Name: Dechorionation von Medaka Embryonen und Zell-Transplantation für die Erzeugung von Chimären (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-22T17:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Erfahren Sie die Dechorionation von Medaka-Embryonen und Zelltransplantation zur Erzeugung von Chimären. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung zellautonomer und nicht-zellautonomer Genfunktionen in der Entwicklungsbiologie.

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1. Entwicklung der Embryonen <ol><li> Wenn sie verlegt werden, sind Eier, weil der Befestigung Filamente auf dem Chorion geclustert. Zu vermieten Embryonen normal entwickeln, ist es notwendig, Eier trennen. Tangle und schneiden Befestigung Filamente, indem die Anlage Filamente mit zwei Pinzetten. </li><li> Nach unclustering sind Eier aus Kot und Algen abgetrennt und an die frische Embryo Medium bei einer maximalen Dichte von 40 Eiern pro 6cm Petrischale. </li><li> Medaka Embryonen entwickeln etwas langsamer als Zebrafisch bei 27 ° C. Der Zeitpunkt der Brut ist der Unterschied zwischen den beiden Arten; medaka Embryonen schlüpfen aus dem Chorion in 7 Tagen und beginnt sofort zu schwimmen und zu essen, während Zebrafischembryonen in 2 Tagen schlüpfen, sondern beginnen zu schwimmen und in 5-6 Tagen essen. Entwicklung von medaka ist nach Iwamatsu Inszenierung 4 statt. </li><li> Die Entwicklung der medaka Embryonen lassen sich bequem zu experimentellen Pläne werden durch eine entsprechende Temperatur eingestellt. Entwicklung von medaka Embryonen können bei 4 ° C in der frühen Entwicklung gestoppt werden. Nach Stufe 24, wenn Herzschlag beginnt, kann die Entwicklung verlangsamt mit einer Mindesttemperatur von 18 ° C betragen </li><li> Der Zeitpunkt des Auftretens der Organe / Gewebe ist etwas anders in medaka verglichen mit Zebrafisch, dh es kommt in medaka Somitogenese nach dem Beginn der Entwicklung des Gehirns während im Zebrafisch somitegenesis geht die Entwicklung des Gehirns. </li></ol> 2. Entfernen des Chorion Das Chorion der medaka besteht aus zwei Schutzschichten mit einer harten Innenschicht und einer weichen äußeren Oberfläche. So ist eine Zwei-Schritt-Protease-Behandlung unter Verwendung Pronase und Schraffuren Enzym notwendig, diese Chorion zu entfernen. Sobald dechorionated, Embryonen sollten in 1X BSS gehalten werden. Semi-sterilen Bedingungen wird erhöhen die erfolgreiche Kultur von dechorionated Embryonen, vor allem, wenn längere Beobachtung erforderlich sind. Dazu zählen mit sterilen Lösungen (zB sterilisiert 1X BSS mit Antibiotika) und Werkzeuge mit 70% Ethanol durch Spülen mit 1X BSS gefolgt sterilisiert. Als dechorionated medaka Embryonen weicher und zerbrechlicher als dechorionated Zebrafischembryonen sind, müssen besonders sorgfältig darauf zu achten, sie nicht berühren Luft oder Luftblasen in der Pipette, da diese unmittelbaren Zusammenbruch führen wird. Um sicherzustellen, minimaler Schädigung von Embryonen, sollte ein weitmündigen Wärme polierte Glaspipette mit Pipette zum Fördern Embryonen verwendet werden und ein Haar Schleife sollte genutzt werden, um Embryonen für die Beobachtung orientieren werden. Nichtadhärente Petrischalen sollten verwendet werden, um Embryonen aus verbundenen Flächen zu verhindern. <ol><li> Vor dechorionation sollte geprüft werden, die Eier wurden ausreichend getrennt und gereinigt-up sein. </li><li> Da beide Pronase und Schraffuren Enzyme Proteinasen sind, sollten sie auf Eis gehalten werden und Minimierung der Exposition von Embryonen, um diese Enzyme. </li><li> Transfer-Eier Schleifpapier (p2000 Korn, wasserdicht) in den Deckel eines 9cm Petrischale. Entfernen Sie überschüssiges Medium, sondern sorgen für eine ausreichende Lautstärke bleibt zu verhindern Trocknung von Embryonen. </li><li> Sanft rollen Embryonen für etwa 45-60 Sekunden, um einige der äußeren Oberfläche Haare zu entfernen und leicht Partitur der Oberfläche des Chorion (Abbildung 1). Transfer-Embryonen zurück zur ursprünglichen Petrischale und zu untersuchen. Beim Walzen von Embryonen auf Sandpapier den Zeigefinger zu verwenden, die Anwendung minimal Druck und halten den Finger parallel zur Oberfläche des Sandes Papier. Rollen Sie nicht mehr als 5-7 Embryonen auf einmal. Diese Vorsichtsmaßnahme wird das Risiko von Quetschungen Embryonen unter einander. </li><li> Ersetzen Ei Medium in Schale mit 20mg/ml Pronase und inkubieren Embryonen für 40-60 Minuten bei 27 ° C. Stellen Sie sicher, Embryonen sind ausreichend Pronase abgedeckt und ein Deckel auf dem Teller. Ungenutzte Pronase sollte auf Eis während dieser Schritt in die Selbständigkeit Verdauung zu minimieren gehalten werden und