Name: Label-freie In situ Imaging der Verholzung in pflanzlichen Zellwänden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Lernen Sie die konfokale Raman-Mikroskopie zur markierungsfreien Bildgebung der Verholzung in pflanzlichen Zellwänden. Diese Methode ermöglicht zerstörungsfreie Analysen für die Bioenergieforschung.

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Wir danken Andrew Carroll, Bright Chaibang, Purbasha Sarkar (Energy Biosciences Institute, Berkeley), Bahram Parvin (Lawrence Berkeley National Laboratory) und Vincent L. Chiang (North Carolina State University) für eine fruchtbare Zusammenarbeit und hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde von der Energy Biosciences Institute unterstützt. Die Arbeit in der Molecular Foundry wurde durch das Office of Science, Office of Basic Energy Sciences des US Department of Energy unter Vertrag Nr. DE-AC02-05CH1123 unterstützt.

1. Probenvorbereitung <ol><li> Montieren Sie die Anlage hydratisiert Probe, z. B. Pappel Stammholz oder Arabidopsis thaliana Stamm, in dem Mikrotom. </li><li> Cut Dünnschliffen (typischerweise 20 &amp;mgr; m dick) aus dem nativen Gewebe. </li><li> Übertragen Sie die Teilanlage auf einen Glasobjektträger. </li><li> Weichen Sie das Anlagenteil in D 2 O und mit einem Deckglas, das auf den Objektträger versiegelt wird, um die Verdampfung des D 2 O. verhindern Die Anlage Abschnitt ist nun bereit für die Bildgebung oder es kann für eine spätere Verwendung gespeichert werden. </li></ol> 2. Probenmessung <ol><li> Bewerben Immersionsöl zum Mikroskopobjektiv und / oder das Deckglas. </li><li> Ort und sichern die Objektträger auf dem piezoelektrischen Scan des Mikroskops, mit dem Deckglas vor dem Mikroskopobjektiv. </li><li> Sehen Sie sich die Probe durch das Deckglas mit einer hohen numerischen Apertur Eintauchen Mikroskop-Objektiv (100x, NA = 1,40) und suchen Sie die Probe Gebiet von Interesse. </li><li> Nach dem Ausschalten aller anderen Labor-und Mikroskop-Lichtquellen, ortsaufgelöste mikrospektroskopischen Messungen werden durch die Fokussierung bandpassgefilterten monochromatisches grünes Licht (λ = 532 nm) aus einem cw-Laser auf die Probe mit einer typischen Leistungsaufnahme von 10 bis 30 mW durchgeführt ( siehe Abbildung 1 für eine schematische Darstellung der Einrichtung). Autofluoreszenz kann in einigen Proben kommen, die brauchbare Messungen zu verbieten, in welchem ​​Fall der Anregung mit langwelliger Laserlicht kann es ratsam sein. </li><li> Die rückgestreuten Stokes-Raman verschobenen Licht durch das Mikroskop-Objektiv gesammelt, geht durch einen dichroitischen Spiegel, eine Lochkamera, die als räumliche Filter in der konfokalen Aufbau dient, und ein Langpassfilter und wird in den Schlitz eines Gitters konzentriert Spektrometer, wo das Licht spektral zerlegt und detektiert wird durch eine gekühlte CCD-Kamera, so dass ein Raman-Spektrum. Ein Raman-Spektrum von Pappelholz ist in Abbildung 2 gezeigt, mit charakteristischen Lignin Bands im Spektralbereich zwischen 1.600 und 1.700 cm -1. </li><li> Für die chemische Bildgebung und Visualisierung der räumlichen Verteilung Lignin ist ein zweidimensionales spektrale Karte von Rastern der Probe durch den Laserfokus mit dem piezoelektrischen Scan Bühne und die Aufnahme eines Raman-Spektrum für jede Probe Position erworben. Dreidimensionale spektrale Karten kann durch Stapeln zweidimensionale Karten, für die der Laserfokus nacheinander