Name: Mess-Calpain Aktivität in fixierten und lebenden Zellen mittels Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-08T17:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Lernen Sie die Durchflusszytometrie zur Messung der Calpain-Aktivität in fixierten und lebenden Zellen. Diese Methode nutzt fluoreszente Substrate und ermöglicht die Untersuchung von Proteasen in Leukämie- und Lymphomzellen.

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Unterstützt durch Zuschüsse aus dem Canadian Institutes of Health Research, The Leukemia and Lymphoma Society of Canada und der Lymphoma Foundation of Canada.

Bereiten Sie Reagenzien Hinweis: Alle PBS enthält Ca 2 + und Mg 2 + <ol><li> Nachweisreagenz Add 20 um 7-Amino-4-chlormethyl Cumarin, t-BOC-Leucin-methioninamid (BOC-LM-CMAC) auf Raumtemperatur PBS. Jede Zellsuspension erfordert 2mL Nachweisreagenz. </li><li> 1% Paraformaldehyd (Fixed Cells) Verdünnen Sie 4% Paraformaldehyd Stammlösung bei Raumtemperatur PBS. Aliquot 1ml 1% Paraformaldehyd jedem FACS-Röhrchen. Drei FACS Röhrchen für jede experimentelle Bedingung erforderlich sind (zB 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit + PD98059 brauchen 9 FACS-Röhrchen) </li><li> PD150606 (Calpain-Inhibitor) Rekonstituieren PD150606 in DMSO in einer Endkonzentration von 100 mM. Schützen Sie dieses Reagenz und alle Zellen mit Inhalt vor Licht behandelt für die Dauer des Experiments. </li><li> PD98059 (MEK1 Inhibitor) Rekonstituieren PD98059 in DMSO in einer Endkonzentration von 50mM. </li></ol> Bereiten Cells <ol><li> Wachsen 32Dkit Zellen bei 5 x 05 bis 1 Oktober x 10 6 Zellen pro ml in Opti-MEM Medium mit 5% fötalem Rinderserum, WEHI-3 Überstand als eine Quelle von IL-3 (oder eine andere Quelle für IL-3, wie ergänzt als rekombinantes Protein), 0,1% 2-Mercaptoethanol und Antibiotika. </li><li> Sammeln Sie 12 x 10 6 Zellen 32Dkit in drei 15 mL Falcon-Röhrchen (4 x 10 6 Zellen pro Röhrchen). </li><li> Pellet die Zellen bei 1000 rpm für 5 Minuten bei 15 ° C. </li><li> Den Überstand aspirieren. Resuspendieren der Zellen in 2 ml Raumtemperatur PBS. </li><li> Gönnen einer Zelle Fahrwerk mit 50 &amp;mgr; PD150606. Sicherstellen, dass die Probe von Licht durch das Abdecken der Falcon-Röhrchen mit Alu-Folie geschützt. Vortex kurz danach für 20-30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. </li><li> Treat der zweiten Zellsuspension mit 20 um PD98059. Platte die Zellen in einer 35-mm Gewebe Kulturschale und Inkubation für 2 Stunden bei 37 ° C. </li></ol> Calpain Assay in fixierten Zellen <ol><li> Während der Proben mit PD150606 sind Inkubation beginnen die Calpain-Assay auf den unbehandelten Proben. Beginnen Sie, indem 2 ml Nachweisreagenz jeder Zellsuspension. Unmittelbar 1ml der Zellsuspension / Nachweisreagenz Mischung auf die vorbereiteten FACS-Röhrchen mit 1% Paraformaldehyd (0 Minuten Zeitpunkt). </li><li> Inkubieren Zellsuspensionen mit Nachweisreagenz für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Dann 1ml der Zellsuspension zu einem FACS-Röhrchen mit 1 ml 1% Paraformaldehyd. </li><li> Weiter Inkubation der Zellsuspensionen mit Erkennung Mischung für weitere 5 Minuten bei Raumtemperatur. Dann 1ml der Zellsuspension zu einem FACS-Röhrchen mit 1 ml 1% Paraformaldehyd. </li><li> Wiederholen Sie die Calpain-Assay auf 32Dkit Zellen, die mit Inhibitoren behandelt wurden. </li><li> Fix Zellen über Nacht im Dunkeln bei 4 ° C. </li><li> Am nächsten Tag Pellet die Zellen bei 1800 rpm für 5 Minuten bei 15 ° C. </li><li> Den Überstand