kann wiederverwendet, bis Aktivität verloren geht (ca. 1-2 Wochen) werden. </li><li> Recover Pronase für die Wiederverwendung und waschen Embryonen 5X in Embryo Medium, um Spuren von Pronase zu entfernen, da dies die Schraffur Enzym zu inaktivieren wird hinzugefügt werden. </li><li> Entfernen Embryo mittel-und Deckel Embryonen mit dem Schlüpfen Enzym, wodurch Embryonen sitzen als Monolayer in die Schüssel. Wenn Eier auf der Oberseite von einander sitzen in der Schale, werden diese an der Unterseite gebrochen als das Chorion auflöst. Bewahren Sie unbenutzte Schlüpfen Enzym auf Eis. </li><li> Inkubieren Embryonen bei 27 ° C und nach 15 Minuten regelmäßig die Fortschritte der Schlupf mit einem Stereomikroskop. Man wird sehen, dass eine Reihe von Mondkrater wie Löcher in der inneren Schicht des Chorion, die bald löst sich nach dieser Verlassen der weiche Außenschicht des Chorion leicht entfernt manuall erscheinen beginneny. Der gesamte Prozess der Schraffur kann 15-60 Minuten. </li><li> Sobald Embryonen aus dem Chorion kommen-Embryonen zu einer Petrischale mit 1X BSS. Stellen Sie sicher, nicht zu dem Schlüpfen Enzyms an das 1X BSS Übertragung durch Berührung der Spitze der Pipette auf die Oberfläche des BSS so dass die Embryonen vorsichtig ausrollen. </li><li> Sobald alle Embryonen aus dem Schlüpfen Enzym übertragen werden, um eine endgültige Übertragung auf ein anderes frisches Gericht 1X BSS. Dadurch wird sichergestellt, Embryonen nicht auf irgendwelche Reste von Schraffuren Enzym ausgesetzt, da dieser exponierten Embryonen beschädigt wird. Nachdem in diesem letzten Gericht keine Embryonen noch im Besitz der äußeren Schicht des Chorion kann manuell befreit Verwendung sterilisiert Mikro-Pinzette unter dem Stereomikroskop. Wenn Embryonen entwickelt folgende dechorionation werden müssen, sollten Penicillin / Streptomycin auf die BSS hinzugefügt werden, um das Bakterienwachstum zu verhindern. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Vergleich von Walz-und abgerollt Embryonen während dechorionation. Beobachten Sie, wie das gerollte Embryonen in Panel B die Haare auf dem entrollten Embryonen in Panel A. gesehen Mangel 3. Montage dechorionated Embryonen Agarose eingebettet ist für längere Bildgebung (z. B. Time-Lapse-Imaging) für Live-Embryonen sowie für detaillierte Beobachtungen der festen Embryonen sinnvoll. Während der Gastrulation und der frühen Organogenese (Stufe 14 bis Stufe 28), weisen medaka Embryonen Wellen von rhythmischen Bewegungen über die kontraktilen Periderm, eine Gewebeschicht, die sowohl den sich entwickelnden Embryo und das Eigelb 5. Die Embryonen werden mit 3,5-mm-1-Heptanol behandelt zu stoppen kontraktilen Bewegungen 6. So stoppen Sie Bewegung der Embryonen nach der Stufe 28 (64hpf) sind Embryonen betäubt, indem Tropfen Tricaine mesilate (TMS) vor dem Einbetten. TMS ist auch für die Agarose hinzugefügt (add nur eine minimale Menge, die Dosis muss optimiert werden, etwa 1:25 Verdünnung). <ol><li> Thaw eine kleine Menge von 3% niedriger Geliertemperatur Agarose (in 1X BSS) durch Erhitzen auf 37 ° C und bei dieser Temperatur zu halten. </li><li> Die folgenden Schritte müssen zügig werden, um sicherzustellen, dass die Agarose nicht vor Orientierung des Embryos zu verfestigen durchgeführt. Mit einem weitmündigen Glaspipette Transfer genug geschmolzene Agarose auf die Kappe von Depressionen ein Eppendorf-Röhrchen zu füllen. </li><li> Transfer ein dechorionated Embryo in die Kappe Depressionen zu minimieren, die mehr als BSS mit dem Embryo. Sofort-Aufnahme der Agarose und Embryo aus der Kappe Depression und Transfer in eine Petrischale Kultur Kammer. Ein 3,5 cm Petrischale mit einem Glasfenster am Boden verwendet wird. Für die Bildgebung mit Hilfe eines inversen Mikroskops, sind Embryonen ausgerichtet Körper nach unten und legte nahe dem Deckglas. Für die Bildgebung mit einem aufrechten Mikroskop, ist die Dicke der Agarose minimiert. </li><li> Übertragen Sie die 3.5cm Petrischale in eine 14cm Durchmesser Petrischale mit Eis und Wasser (auf etwa 1 / 3 Tiefe von insgesamt große Schüssel gefüllt). Während Sie die Kammer fest auf dem Boden des 14cm Petrischale mit einem Haar-Schleife, um sanft zu orientieren den Embryo als in der geschmolzenen Agarose gewünschten und halten den Embryo, bis die Agarose erstarrt durch leichtes Heben und Senken der kleineren Schüssel in seine ursprüngliche Position in das eiskalte Wasser. </li></ol> 4. Zell-Transplantation in medaka Embryonen Das Ziel dieses Verfahrens ist es, festzustellen, ob das Gen von Interesse Zell-autonome (innerhalb einer Zelle) oder nicht-zell-autonom (zwischen den Zellen) handelt. Spenderzellen mit einem Markierungsfarbstoff