entlang der z-Richtung wurde verstärkt erzeugt werden. </li></ol> 3. Data Analysis <ol><li> Für die chemische Bildgebung und Lignin Visualisierung, werden die erhobenen Daten analysiert mit Hilfe von MATLAB (MathWorks, Version 7,7). Die Daten werden in einem dreidimensionalen hyperspectral Würfel, welche der beiden räumlichen Dimensionen und eine dritte Dimension für die spektrale Signale zusammen angeordnet ist. </li><li> Für das Lignin Analyse wird der Spektralbereich von 1550 und 1700 cm -1 berücksichtigt werden (siehe Abbildung 2). Die räumliche Verteilung von Lignin wird visualisiert durch die Integration der Intensität von 1.550 bis 1.700 cm -1 der Baseline-korrigierten Spektren (siehe Abbildung 3). Als Alternative zur Baseline-Korrektur kann der zweiten Ableitung Spektren berechnet und der zweiten Ableitung Gipfel zur Analyse verwendet. </li><li> . Lignin Lokalisierung und Chemie, insbesondere im Hinblick auf coniferaldehyde und Coniferylalkohol-Einheiten können weitere durch die Auswertung der Fläche unter ausgestattet Gauß-Peaks der drei Bänder zwischen 1.600 und 1.700 cm -1 gefunden (siehe Einschub in Abbildung 2 und Refs 15 analysiert werden - 17). </li><li> Intensity Normalisierung zwischen verschiedenen spektralen Karten erfolgt über ein Verweis auf die Peakhöhe des extrinsischen OD-Bande rund 2.500 cm -1 im Durchschnitt Lumen-Spektren, die durch k-means Clustering Klassifizierung erhalten werden. Dies ist entscheidend und ermöglicht es, Lignin Signalintensitäten zwischen verschiedenen Messungen, Gewebe, Proben und Arten zu vergleichen. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Ein Vertreter Raman-Spektrum von Pappel (Populus angustifolia) Stammholz ist in Abbildung 2 dargestellt. Charakteristisch Lignin Bands sind im Spektralbereich zwischen 1.600 und 1.700 cm -1 gefunden. Als Beispiel ist die räumliche Verteilung von Lignin in einer Pappel Querschnitt in Abbildung 3 dargestellt. Verglichen mit dem sichtbaren Bild, werden morphologisch Zellwand Regionen deutlich unterscheidbar durch verschiedene Lignin Signalintensität. Hohe Lignin Signalintensität in der Zelle Ecken (CC) zu beobachten und, etwas weniger, in der Verbindung Mittellamellen (CML). Niedrigere, aber nicht unerhebliche, Mengen von Lignin sind innerhalb der S2 Wandschicht der Fasern beobachtet. Variabilität von Lignin Signalintensität zu einem gewissen Grad in CC, CML und S2 gefunden, vor allem von Faser zu Faser. Die laterale räumliche Auflösung in unseren Messungen ist ~ 300 nm. Die Qualität der Daten eignet sich gut zur Verholzung zwischen vergleichenBeispiele und weitere sezieren Ligninchemie 15. <img src="/files/ftp_upload/2064/2064fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1: Eine schematische Darstellung der instrumentalen Setup BP:. Bandpass-Filter, DM: dichroitischen Spiegel, PH: Lochkamera, LP: Langpassfilter. <img src="/files/ftp_upload/2064/2064fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2: Ein Vertreter Raman-Spektrum von Pappel (Populus angustifolia) Stammholz in D 2 O aufgenommen. Der hervorgehobene Spektralbereich (siehe auch Kasten) markiert den Spektralbereich mit drei Gipfeln zuordenbare Lignin. <img src="/files/ftp_upload/2064/2064fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3: Raman Lignin Bild (unten) einer Pappel Querschnitt (oben: sichtbares Bild), durch die Integration der Raman-Signal-Intensität von 1.550 bis 1.700 cm -1 erhalten.

