Dechorionation von Medaka Embryonen und Zell-Transplantation für die Erzeugung von Chimären

Aufgrund der harten und weichen Chorion Embryonen, die Manipulation von Embryonen medaka ist mehr als in Zebrafisch beteiligt. Dieses Video zeigt Schritt-für-Schritt-Anleitungen, wie Sie medaka Embryonen zu manipulieren, einschließlich dechorionation, Montage in Agarose für die Bildgebung und-Transplantation für die Herstellung von Chimären. Diese Verfahren sind unerlässlich, um medaka und Zebrafisch in einem Labor zu verwenden, um vollen Nutzen aus ihren komplementären Funktionen für die genetische Dissektion Vertebratengenom Funktionen übernehmen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Klone in einem Embryo zu erzeugen, um die Autonomie eines Gens oder Proteins von Interesse zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem Spenderembryonen mit Rod Domine Dextran durch Mikroinjektion in einem Zellstadium markiert werden, wie im Begleitvideo zu diesem Video, der Mikroinjektion von Maka-Embryonen, gezeigt. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, sowohl die Spender- als auch die Empfängerembryonen in das richtige Stadium zu entwickeln.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, sowohl die Embryonen der Spenderin als auch der Empfängerin zu beschichten. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, Zellen aus den markierten Spenderembryonen in die Embryonen der Empfängerin zu transplantieren. Letztendlich können Ergebnisse durch die Analyse der Verteilung, Proliferation und Differenzierung von Klonen und transplantierten Zellen durch den Nachweis transplantierter Zellen anhand ihrer Fluoreszenz- oder Abstammungstracer erzielt werden.

Hallo, ich bin Sean Brazinski aus dem Labor von Dr. Makoto Fki in der Abteilung für Biologie und Biochemie an der Universität von Bath. Ich bin auch aus dem Zeki-Labor. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Zelltransplantation in dunkle Fischembryonen.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um mit einem Gen oder einer Mutation von Interesse zu untersuchen, die eine zell- oder nicht-zellautonome Funktion hat. Also lasst uns loslegen. Verwenden Sie beim Beschichten von Maka-Eiern sterile Lösungen und Werkzeuge, um den Erfolg der Langzeitbeobachtung und -kultur zu verbessern.

Legen Sie ein Stück wasserfestes Schleifpapier der Körnung P 2000 in den Deckel einer neun Zentimeter großen, nicht haftenden Petrischale. Verwenden Sie eine Pipette für polierte Nudeln mit einer weiten Öffnung, um bis zu 10 frische, ungeclusterte, gereinigte und etikettierte Eier aus einer Schüssel mit Ei zu übertragen. Mittel zum Schleifpapier.

Überschüssiges Medium entfernen und gerade so viel in der Schüssel lassen, dass die Eier nicht austrocknen. Rollen Sie mit einer behandschuhten Fingerspitze 10 Eier auf einmal vorsichtig 45 bis 60 Sekunden lang über das Schleifpapier. Um die äußeren Oberflächenhaare zu entfernen und die Corian-Oberfläche einzuritzen, üben Sie minimalen Druck aus und halten Sie die Fingerspitze parallel zum Schleifpapier.

Übertragen Sie die Eier in die ursprüngliche Schüssel mit Medium. Entfernen Sie das Medium und bedecken Sie die Eier mit einer Lösung von 20 Milligramm pro Milliliter Bauchlage. Die Schüssel abdecken und bei 27 Grad Celsius 60 Minuten inkubieren.

Achten Sie darauf, die Schale schräg zu platzieren, damit die Embryonen ausreichend in das Enzym eingetaucht sind. Um den Enzymbedarf zu minimieren, verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, um Pronase für die Wiederverwendung zurückzugewinnen und auf Eis zu legen. Waschen Sie die Eier fünfmal mit einem Embryomedium, um alle Spuren von Anfälligkeit zu entfernen und zu verhindern, dass es das Schlüpfenzym verdaut.

Füge so viel Schlüpfenzym hinzu, dass die gewaschenen Eier bedeckt sind. Stellen Sie sicher, dass die Eier in einer einzigen Schicht auf dem Boden der Schüssel verbleiben, um ein Zerquetschen beim Auflösen des Corians zu vermeiden. Die Eier bei 27 Grad Celsius ausbrüten.

Achten Sie darauf, die Schale schräg zu platzieren, damit die Embryonen ausreichend in das Enzym eingetaucht sind. Um den Fortschritt der Enzymkontrolle unter einem Präparier-Stereomikroskop zu minimieren, entstehen ähnliche Löcher in der inneren Schicht des Corian, bevor er sich vollständig auflöst. Der Vorgang kann je nach Enzymaktivität bis zu 60 Minuten dauern.

Wenn ein kleiner Teil des Corian aufgelöst ist, saugen Sie sofort das einzelne Ei mit einer Pipette auf, um eine Verdauung des Embryos durch das schlüpfende Enzym zu vermeiden. In eine saubere Schale mit einmal BSS geben, indem Sie die Spitze der Pipette vorsichtig mit einer sauberen Schale mit einmal BSS berühren und das Ei ausrollen lassen, um die Übertragung des Schlupfenzyms zu minimieren. Entferne mit einer Pinzette den Rest des Corians, wenn alle Eier vom Schlüpfenzym übertragen wurden.