wie Rhodamin-Dextran vor der Transplantation (wie in der beiliegenden JoVE Protokoll "Mikroinjektion von Medaka Embryos" beschrieben) oder eine transgene Sorte mit GFP-Expression genutzt werden kann beschriftet werden, so dass die Transplantation Beurteilung. Eine Kombination beider Techniken Kennzeichnung ist oft nützlich, Autofluoreszenz, die auftreten können überwunden werden. Für Zeitraffer-Studien nach der Transplantation ist die GFP-Expression besonders nützlich. Verwenden Sie einen weitmündigen Glaspipette mit Pipette Pumpe während des gesamten Verfahrens und sterilisieren alle Werkzeuge (einschließlich Folien) zuvor mit 70% EtOH gefolgt von gründlichem Spülen mit steriler 1X BSS. Empfänger Embryonen sind in der Regel auf etwa Stufe 12 entwickelt, da dies ermöglicht Diskriminierung der ventralen und dorsalen Pole bei der Durchführung der Transplantation. <ol><li> Commence dechorionating Embryonen 1,5 Stunden vor der Transplantation und Setup Injektionsgeräts während Enzyminkubationen. </li><li> Legen Sie ein Hohlraum Objektträger in eine 9cm Durchmesser Petrischale. </li> Fügen Sie einen kleinen Betrag von 3% Methylcellulose in die Mitte des Hohlraums Rutsche mit einer sterilen Pipettenspitze und Verbreitung dünn. <li> Dry Methylcellulose für ca. 1-2 Minuten. </li><li> Fügen Sie 350μl steriles 1X BSS zu rutschen Depression zu füllen. </li><li> Transfer von einem Spender Embryo und bis zu vier Empfänger Embryonen, um die Folie mit einer Glaspipette. </li><li> Orientieren Embryonen mit einem Haar-Schleife so Blastoderm des Embryos nach oben zeigt. Embryonen können lehnte sich gegenseitig zu weiteren Erhöhung der Stabilität. </li><li> Schieben Sie die Micro-Nadel in Spenders Blastoderm und langsam Aufnahme 10-20 Zellen. </li><li> Schieben Sie Nadel in die gewünschte Fläche des Empfängers Embryo Blastoderm und vertreiben die Zellen langsam. Große Vorsicht ist geboten beim Einsetzen Zellen in den Rezipienten Blastoderm, um nicht die Zell-Dottersack Grenze zu stören, als dies in den Tod des Embryos führen wird. </li><li> Gießen sterilisiert 1X BSS in der Petrischale. Gießen Sie die BSS in Schale, um die Seite der Schale nah wie möglich, um nicht die Embryonen stören. Gießen Sie niemals die BSS direkt auf die Embryonen, und fügen Sie ausreichend BSS, dass der Schieber und Embryonen eingetaucht sind. </li><li> Add 100 &amp;mgr; von Penicillin / Streptomycin in die Schale und Deckel. Sorgfältig Transfer Gericht zu einer 27 ° C Inkubator für eine normale Entwicklung zu ermöglichen. </li><li> Embryonen können in regelmäßigen Abständen beobachtet werden, wie gewünscht. Bei der Verwendung von Transplantation durchzuführen gain-of-function-und / oder Phänotyp zu retten Experimente könnten einige morphologische Veränderungen beobachtet werden aufgrund der Auswirkungen der Transplantation. Somit können mehrere Transplantationen notwendig sind. Nach 2-3 Tagen sollten Melanophoren werden auf dem Dottersack, Kopf, Augen und des Rumpfes. Falls vorhanden auf transplantierten Embryonen dann eine erfolgreiche Chimäre hat höchstwahrscheinlich produziert worden (Abbildung 3). </li></ol> Wenn nötig, Genotyp Spender Embryo (s) durch Übertragung von PCR-Röhrchen (s) mit 25 &amp;mgr; l von 20mg/ml Proteinase K. Inkubation bei 55 ° C für 4 Stunden mit 10 Minuten bei 94 ° C und Durchführung der PCR. 5. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Beispiel Position eines Agarose eingebettete Embryo. Anterior ist auf der rechten Seite angezeigt und Ansicht ist dorsal. Panel B: Endothelzellen kann auf beiden Seiten des Embryos Körper gesehen werden und sind beschriftet mit GFP durch die fli-Promotor angetrieben. <img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Images of post-Transplantation Embryonen. Bild A zeigt einen Spender und Empfänger Embryo sofort nach der Transplantation. Der Spender Embryo ist auf der rechten Seite mit einem komplett roten Blastoderm (Pfeil) dargestellt. Der Empfänger Embryo ist auf der linken Seite gezeigt und ist leicht durch die geringe Masse der roten transplantierten Zellen sichtbar im Blastoderm (Pfeilspitze) identifiziert. Bild B zeigt zwei Empfänger Embryonen etwa 7 Stunden nach der Transplantation (bei 27 ° C). Beachten Sie die transplantierten Zellen vom Ort der Transplantation migriert und sind nun in der Blastoderm (Pfeile) verteilt. Bild C zeigt einen Empfänger Embryo st.29 (ca. 74hpf). Beachten Sie die Pigmentierung in die Augen und die Anwesenheit von Melanophoren in den Kofferraum und Hirnregion (Pfeile). Die Rhodamin-markierten Zellen sichtbar zu sein besiedeln viele der embryonalen Strukturen zeigt die erfolgreiche Produktion von einer Chimäre werden.