aspirieren. Resuspendieren der Zellen in 750uL PBS. Legen Zellen auf Eis und halten in der Dunkelheit. </li></ol> Erfassung von Daten für die fixierten Zellen <ol><li> Analysieren Sie die Zellen mit einer LSR II (BD Bioscience). Die Filter sind für die Lightwave Xcyte (UV)-Laser, Anregung Linie 355nm und Laserleistung 25mW, die Emission von 405 und 450 nm für Substrat und Produkt bzw. eingestellt. Bandpass-Filter für Substrat und Produkt sind 405/20 und 450/50. Langpassfilter für Substrat und Produkt sind 405 und 450. Die PMT-Spannung wurde auf 350-375 für Substrat und 325-350 für das Produkt eingestellt. </li><li> Set-up eine BD FACSDiva Experiment mit den folgenden Parametern: forward scatter; side scatter; Indo-1 Blue (log); Indo-1 Violet (log). Auf dem Arbeitsblatt einrichten die folgenden Grafiken: forward scatter vs side scatter Dot-Plot mit einem Tor an lebenden Zellen (Abbildung 1a), Indo-1 Blue-Histogramm, Indo-1 Violet Histogramm, Indo-1 Blue vs Indo-1 Violet Dot-Plot. </li><li> Kalibrieren Sie den LSR II mit AlignFlow und AlignFlow sowie fluoreszierende Kügelchen (Invitrogen). Die PMT-Spannung soll an die Spitze des Bead-Fluoreszenz-Histogramm in dem gleichen Kanal vor jedem Experiment Ort sein. </li><li> Begin Erfassung von Daten über die 32Dkit Zellen in der 0-Minuten-Zeitpunkt. Stellen Sie Parameter Spannungen wie nötig. Erfassen und speichern, 10.000 Ereignisse pro Probe. </li><li> Wiederholen Sie die Übernahme für jede Probe, Spülen der Maschine mit FACS-Puffer zwischen den einzelnen Röhre. </li><li> Export der Daten. Stellen Sie sicher, LSR II ist nach Instituts-Richtlinien gereinigt. </li></ol> Calpain Assay in lebenden Zellen <ol><li> Bereiten Sie die Zellsuspensionen wie oben, ohne PD150606. Bringen Sie die Proben an die LSR II und Filter einrichten und Parameter wie oben. Richten Sie das Arbeitsblatt wie oben. Fügen Sie eine große Dot-Plot zeigt Indo-1 Blue-Zeit. Stellen Sie das Programm, um die maximale Zahl erwerbenber von Veranstaltungen (kein Stop-Tor). </li><li> Add 50 &amp;mgr; PD150606 zu einer Zellsuspension von 32Dkit Zellen. Halten Sie die Probe im Dunkeln und bei Raumtemperatur inkubieren für 20-30 Minuten. </li><li> Begin Erfassung von Daten über die 32Dkit Zellsuspension ohne PD150606. Verwenden Sie eine geringe Strömungsgeschwindigkeit von 200-300 Ereignisse pro Sekunde. Nach 30 Sekunden bis 1 Minute den Schlauch aus der Maschine. Add 20 um BOC-LM-CMAC zu den Zellen. Vortex kurz danach weiterhin den Erwerb der Daten. </li><li> Erfassung von Daten für 10-20 Minuten oder bis der Calpain-Aktivität Plateaus. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3 und 4 mit 32Dkit Zellen mit PD150606 behandelt. </li><li> Export der Daten. Stellen Sie sicher, LSR II ist nach Instituts-Richtlinien gereinigt. </li></ol> Calpain Assay in Complex (Mixed) Zellpopulationen * Dieses Experiment wird 32Dkit Zellen in einer Zellsuspension aus einer Maus-Milz geerntet zu identifizieren. <ol><li> Ernte der Milz von jeder Maus. Lyse der roten Blutkörperchen mit NH 4 Cl für 10 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten Sie einzelne Zellsuspensionen in 2 ml PBS. </li><li> Teilen Sie jede Zellsuspension in zwei Teile. Gönnen 1 Zelle Fahrwerk mit 50 &amp;mgr; PD150606 für 20-30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Gehen Sie wie oben für die Calpain Assay in fixierten Zellen (Schritte 1-6) </li><li> Den Überstand aspirieren. Waschen Sie die Zellen in 500μL PBS. Den Überstand aspirieren. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 200 ul Färbepuffer mit 2% BSA. Inkubieren für 15 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten Sie den primären Antikörper (FITC-anti-Maus CD117). Der Antikörper sollte bei einer Verdünnung von 1:200 in Färbepuffer verwendet werden. Sicherstellen, dass die Antikörper im Dunkeln gehalten wird. </li><li> Add 200 ul primären Antikörpers zu den Zellen. Inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Fügen Sie 400μL PBS, um die Lautstärke für die Durchflusszytometrie erhöhen. Legen Sie die Zellen auf Eis und halten in der Dunkelheit. </li><li> Gehen Sie wie in Acquire Daten für fixierte Zellen beschrieben. Add FITC, um die Parameter und verfügen über ein Histogramm für FITC auf dem Arbeitsblatt. </li></ol> Analyse und repräsentative Ergebnisse <ol><li> Analysieren von Daten mit FlowJo (Treestar). Tor an lebenden Zellen auf Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht-Profil (Abb. 1a) basiert. Bestimmen Sie die mittlere Fluoreszenz für Indo-Blue aus der lebensfähigen Zellen Tor (Abb. 1b). </li><li> a) Für die gemischten Zellpopulation <ul><li> Verwendung FITC Fluoreszenz-Histogramme und Dot-Plots der 32Dkit Bevölkerung identifizieren </li><li> Bestimmen Sie die mittlere Fluoreszenz für Indo-Blue der 32Dkit Bevölkerung </li></ul></li><li> Verwenden Sie Microsoft Excel, um Graphen die mittlere Fluoreszenz (Abbildung 2a). Berechnen Sie die Steigung der Geraden zwischen 5 und 10 Minuten. Graph die Steigung als Balkendiagramm an Calpain-Aktivität in den Zellen zu bestimmen (Abbildung 2b). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1a.jpg" alt="Abbildung 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1a"> Abbildung 1a. Bestimmung lebenden Zellen auf Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht-Profil. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1b.jpg" alt="Abbildung 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1b"> Abbildung 1b. Mittlere Fluoreszenz Wechsler 10 Minuten Zeit, natürlich. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2a.jpg" alt="Abbildung 2a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2a"> Abbildung 2a. Representative Graph des durchschnittlichen Fluoreszenz. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2b.jpg" alt="Abbildung 2b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2b"> Abbildung 2b. Calpain-Aktivität in 32Dkit Zellen mit Inhibitoren.

<ol><li>Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).</li>
<li>Niapour, M., Berger, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometric+Measurement+of+Calpain+Activity+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells.</a> Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).</li>
<li>Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+ERK%2FMAP+kinase+signalling+pathway+in+milli-calpain+activation+and+myogenic+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration.</a> The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).</li>
</ol>

Die Calpain-Aktivität in fixierten und lebenden Zellen 32Dkit hat in diesem Video-Protokoll bestimmt. Die Behandlung der Zelllinie mit dem Calpain-Inhibitor PD150606 führte zu einer vollständigen Hemmung von Calpain-Aktivität in den Zellen. Darüber hinaus führte die Behandlung mit dem Inhibitor PD98059 MEK1 in eine vollständige Hemmung von Calpain-Aktivität in den Zellen. ERK ist ein wichtiger Aktivator von Calpain-2 3. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Calpain-2-Aktivität überwiegt in der 32Dkit Zellen ist. ...