Machen Sie eine letzte Übertragung auf ein neues Gericht von einmal BBSS. Fügen Sie Antibiotika hinzu, wenn die Embryonen in ein späteres Stadium der Embryonalentwicklung gebracht werden sollen. Beginnen Sie nach der Dekoration für dieses Verfahren 1,5 Stunden vor der Transplantation mit der Decoat-Beschichtung der Embryonen im Stadium 12. Geben Sie mit einer Pipettenspitze eine kleine Menge 3%ige Methylcellulose in die Mitte eines Hohlraummikroskops.

Schieben Sie eine neun Zentimeter große Petrischale hinein. Verteile die Flüssigkeit dünn auf der Oberfläche der Vertiefung. Trocknen Sie die Methylcellulose zwei Minuten lang.

Füllen Sie die Objektträgervertiefung mit 350 Mikrolitern sterilem einmaligem BSS unter einem Präpariermikroskop. Verwenden Sie eine Pipette aus feuerpoliertem Glas mit breitem Mund, um einen Spender und bis zu vier Empfängerembryonen auf den Objektträger zu übertragen. Richten Sie die Embryonen mit einer Haarschlaufe so aus, dass das Blaster-Derm nach oben zeigt.

Lehnen Sie die Embryonen aneinander, um die Stabilität zu gewährleisten, falls erforderlich. Führen Sie vorsichtig eine Mikronadel in den Spenderblaster ein. Derm. Nehmen Sie langsam 10 bis 20 Zellen auf.

Führen Sie nun die Nadel vorsichtig in den entsprechenden Bereich des Empfängerembryos ein Blaster derm und stoßen Sie die Spenderzellen langsam aus. Stören Sie nicht die Begrenzung des Cellosacks. Füllen Sie die Petrischale vorsichtig mit ca. 30 Millilitern sterilem einmaligem BSS, um die Embryonen einzutauchen und die Embryonen von der Methylcellulose zu lösen.

Gießen Sie gegen den Rand der Schale, um die Embryonen nicht zu stören. Geben Sie 100 Mikroliter Penicillin-Streptomycin in die Schüssel für eine ungefähre Konzentration von 0,3 %Decken Sie die Schüssel ab. Beobachten Sie die Embryonen bei Bedarf regelmäßig.

Für längere bildgebende Untersuchungen wie Zeitraffer und detaillierte Beobachtungen betten Sie lebende beschichtete Embryonen in aros ein und betäuben Sie lebende Embryonen, um Bewegungen zu verhindern, indem Sie dem Medium, das die Embryonen enthält, ein artgerechtes Anästhetikum zusetzen. Schmelzen Sie etwa einen Milliliter von 3 %. Der niedrige Schmelzpunkt entsteht in einem mal BSS und hält ihn bei 37 Grad Celsius. Falls erforderlich, fügen Sie eine angemessene Menge Anästhetikum zu den Aros hinzu, um ein Zucken zu verhindern Schnelles Arbeiten, um eine Verfestigung zu verhindern, verwenden Sie eine Weithalspipette, um die Kappe zu füllen. Vertiefung eines Mikrozentrifugenröhrchens mit aros.

Verwenden Sie eine Weithalspipette, um einen beschichteten und betäubten Embryo in den Aros in der Kappe zu bewegen. Übertragen Sie so wenig Medium wie möglich mit dem Embryo. Aktualisieren Sie sofort den Aros und den Embryo und bringen Sie sie in eine 3,5 Zentimeter große Petrischale mit Glasboden.

Füllen Sie die Schüssel in eine 14 Zentimeter große Schale, die zu einem Drittel mit einer Mischung aus Eis und Wasser gefüllt ist. Halten Sie die kleinere Schale fest an den Boden der größeren Schale unter ein Präparier-Stereomikroskop. Verwenden Sie eine Haarschlaufe, um den Embryo schnell wie gewünscht auszurichten.

Halten Sie den Embryo still, bis sich der Agro verfestigt. Der Embryo kann nun abgebildet werden. Bild A zeigt einen Spender- und Empfängerembryo unmittelbar nach der Transplantation.

Auf der rechten Seite ist der Spenderembryo mit einer komplett rot beschrifteten Gipsdermaus zu sehen. Der Empfängerembryo ist auf der linken Seite zu sehen und leicht an der kleinen Masse der roten transplantierten Zellen zu erkennen, die im Blaster-Derm zu sehen ist. Bild B zeigt zwei Empfängerembryonen etwa sieben Stunden nach der Transplantation. Beachten Sie, dass die transplantierten Zellen von der Transplantationsstelle gewandert sind und nun über den Blaster verteilt sind.

Dermbild C zeigt den Embryo einer Empfängerin im Stadium 29. Beachten Sie die Pigmentierung im Auge und das Vorhandensein von mefor im Rumpf- und Gehirnbereich. Es ist zu sehen, dass die mit dem Stäbchen markierten Zellen viele der embryonalen Strukturen besiedeln, was auf die erfolgreiche Produktion einer Chimäre hinweist.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Meca-Fischembryonen isst und eine Zelltransplantation in einem frühen embryonalen Stadium durchführt. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, Ihre Spenderzellen in den richtigen Bereich des Empfängers zu transplantieren. Auf diese Weise können sich Ihre Spenderzellen in den richtigen Zelltyp differenzieren.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.