<ol><li>Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+genome-wide+screen+for+mutations+affecting+organogenesis+in+Medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes.</a> Mech Dev. 121, 647-658 (2004).</li>
<li>Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medaka+and+zebrafish%2C+an+evolutionary+twin+study%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study.</a> Mech Dev. 121, 629-6237 (2004).</li>
<li>Hirose, Y., Varga, Z. M., Kondoh, H., Furutani-Seiki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+lineage+and+regionalization+of+cell+populations+during+Medaka+neurulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Single cell lineage and regionalization of cell populations during Medaka neurulation.</a> Development. 131, 2553-2563 (2004).</li>
<li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+normal+development+in+the+medaka+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Zool+Sci%22%5BJournal%5D)">Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes.</a> Zool Sci. 11, 825-839 (1994).</li>
<li>Cope, J., Fluck, R., Nicklas, L., Plumhoff, L. A., Sincock, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stellate+layer+and+rhythmic+contractions+of+the+Oryzias+latipes+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">The stellate layer and rhythmic contractions of the Oryzias latipes embryo.</a> J Exp Zool. 254, 270-275 (1990).</li>
<li>Brend, T., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Whole+Mount+High-Resolution+Double+Fluorescent+In+Situ+Hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

In diesem Video zeigen wir, wie man dechorionate und durchzuführen Zelle transplanataion auf medaka Embryonen. Dies ist eine kraftvolle Technik, um chimäre Embryonen für die Untersuchung von Gen / Protein-Funktion während der Entwicklung als auch für die Aufklärung der Autonomie der Gen / Protein in Frage zu produzieren. Medaka sind ein nützliches Wirbeltier-Modellsystem für diese Technik aufgrund der gut etablierten Schicksal Karten und ihre Transparenz verleihen ihnen auch in vivo-Bildgebung in Echtzeit. Transplantation kann mit Mikroinjektion (wie in der beiliegenden JoVE Protokoll &quot;Mikroinjektion von Medaka Embryonen &#39;beschrieben), so dass das Verhalten der transplantierten Zellen leicht beobachtet werden können kombiniert werden.