<table><tbody><tr><td>PBS BOC-LM-CMAC 4 % Paraformaldehyd</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;4 g Paraformaldehyd in 100 mL PBS lösen. Probe im Abzug unter Rühren erhitzen, bis sie klar ist.&lt;br/&gt;Abkühlen lassen, dann bei 4 °C lagern&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>PD150606</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Verwenden Sie frisch rekonstituiertes PD150606 für eine maximale Calpain-Hemmung.</td></tr><tr><td>PD98059</td><td>Cell Signaling Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AlignFlow, AlignFlow plus fluoreszierende Kügelchen FACS-Röhrchen</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>&lt;br/&gt;Das Überstandmedium von WEHI-3-Zellen wird in diesen Experimenten als Quelle für IL-3 verwendet. Jede Überstandsammlung von WEHI-3 wird titriert, um die optimale Konzentration für das Wachstum von 32Dkit-Zellen zu bestimmen. </td></tr></tbody></table>

mess-calpain aktivität in fixierten und lebenden zellen mittels durchflusszytometrie

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpaine sind allgegenwärtig intrazellulären Calcium-sensitiven, neutral Cystein-Proteasen<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpaine spielen eine entscheidende Rolle in vielen physiologischen Prozessen, einschließlich der Signalisierung, Zytoskelett-Umbau, Regulation der Genexpression, Apoptose und Zellzyklus-Progression<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpaine haben in vielen Pathologien wie Muskeldystrophien, Krebs, Diabetes, Alzheimer und Multipler Sklerose beteiligt<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpain Regelung ist komplex und noch nicht vollständig geklärt. mRNA-und Proteinebene korrelieren schlecht mit der Tätigkeit, Beschränkung der Verwendung von Gen-oder Protein-Expression Techniken Calpain-Aktivität zu messen. Dieses Video-Protokoll Details ein durchflusszytometrischen Assays in unserem Labor zur Messung von Calpain-Aktivität in fixierten und lebenden Zellen entwickelt. Diese Methode verwendet das fluoreszierende Substrat BOC-LM-CMAC, die speziell durch Calpain gespalten, um Calpain-Aktivität zu messen.<sup&gt; 2</sup&gt; In diesem Video wird Calpain-Aktivität in fixierten und lebenden Maus 32Dkit Leukämiezellen, allein oder als Teil eines Splenozyten Bevölkerung gemessen mit einem LSRII (BD Bioscience). 32Dkit Zellen gezeigt zu haben, erhöhte Aktivität in den normalen Splenozyten verglichen.

Dieser Artikel wird detailliert die Verfahren zur Messung der Calpain-Aktivität in fixierten und lebenden Zellen mittels Durchflusszytometrie.

Mess-Calpain Aktivität in fixierten und lebenden Zellen mittels Durchflusszytometrie

Calpaine sind ubiquitäre intrazelluläre, calciumsensitive, neutrale Cysteinproteasen 1. Calpaine spielen eine entscheidende Rolle in vielen physiologischen Prozessen, ...

