzentrifuge und fahren Sie mit der Analyse der freigesetzten Oligosaccharide durch Massenspektrometrie fort. Salze und Enzyme werden aus der aufgeschlossenen Probe mit den Kationenaustauscherharzkügelchen von Biox MSD 5 0 1 entfernt.

Die Kügelchen werden zunächst konditioniert, indem die benötigte Menge in eine leere Säule gegeben und die Kügelchen mit reichlich Wasser gewaschen werden. Geben Sie fünf bis 10 konditionierte Biox-Kationenkügelchen in die verdaute und getrocknete Probe. Fügen Sie dann 10 Mikroliter Wasser hinzu, um die Materialmengen zu verringern.

Es dürfen fünf Mikroliter Wasser verwendet werden. Tauchen Sie die Kügelchen in die Lösung, indem Sie das Röhrchen kurz drehen und mindestens 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren, während der Aufschluss mit den Kügelchen inkubiert. Spotten Sie zwei Mikroliter DHB-Matrix auf eine mal-D-Zielplatte.

Verdampfen Sie das Matrixlösungsmittel unter Vakuum, was zu Matrix-Chemiekristallen führt, und entdecken Sie nun zwei Mikroliter der entsalzten Aufschlusslösung. Auf den Matrixkristallen auf der Zielplatte. Das Lösungsmittel des Probenmatrix-Spots wird wieder unter Vakuum verdampft.

Es ist wichtig, eine angemessene Zeitspanne für das Mischen der Probenmatrixflüssigkeit vor der Kristallisation einzuhalten, wie in dem beigefügten schriftlichen Protokoll ausführlich beschrieben. Sobald die Probe getrocknet ist, legen Sie die Zielplatte in ein Maldi-zu-Massenspektrometer. Stellen Sie die Maschine in den positiven Modus mit einer Beschleunigungsspannung von 20.000 Volt und einer Verzögerung von 350 Nanometern.

Der gewählte Massenbereich für diese Hemizellulose-Bänder liegt zwischen 500 und 3000 Dalton. Der Massenbereich sollte entsprechend der Größe der zu erwartenden Bänder modifiziert werden. Beginnen Sie mit dem Abfeuern des Lasers und sammeln Sie 100 bis 200 Spektren pro Probe, die zusammengestellt werden, um ein repräsentatives Durchschnittsspektrum zu erzeugen.

Dies ist das Hemi Cellulose oly Spektrum. Die in diesem Video gezeigte oly-Methode kann auch direkt auf dem Pflanzengewebe angewendet werden, ohne dass Schritte zur Wandvorbereitung erforderlich sind. Dieses in situ Analyseverfahren wird an dunkel gewachsenen Arabidopsis-Sämlingen demonstriert.

Die Probe wird direkt auf eine Zielplatte gelegt und an der Luft getrocknet, um den trockenen Sämling auf der Platte zu bilden. 0,5 Mikroliter der entsprechenden Enzympuffermischung an den gewünschten Stellen zugeben. Achten Sie darauf, dass der Enzymtropfen teilweise das Gewebe und die Zielplatte berührt.

Legen Sie die maldi Zielplatte in ein geschlossenes Gefäß mit sättigender Luftfeuchtigkeit, um ein Austrocknen der Enzymtropfen zu vermeiden. Inkubieren Sie die Platte 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubationszeit trocknen Sie den Enzymfleck unter Vakuum und geben Sie 0,5 Mikroliter der flüssigen DHB-Matrix auf jeden getrockneten Enzymfleck.

Anschließend trocknen Sie die MALDI-Zielplatte unter Vakuum. Um die NC zu analysieren, werden zwei Proben verwendet. Platzieren Sie die Zielplatte, einschließlich der Enzymmatrix-Spots der Gewebeprobe, in ein Multi- bis Massenspektrometer-Aufzeichnungsmassenspektren mit den gleichen Einstellungen wie für die isolierte Zellwandprobe.

Beginne, den Laser auf die Matrix zu schießen. Proben Sie Kristalle neben dem Gewebe. Achten Sie darauf, das Gewebe selbst nicht zu treffen, da in einem solchen Fall die Flugzeit der Moleküle nicht stimmt.

Sammeln Sie etwa 20 bis 50 Spektren pro Spot und kompilieren Sie sie, um ein repräsentatives Durchschnittsspektrum zu erzeugen. Dies ist ein repräsentatives durchschnittliches Spektrum der Oligosaccharide, die aus dem HemosIL-Glucan gewonnen werden, das in AOPs enthalten ist. Die Sämlinge, die Ionenintensitäten oder die Ionenhöhe aller interessierenden Ionen werden zu 100 % addiert, was zur relativen Häufigkeit der verschiedenen Oligosaccharide führt.

Das Ergebnis der NC two OMP-Methode liefert ähnliche Ergebnisse. Jedes durch einen farbigen Kreis markierte Enzymaufschlusströpfchen kann unabhängig voneinander analysiert und die entsprechenden Massenspektren erhalten und analysiert werden. Oola kann auch an anderen Polymeren der extrazellulären Matrix durchgeführt werden, wenn ein geeignetes hydrolysierendes Enzym zur Verfügung steht.

Als Beispiel ist dies ein Oola-Spektrum des Hämocellulose-Zylins, das in der Bioenergiepflanze enthalten ist. Ms.Canus, um die präsentierten Daten zu erhalten, während Material von einem Mecampus-Blatt mit dem Xin verdaut wurde. Für die Zuordnung von Strukturen zu den Ionen verweisen wir auf das beigefügte Protokoll.

Wir haben Ihnen gerade das Verfahren der Erstellung von Oligo-Mar-Massenprofilen auf exozellulären Metriken gezeigt. Polymere, Bei diesem Verfahren ist zu beachten, dass die besten Ergebnisse erzielt werden können, wenn homogene Matrixergebnisse für die OV-MS-Analyse erzielt werden. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei den Experimenten.