<table><tbody><tr><td>Embryomedium</td><td>Reagenz</td><td>In Eigenherstellung</td><td>N/V</td><td>200 ml 50X-Stammlösung, 1 ml 1 % Methylenblau in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O/10 Liter RO-Wasser (50X-Stammlösung: NaCl 14,7 g, KCl 0,6 g, CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;·2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 2,4 g, MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;·7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 4,0 g pro Liter RO-Wasser)</td></tr><tr><td>Mikrodissektionspinzette</td><td>Werkzeuge</td><td>55 INOX A. DUMONT&amp;FILS</td><td>N/V</td><td>Sehr scharfe feine Spitzen zum Entfernen der Chorionhülle.</td></tr><tr><td>Feines wasserfestes Schleifpapier – Körnung p2000</td><td>Werkzeuge</td><td>Hermes Abrasives Ltd.</td><td>N/V</td><td>Sehr feine Körnung zum Rollen und Reinigen von Embryonen mit Chorion.</td></tr><tr><td>3 % Methylcellulose</td><td>Reagenz</td><td>Sigma</td><td>M 0512</td><td>Hohe Viskosität, um Embryonen während der Transplantation an Ort und Stelle zu halten.</td></tr><tr><td>1X BSS</td><td>Reagenz</td><td>In Eigenherstellung</td><td>N/V</td><td>20X BSS: 130 g NaCl, 8 g KCl, 4 g MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;·7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 4 g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;·2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O und 10 mg Phenolrot in 1 L MilliQ-Wasser, autoklaviert; 500 mM Hepes in MilliQ-Wasser, autoklaviert. Geben Sie 25 ml 20X BSS und 15 ml 500 mM Hepes (pH 7,0) hinzu, auffüllen auf 500 ml und vor Gebrauch filtrieren und sterilisieren.</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Reagenz</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Wird BSS zugesetzt, wenn entchorionierte Embryonen inkubiert werden.</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Reagenz</td><td>Calbiochem</td><td>53702</td><td>Zur Entchorionierung.</td></tr><tr><td>Brutenzym</td><td>Reagenz</td><td>In Eigenherstellung</td><td>N/V</td><td>Zur Entchorionierung.</td></tr><tr><td>Tricainmesilat (TMS)</td><td>Reagenz</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td>400 mg Tricain in 97,9 ml destilliertem Wasser und 2,1 ml 1 M Tris, pH auf 7 eingestellt; 4,2 ml dieser Lösung in 100 ml sauberem Beckenwasser.</td></tr><tr><td>3 % Agarose mit ultraniedriger Geliertemperatur</td><td>Reagenz</td><td>Sigma</td><td>A-2576</td><td>Typ IX-A. Wird beim Einbetten von Embryonen zur Beobachtung verwendet.</td></tr><tr><td>Kulturschale aus Petrischale</td><td>Werkzeug</td><td>Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.</td><td>11-004-008</td><td>Iwaki-Glasbodenschale 35 mm mit 12 mm Fenster. Wird beim Einbetten von Embryonen zur Beobachtung verwendet.</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Gerät</td><td>Narishige</td><td>N/V</td><td>Modell MN151. Zum Entfernen und Einsetzen von Zellen während der Transplantation.</td></tr><tr><td>Borosilikat-Glaskapillaren</td><td>Werkzeug</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC100-10T</td><td>Zur Herstellung von Transplantationsnadeln.</td></tr><tr><td>Flammen-/Brown-Mikropipettenzieher</td><td>Gerät</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Modell P-97</td><td>Zur Herstellung von Transplantationsnadeln.</td></tr></tbody></table>

dechorionation von medaka embryonen und zell-transplantation für die erzeugung von chimären

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka ist eine kleine eierlegende Süßwasserfische, dass sowohl genetische und embryologische Analysen ermöglicht und ist eines der drei Wirbeltiere Modell-Organismen in die genomweite Phänotyp-driven Mutantenscreens out 1 durchgeführt wurden. Divergenz der funktionellen Überlappung von Genen zwischen medaka und Zebrafisch ermöglicht die Identifizierung von neuen Phänotypen, die nicht identifizierbar sind in einer einzigen Spezies 2, also medaka und Zebrafisch sind komplementär zur genetischen Dissektion der Vertebratengenom Funktionen. Manipulation von Embryonen medaka, wie dechorionation, Montage Embryonen für die Bildgebung und Stammzelltransplantation, sind wichtige Verfahren, die auf beiden medaka und Zebrafisch in einem Labor arbeiten. Zell-Transplantation untersucht Zelle Autonomie medaka Mutationen. Chimären sind durch die Transplantation von markierten Zellen vom Spender Embryonen in unbeschrifteten Empfänger Embryonen erzeugt. Donor-Zellen können auf bestimmte Bereiche des Empfängers Embryonen auf das Schicksal Karten 3 basiert, so dass Klone aus transplantierten Zellen können in das Gewebe von Interesse bei der Entwicklung integriert werden umgepflanzt werden. Aufgrund der harten und weichen Chorion Embryonen, die Manipulation von Embryonen medaka ist mehr als in Zebrafisch beteiligt. In diesem Video zeigen wir detaillierte Verfahren zur medaka Embryonen zu manipulieren.

Aufgrund der harten und weichen Chorion Embryonen, die Manipulation von Embryonen medaka ist mehr als in Zebrafisch beteiligt. Dieses Video zeigt Schritt-für-Schritt-Anleitungen, wie Sie medaka Embryonen zu manipulieren, einschließlich dechorionation, Montage in Agarose für die Bildgebung und-Transplantation für die Herstellung von Chimären. Diese Verfahren sind unerlässlich, um medaka und Zebrafisch in einem Labor zu verwenden, um vollen Nutzen aus ihren komplementären Funktionen für die genetische Dissektion Vertebratengenom Funktionen übernehmen.