Calpainen sind ubiquitäre, intrazelluläre Kalzium-sensitive neutrale Cysteinproteasen, die entscheidende Rollen in zahlreichen physiologischen Prozessen spielen, darunter Signaltransduktion, Umbau des Zytoskeletts, Regulation der Genexpression, Apoptose und Zellzyklusprogression. Um die Calpain-Aktivität in fixierten und lebenden Zellen zu messen, wird das fluoreszierende Substrat BUC, LMC MAC hinzugefügt. Buc LMC MAC wird spezifisch durch Calpain gespalten, was zu einer Zunahme der Fluoreszenz führt. Die Änderung der Fluoreszenz wird mittels Durchflusszytometrie überwacht, wodurch eine erhöhte Calpain-Aktivität in 30 2D Kit-Zellen im Vergleich zu normalen Zellen nachgewiesen wird.Hallo, ich bin Christina Farr aus dem Labor von Dr. Stewart Berger an der Universität von Toronto, Abteilung für Immunologie und das University Health Network. Heute zeige ich Ihnen, wie man die Calpain-Aktivität in fixierten und lebenden Zellen mithilfe eines auf Durchflusszytometrie basierenden Assays messen kann. In unserem Labor verwenden wir diesen Assay, um die Calpain-Aktivität in Leukämie- und Lymphomzellen zu untersuchen.Beginnen wir nun. Bevor Sie mit den Experimenten starten, bereiten Sie die benötigten Reagenzien vor, einschließlich des Detektionsreagenz 1 % PARAFORM Aldehyd Calpain-Inhibitor PD 1 50 0 6 0 6 und des MEC1-Inhibitors PD 9 8 0 5 9. Weitere Einzelheiten zur Herstellung dieser Reagenzien finden Sie im beigefügten schriftlichen Protokoll. Geben Sie ein Milliliter 1 % Paraformaldehyd in jedes FACS-Röhrchen.Für die in diesem Video gezeigten fixierten Zellen sind drei FACS-Röhrchen pro experimenteller Bedingung erforderlich. Es werden drei Bedingungen getestet, daher werden neun FACS-Röhrchen benötigt. Beginnen Sie mit 32 dki-Zellen bei 0,5 bis einer mal 10 der sechs Zellen pro Milliliter, die in optimalem Medium gezüchtet wurden.Angereichert mit fetalem Kälberserum, IL drei Tumor Capto Ethanol und Antibiotika. Überführen Sie viermal 10 hoch sechs Zellen in jeweils drei 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen. Stellen Sie die Röhrchen in die Zentrifuge und pelletieren Sie sie durch Zentrifugation bei 225 ×g für fünf Minuten bei 15 °C.Nach der Zentrifugation das Überstand entfernen, die Zellen in zwei Milliliter PBS bei Raumtemperatur resuspendieren und eine Zellsuspension mit 50 Mikromolar Calpain-Inhibitor PD 150606 behandeln. Sicherstellen, dass die Probe vor Licht geschützt ist, indem das Röhrchen mit Aluminiumfolie abgedeckt wird. Kurz vortexen und dann 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.Behandeln Sie die zweite Zellsuspension mit 20 µM des MEK-Inhibitors PD 98059. Impfen Sie die Zellen in einer 35-mm-Zellkulturschale aus und inkubieren Sie sie zwei Stunden bei 37 °C, während die Proben inkubiert werden. Beginnen Sie den Calpain-Assay an den unbehandelten Proben.Beginnen Sie damit, zwei Milliliter Nachweisreagenz zur Zellsuspension hinzuzufügen. Geben Sie sofort ein Milliliter der Mischung aus Zellsuspension und Nachweisreagenz in die zuvor vorbereiteten Fax-Röhrchen, um die Probe für T gleich null zu erzeugen. Inkubieren Sie die Zellsuspensionen mit dem Nachweisreagenz fünf Minuten lang.Bei Raumtemperatur ein Milliliter der Zellsuspensions-Detektionsreagenz-Mischung zu dem zuvor vorbereiteten FAX-Röhrchen mit einem Milliliter 1 % Paraformaldehyd hinzufügen, um die Probe „T gleich fünf“ zu erzeugen. Die verbleibenden Zellsuspensionen weiterhin für zusätzliche fünf Minuten bei Raumtemperatur mit der Detektionsmischung inkubieren. Nach fünf Minuten ein weiteres Mal ein Milliliter der Zellsuspension in ein vorbereitetes FAX-Röhrchen mit einem Milliliter 1 % Paraformaldehyd überführen.Dies ist der Zeitpunkt T = 10 Minuten. Führen Sie als Nächstes den Calpain-Assay an 30 mit Hemmstoffen behandelten 2D-Kit-Zellen erneut durch. Bedecken Sie das Rack mit Aluminiumfolie.Fixieren Sie die Zellen am nächsten Tag über Nacht im Dunkeln bei vier Grad Celsius. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 725 Gs für fünf Minuten bei 15 Grad Celsius. Nach dem Zentrifugieren aspirations das Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 750 Mikrolitern PBS.Stellen Sie die Zellen auf Eis und bewahren Sie sie im Dunkeln auf, bis die Durchflusszytometrie durchgeführt wird. Hier wird die Datenerfassung für fixierte Zellen gezeigt. Führen Sie die Durchflusszytometrie mit einem LSR zwei durch.Stellen Sie die Filter für die Lichtwelle zur Anregung oder die UV-Laseranregungslinie bei 355 Nanometern ein und setzen Sie die Laserleistung auf 25 Milliwatt mit einer Emission von 405 und 450 Nanometern für Substrat bzw. Produkt. Die verwendeten BAM-Bandpassfilter für Substrat und Produkt sollten 405/20 und 450/50 betragen. Die Langpassfilter für Substrat und Produkt sollten bei 405 und 450 liegen.Stellen Sie die PMT-Spannung für das Substrat auf 350 bis 375 und für das Produkt auf 325 bis 350 ein. Richten Sie ein BD-fax-diva-Experiment mit den folgenden Parametern ein: Vorwärtsstreuung Seitwärtsstreuung Indo eins blau mit logarithmischer Skala und ein violett.Verwenden Sie ebenfalls eine logarithmische Skala im Arbeitsblatt. Erstellen Sie die folgenden Diagramme: Ein Vorwärtsstreuung gegen Seitwärtsstreuung-Diagramm mit einem Gate für lebende Zellen.Ein Indo-one-Blau-Histogramm, ein Indo-one-Violett-Histogramm und ein Punktediagramm von Indo one Blau gegen Indo one Violett kalibrieren den LSR two mit einer Linienströmung und einer Linienströmung plus fluoreszierenden Kügelchen. Die PMT-Spannung sollte so eingestellt werden, dass der Peak des fluoreszierenden Kügelchen-Histogramms vor jedem Experiment im gleichen Kanal liegt. Beginnen Sie mit der Datenaufnahme unter Verwendung der 30 2D kit-Zellen zum Zeitpunkt null Minuten.Passen Sie die Parametereinstellungen bei Bedarf an. Erfassen und protokollieren Sie 10.000 Ereignisse pro Probe. Spülen Sie das Gerät mit FACS-Puffer und wiederholen Sie die Datenaufnahme für jede Probe.Exportieren Sie die Daten nach der Datenerfassung. Stellen Sie sicher, dass der LSR two gemäß den Richtlinien des Instituts gereinigt wird. Bereiten Sie die Zellsuspensionen wie zuvor vor, ohne das Nachweisreagenz oder den Calpain-Inhibitor hinzuzufügen.Bringen Sie die Proben zum LSR zwei und richten Sie die Filter und Parameter wie zuvor ein. Richten Sie das Arbeitsblatt wie zuvor ein. Fügen Sie ein großes Punktdiagramm hinzu, das Indo eins blau gegen die Zeit zeigt.Stellen Sie das Programm so ein, dass die maximale Anzahl an Ereignissen erfasst wird. Kein Stop-Gate. Geben Sie 50 Mikromolar Calpain-Inhibitor zu einer Zellsuspension von 32-G-Kit-Zellen hinzu.Halten Sie die Probe im Dunkeln und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 20 bis 30 Minuten, während die Zellen inkubiert werden. Beginnen Sie mit der Datenaufnahme an der 30 2D Kit-Zellsuspension ohne den Calpain-Inhibitor. Verwenden Sie eine niedrige Flussrate von 200 bis 300 Ereignissen pro Sekunde.Nach 30 Sekunden bis einer Minute das Röhrchen aus dem Gerät nehmen. Den Zellen 20 µM Bach LMC mac hinzufügen. Dies ist das Nachweismittel.Es wird spezifisch durch Calpain gespalten, und diese Spaltung führt zu einer Zunahme der Substratfluoreszenz-Wirbelbildung. Fahren Sie kurz darauf fort, die Daten zu erfassen. Erfassen Sie die Daten für 10 bis 20 Minuten oder bis die Calpain-Aktivität ein Plateau erreicht hat.Als Nächstes wiederholen Sie die Datenaufnahme mit 32 gki-Zellen, die mit Calpain-Inhibitor behandelt wurden. Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, exportieren Sie die Daten zur Analyse. Beginnen Sie den gemischten Zelltest mit einer Zellsuspension, die aus einer Mausmilz gewonnen wurde.Teilen Sie jede Zellsuspension in zwei Teile. Behandeln Sie eine Zellsuspension mit 50 Mikromolar Calpain-Inhibitor, bedecken Sie sie mit Folie und inkubieren Sie 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach Durchführung des Calpain-Assays wie zuvor für fixierte Zellen beschrieben, bedecken Sie die Röhrchen mit Folie und inkubieren die Zellen über Nacht bei vier Grad Celsius im Dunkeln.Am nächsten Tag bei 725 ×g fünf Minuten lang bei 15 °C zentrifugieren. Den Überstand abpipettieren, die Zellen in 500 µL PBS waschen und den Überstand erneut abpipettieren. Die Zellen in 200 µL Färbe-Puffer mit 2 % BSA resuspendieren und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Als Nächstes den Primärantikörper herstellen, hier ZI-anti-US.CD17 wird in Färbe-Puffer so hergestellt, dass die Endverdünnung 1:200 beträgt. Stellen Sie sicher, dass der Antikörper im Dunkeln aufbewahrt wird. Geben Sie 200 Mikroliter primären Antikörper zu den Zellen hinzu, inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.Fügen Sie anschließend 400 Mikroliter PBS hinzu, um das Volumen für die Durchflusszytometrie zu erhöhen. Stellen Sie die Zellen auf Eis und bewahren Sie sie im Dunkeln auf. Erfassen Sie die Daten mithilfe desselben Verfahrens der Durchflusszytometrie, das für fixierte Zellen gezeigt wurde.Fügen Sie ZI den Parametern hinzu und fügen Sie ein Histogramm für ZI auf dem Arbeitsblatt ein, nachdem die Daten am Durchflusszytometer erfasst wurden. Analysieren Sie mithilfe des FlowJo-Gates an lebenden Zellen basierend auf dem Vorwärts- und Seitenstreulichtprofil. Bestimmen Sie die mittlere Fluoreszenz von Indo Blue aus dem Gate der vitalen Zellen.In diesem Diagramm zeigt die rote Linie die mittlere Substratfluoreszenz bei null Minuten an, während die blaue und grüne Linie die mittlere Substratfluoreszenz bei fünf bzw. zehn Minuten anzeigen. Verwenden Sie für die gemischte Zellpopulation die FXI-Fluoreszenz in Histogrammen und Punktdiagrammen, um die 30 2D kip-Population zu identifizieren. Bestimmen Sie die mittlere Fluoreszenz für Endo Blau der 30 2D kip-Population.Verwenden Sie abschließend Microsoft Excel, um die mittlere Fluoreszenz grafisch darzustellen. Berechnen Sie die Steigung der Geraden zwischen fünf und zehn Minuten. Stellen Sie die Steigung als Balkendiagramm dar, um die Calpain-Aktivität in den Zellen zu bestimmen.Die hier gezeigten Daten deuten darauf hin, dass 30 2D-Zellen hohe Aktivitätsniveaus von Calpain aufweisen und dass die Calpain-Aktivität durch MEK-Inhibitoren gehemmt werden kann. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie die Calpain-Aktivität in fixierten und lebenden Zellen gemessen werden kann. Bei der Durchführung dieser Technik ist es wichtig, den LSR two korrekt einzurichten und das Gerät mithilfe fluoreszierender Kügelchen zu kalibrieren.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

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