Dechorionation von Medaka Embryonen und Zell-Transplantation für die Erzeugung von Chimären

Medaka ist ein kleiner, eierlegender Süßwasserfisch, der sowohl genetische als auch embryologische Analysen ermöglicht und einer der drei Wirbeltier-Modellorganismen in ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Klone in einem Embryo zu erzeugen, um die Autonomie eines Gens oder Proteins von Interesse zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem Donorembybryonen im Ein-Zell-Stadium durch Mikroinjektion mit Rodamin-Dextran markiert werden, wie im Begleitvideo zu diesem Video, der Mikroinjektion von Maka-Embryonen, gezeigt. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, sowohl Donor- als auch Empfängerembryonen bis zum richtigen Entwicklungsstadium heranzuzüchten.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, sowohl die Embryonen des Spenders als auch die der Empfänger zu beschichten. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Transplantation von Zellen aus den markierten Spenderembryonen in die Embryonen der Empfänger. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, indem die Verteilung, Proliferation und Differenzierung von Klonen transplantierten Zellen analysiert werden, wobei die transplantierten Zellen anhand ihrer Fluoreszenz oder Linienstammmarker nachgewiesen werden.Hallo, ich bin Sean Brazinski aus dem Labor von Dr. Makoto Fki am Department für Biologie und Biochemie der University of Bath. Ich bin außerdem aus dem Zeki-Labor. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Zelltransplantation in dunklen Fischembryonen.Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um zu untersuchen, ob ein Gen oder eine Mutation von Interesse eine zellautonome oder nicht zellautonome Funktion hat. Beginnen wir also. Verwenden Sie beim Beschichten von Maka-Eiern sterile Lösungen und Werkzeuge, um den Erfolg langfristiger Beobachtung und Kultur zu verbessern.Legen Sie ein Stück wasserdichtes Schleifpapier mit 2000er Körnung in den Deckel einer neun Zentimeter großen nicht-anschmierenden Petrischale. Verwenden Sie eine Pipette mit weitem Mund und feuerpolierter Spitze, um bis zu 10 frisch entklumpfte, gereinigte und markierte Eier aus einer Schale mit Eimedium auf das Schleifpapier zu übertragen.Entfernen Sie überschüssiges Medium, sodass gerade genug in der Schale verbleibt, um ein Austrocknen der Eier zu verhindern. Benutzen Sie die behandschuhte Fingerspitze, um jeweils 10 Eier sanft 45 bis 60 Sekunden über das Schleifpapier zu rollen. Um Haare von der Oberfläche zu entfernen und die Corian-Oberfläche leicht einzuritzen, wenden Sie minimalem Druck an und halten Sie die Fingerspitze parallel zum Schleifpapier.Überführen Sie die Eier in die ursprüngliche Schale mit Medium. Entfernen Sie das Medium, bedecken Sie die Eier mit einer Lösung von 20 Milligramm pro Milliliter Prone. Bedecken Sie die Schale und inkubieren Sie sie bei 27 Grad Celsius für 60 Minuten.Stellen Sie sicher, dass die Petrischale schräg positioniert wird, damit die Embryonen ausreichend in das Enzym eingetaucht sind. Um die benötigte Menge an Enzym zu minimieren, verwenden Sie eine Plastik-Transferpipette, um Pronase zur Wiederverwendung aufzufangen, und stellen Sie es auf Eis. Spülen Sie die Eier fünfmal mit Embryonenmedium, um alle Rückstände von Pronase zu entfernen, um zu verhindern, dass es das Schlüpfenzum verdaut.Fügen Sie so viel Schlüpfenzym hinzu, dass die gewaschenen Eier bedeckt sind. Achten Sie darauf, dass die Eier in einer einzigen Schicht auf dem Boden der Schale liegen bleiben, um zu verhindern, dass sie zerdrückt werden, während der Corian sich auflöst. Inkubieren Sie die Eier bei 27 Grad Celsius.Stellen Sie sicher, dass die Petrischale schräg positioniert wird, damit die Embryonen ausreichend im Enzym eingetaucht sind. Um die benötigte Enzymmenge zu minimieren, überprüfen Sie den Fortschritt unter einem stereoskopischen Auflichtmikroskop; gleichartige Löcher erscheinen in der inneren Schicht des Corions, bevor diese vollständig aufgelöst ist. Der Vorgang kann je nach Enzymaktivität bis zu 60 Minuten dauern.Wenn ein kleiner Teil des Chorions aufgelöst ist, saugen Sie sofort das einzelne Ei mit einer Pipette auf, um die Verdauung des Embryos durch das Schlüpfenzym zu verhindern. Überführen Sie es in eine saubere Schale mit einmaliger BSS, indem Sie die Pipettenspitze vorsichtig an eine saubere Schale mit einmaliger BSS anlehnen und das Ei herausrollen lassen, um die Übertragung des Schlüpfenzyms zu minimieren. Entfernen Sie mit einer Pinzette den Rest des Chorions, nachdem alle Eier aus dem Schlüpfenzym überführt wurden.Überführen Sie abschließend in eine neue Schale mit einmaligem BBSS. Fügen Sie Antibiotika hinzu, wenn die Embryonen bis zu einem späteren Stadium der embryonalen Entwicklung gebracht werden sollen. Beginnen Sie 1,5 Stunden vor der Transplantation mit der Entcoating-Prozedur für Stadium-12-Embryonen. Geben Sie mit einer Pipettenspitze eine kleine Menge 3 % Methylcellulose in die Mitte einer Hohlraum-Mikroskopschale.Schieben Sie eine Petrischale mit neun Zentimeter Durchmesser ein. Verteilen Sie die Flüssigkeit dünn über die Oberfläche der Vertiefung. Trocknen Sie das Methylcellulose zwei Minuten lang. Füllen Sie die Vertiefung des Objektträgers mit 350 Mikrolitern sterilem einmaligem BSS unter einem Stereomikroskop. Verwenden Sie eine weitmundige, flammenglasierte Glaspipette, um einen Spender und bis zu vier Empfänger-Embryonen auf den Objektträger zu übertragen. Richten Sie die Embryonen mit einer Haarschleife so aus, dass das Blasterm nach oben zeigt.Stellen Sie die Embryonen gegebenenfalls zur Stabilisierung gegeneinander ab. Führen Sie eine Mikronadel vorsichtig in den Donor-Blaster.Derm ein. Saugen Sie langsam 10 bis 20 Zellen auf.Nun setzen Sie die Nadel vorsichtig in den entsprechenden Bereich der Empfängerembryonenblaste ein und spritzen Sie langsam die Donorzellen ein. Stören Sie nicht die Grenze des Keimbeutels. Füllen Sie die Petrischale vorsichtig mit etwa 30 Milliliter steriler 1×-BSS-Lösung, um die Embryonen zu bedecken und sie aus der Methylcellulose zu lösen.Geben Sie die Flüssigkeit an die Seite der Petrischale, um die Embryonen nicht zu stören. Fügen Sie 100 µL Penicillin-Streptomycin in die Schale ein, um eine ungefähre Konzentration von 0,3 % zu erreichen. Decken Sie die Schale ab. Überprüfen Sie die Embryonen nach Bedarf in regelmäßigen Abständen.Für längere Bildgebungsstudien wie Zeitrafferaufnahmen und detaillierte Beobachtungen embedden Sie lebende, beschichtete Embryonen in Agarose und betäuben Sie lebende Embryonen, um Bewegungen zu verhindern, indem Sie ein stadiengerechtes Anästhetikum dem Medium mit den Embryonen hinzufügen. Schmelzen Sie etwa ein Milliliter 3 %iger Niedrigschmelzpunkt-Agarose in 1× BSS und halten Sie es bei 37 °C. Falls erforderlich, geben Sie eine geeignete Menge Anästhetikum zur Agarose hinzu, um Zuckungen zu verhindern. Arbeiten Sie schnell, um Verfestigung zu vermeiden, und füllen Sie mithilfe einer Pipette mit breiter Spitze die Vertiefung einer Mikrozentrifugenprobe mit Agarose.Verwenden Sie eine Pipette mit großem Mund, um ein beschichtetes und anästhesiertes Embryo in das aros in der Kappe zu überführen. Übertragen Sie so wenig Medium wie möglich zusammen mit dem Embryo. Aktualisieren Sie sofort das aros und das Embryo und bringen Sie sie in eine 3,5 cm große Petrischale mit Glasboden.Überführen Sie die Petrischale in eine 14 cm große Schale, die zu einem Drittel mit einer Mischung aus Eis und Wasser gefüllt ist. Halten Sie die kleinere Schale unter einem Stereomikroskop fest auf den Boden der größeren Schale gedrückt. Orientieren Sie das Embryo mit einer Haarschleife schnell in der gewünschten Weise. Halten Sie das Embryo ruhig, bis das Agar erstarrt ist. Das Embryo kann nun abgebildet werden. Abbildung A zeigt ein Spender- und Empfängerembryo unmittelbar nach der Transplantation.Das Spenderembryo ist rechts dargestellt, mit einem vollständig rot markierten Plaster-Derm. Das Empfängerembryo ist links zu sehen und lässt sich leicht anhand des kleinen roten Zelltransplantats erkennen, das im Blaster-Derm sichtbar ist. Abbildung B zeigt zwei Empfängerembryonen etwa sieben Stunden nach der Transplantation. Beachten Sie, dass sich die transplantierten Zellen von der Transplantationsstelle wegbewegt haben und sich nun über das gesamte Blaster verteilt haben.Derm-Bild C zeigt ein Empfänger-Embryo im Stadium 29. Beachten Sie die Pigmentierung im Auge und das Vorhandensein von Mefor im Rumpf- und Gehirnbereich. Die mit Rod-Domäne markierten Zellen sind in vielen embryonalen Strukturen nachweisbar, was auf die erfolgreiche Erzeugung eines Chimäras hinweist.Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Zebrafisch-Embryonen hält und bei einem frühen embryonalen Entwicklungsstadium eine Zelltransplantation durchführt. Bei dieser Prozedur ist es wichtig, darauf zu achten, die Donorzellen in den korrekten Bereich des Empfänger-Blastulas zu transplantieren. Dadurch können sich die Donorzellen in den richtigen Zelltyp differenzieren.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für gezielte chimären Zebrafischembryonen durch die Transplantation erzeugt an der Blastula oder Gastrula-Stadium.

Generieren Chimäre Zebrafischembryonen durch Transplantation

Zebrafisch-Transplantation ermöglicht die Kombination von Genetik und Embryologie an gewebespezifischen Chimären zu erzeugen. Dieses Video zeigt Gastrula inszeniert zelltransplantationen, dass es unserem Labor auf den Rollen von astroglialen Bevölkerung und spezifische Anleitungen Cues während Kommissur Bildung im Vorderhirn zu untersuchen.

Tissue Gezielte Embryonale Chimären: Zebrafisch Gastrula Cell Transplantation

Wir zeigen, ein Protokoll zu chimären Zebrafischembryonen für Live-Imaging-zelluläres Verhalten während der Embryogenese zu generieren.

Die Transplantation von GFP-exprimierenden Blastomeren für Live Imaging von Retinal und Entwicklung des Gehirns in Chimäre Zebrafischembryonen

Medaka und Zebrafisch sind für die genetische Dissektion Vertebratengenom Funktionen ergänzen. Dieses Protokoll werden die wichtigsten Punkte für eine erfolgreiche Mikroinjektion in medaka Embryonen eine wichtige Technik für embryologische und genetische Analyse mit medaka und Zebrafisch in einem Labor.

Mikroinjektion von Medaka Embryonen für die Verwendung als Modell Genetic Organism

Ein Ansatz zur Analyse von Migration und schließlich das Schicksal der aviären Neuralleistenzellen in Wachtel-Küken chimären Embryos beschrieben wird. Diese Methode ist eine einfache und unkomplizierte Technik zum Aufspüren Neuralleistenzellen während der Migration und Differenzierung, die sonst schwer zu unmanipulierten innerhalb eines Hühnerembryo zu unterscheiden sind.

Die Analyse der Neuralleiste Migration und Differenzierung von Cross-Spezies Transplantation

Kleine Laborfische sind zu beliebten Modellen für die Knochenforschung über die Mechanismen, die menschlichen Knochenerkrankungen zugrunde liegen, und für das Screening von knochenmodulierenden Medikamenten geworden. In diesem Bericht beschreiben wir ein Protokoll zur Beurteilung der Wirkung von Alendronat auf Knochenzellen bei Medaka-Larven mit osteoporotischen Läsionen.

Medikamentöse Behandlung und<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging von Osteoblasten-Osteoklasten-Wechselwirkungen in Medaka-Fisch Osteoporose Modell

Live Verfolgung einzelner WT retinalen Progenitoren in verschiedenen genetischen Hintergründen ermöglicht die Bewertung des Beitrags der Zelle nicht autonomen Signalisierung während der Neurogenese. Hier wird eine Kombination von Knock-Down, Chimäre Generation über Embryo - Transplantation und in - vivo - Zeitraffer-konfokale Abbildung wurde für diesen Zweck verwendet.

In - vivo - Bildgebung von Expression Transgene Gene in einzelnen Retinal Vorläufern in Chimäre Zebrabärblingembryonen Studie Zellnichtautonome Einflüsse

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Erhöhung der Chimäre Produktion ohne den Einsatz von neuen Geräten. Eine einfache Orientierung Änderung des Embryos zur Injektion kann erhöhen Sie die Anzahl der erzeugten Embryonen und potenziell reduzieren die Timeline Germline Übertragung.

Trans-innere Zelle Masse Injektion von embryonalen Stammzellen führt zu höheren Chimerism Raten

Dieses Ziel dieses Protokolls ist es, chimäre Axolotle mit haploiden Vorderbeinen aus Cas9-mutagenisiertem Spendergewebe unter Verwendung embryonaler Gewebetransplantationstechniken zu produzieren.

Generation von Chimeric Axolotls mit Mutant Haploid Limbs Durch Embryonale Grafting

Embryologische Manipulationen wie Exstirpation und Transplantation von Zellen sind wichtige Werkzeuge, um die frühe Entwicklung zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt ein einfaches und effektives Transplantationsgerät, um diese Manipulationen in Zebrafischembryonen durchzuführen.

Ein einfaches und effektives Transplantationsgerät für Zebrafischembryonen

Erfahren Sie die Dechorionation von Medaka-Embryonen und Zelltransplantation zur Erzeugung von Chimären. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung zellautonomer und nicht-zellautonomer Genfunktionen in der Entwicklungsbiologie.

Dechorionation von Medaka Embryonen und Zell-Transplantation für die Erzeugung von Chimären

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