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</ol>

Lignocellulose-Materialien sind hierarchische und heterogene sowohl im Hinblick auf Struktur und Zusammensetzung. Für eine eingehende Charakterisierung analytische Tools, die chemische Empfindlichkeit, räumliche Auflösung, und das haben, geben Einblick in diese Materialien in der nativen Kontext sind wünschenswert. Das beschriebene Verfahren bietet die Visualisierung von Lignin und Vergleich der Verholzung von Lignocellulose-Biomasse-Anlage mit einer räumlichen Auflösung, die Sub-um-ohne Färbung oder die Kennzeichnung d...

<table><tbody><tr><td>Mikroskopische Objektträger</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nagellack</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersionsoil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Feinpinsel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Raman-Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

label-freie in situ imaging der verholzung in pflanzlichen zellwänden

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

Meeting wachsenden Energiebedarf sicher und effizient ist eine dringende globale Herausforderung. Deshalb hat sich die Forschung in die Produktion von Biokraftstoffen, die kosteneffiziente und nachhaltige Lösungen zu finden sucht sich einen aktuellen und kritischen Aufgabe. Lignocellulose-Biomasse ist bereit, die primäre Quelle von Biomasse für die Umstellung auf flüssige Biokraftstoffe 1-6 geworden. Jedoch stellt die Widerspenstigkeit dieser pflanzlichen Zellwand Materialien zu kostengünstigen und effizienten Abbau ein großes Hindernis für ihre Verwendung bei der Herstellung von Biokraftstoffen und Chemikalien 4. Insbesondere wird Lignin, eine komplexe und unregelmäßige poly-Phenylpropanoid Heteropolymer, problematisch, die Ernte Dekonstruktion von Lignocellulose-Biomasse. Zum Beispiel in die Umwandlung von Biomasse für Biokraftstoffe, hemmt es Verzuckerung in Prozesse bei der Herstellung einfacher Zucker für die Gärung 7 ausgerichtet. Die effektive Nutzung pflanzlicher Biomasse für industrielle Zwecke ist in der Tat weitgehend auf das Ausmaß, in dem die pflanzliche Zellwand ist verholzt. Die Entfernung von Lignin ist ein kostspieliges und limitierende Faktor 8 und Lignin ist daher ein wesentlicher Pflanzenzüchtung und Gentechnik Ziel geworden, um Zellwand der Konvertierung zu verbessern. Analytische Werkzeuge, die die genaue schnelle Charakterisierung der Verholzung der Zellwände von Pflanzen erlauben zunehmend an Bedeutung für die Beurteilung einer großen Anzahl von Populationen. Extractive Verfahren zur Isolierung von nativen Komponenten wie Lignin sind zwangsläufig zerstörerisch, bringt über wesentliche chemische und strukturelle Modifikationen 9-11. Analytische Chemie in-situ-Verfahren sind somit wertvolle Werkzeuge für das kompositorische und strukturelle Charakterisierung von Lignocellulose-Materialien. Raman-Mikroskopie ist eine Technik, die auf unelastisch oder Raman-Streuung von monochromatischem Licht setzt, wie aus einem Laser, wenn die Verschiebung in Energie des Lasers Photonen Molekülschwingungen verbunden ist und stellt eine intrinsische label-free molekularen &quot;Fingerabdruck&quot; der Probe . Raman-Mikroskopie kann nicht-destruktiv und vergleichsweise kostengünstige Messungen mit minimaler Probenvorbereitung leisten, mit Einblicken in chemische Zusammensetzung und die molekulare Struktur in der Nähe von nativen Zustand. Chemical Imaging mittels konfokaler Raman-Mikroskopie wurde bereits für die Visualisierung der räumlichen Verteilung von Cellulose und Lignin im Holz Zellwände 12-14 verwendet. Basierend auf diesen früheren Ergebnissen haben wir kürzlich diese Methode, um Verholzung in Wildtyp-und Lignin-defizienten transgenen Populus trichocarpa (schwarz Pappel) Stammholz 15 Vergleichen angenommen. Die Analyse der Lignin Raman-Banden 16,17 im Spektralbereich zwischen 1.600 und 1.700 cm -1, Lignin Signalintensität und Lokalisation wurden in situ abgebildet. Unser Ansatz visualisiert Unterschiede in Ligningehalt, Lokalisierung und chemische Zusammensetzung. Vor kurzem haben wir gezeigt, Raman Imaging von Zellwandpolymere in Arabidopsis thaliana mit lateraler Auflösung, die Sub-um ist 18 Jahre. Hier ist diese Methode vorgestellt affording Visualisierung von Lignin in pflanzlichen Zellwänden und den Vergleich der Verholzung in verschiedenen Geweben, Mustern oder Arten ohne Färbung oder die Kennzeichnung der Gewebe.

Eine Methode der konfokalen Raman Mikroskopie basiert vorgestellt, bietet label-free-Visualisierung von Lignin in pflanzlichen Zellwänden und den Vergleich der Verholzung in verschiedenen Geweben, Mustern oder Arten.

Label-freie In situ Imaging der Verholzung in pflanzlichen Zellwänden

Die sichere und effiziente Deckung des wachsenden Energiebedarfs ist eine dringende globale Herausforderung. Daher zielt die Forschung zur Produktion von Biokraftstoffen darauf ab, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Lignifizierung in Pflanzenzellwänden direkt abzubilden und mit einer räumlichen Auflösung im Submikrometerbereich zu vergleichen, und zwar ohne Färbung oder Markierung der Proben und unter Erhaltung eines nahezu nativen Zustands. Dies wird erreicht, indem zunächst dünne Schnitte des nativen Gewebes mit einem Mikrotom angefertigt werden. Im nächsten Schritt wird eine spektrale Karte des interessierenden Bereichs der Probe im konfokalen Raman-Mikroskop aufgenommen. Dies wird erreicht, indem Rasta die Probe abtastet und für jede Probenposition ein Ramanspektrum aufzeichnet. Der letzte Schritt besteht darin, den Spektraldatensatz zu analysieren und chemische Bilder zu berechnen, in denen die räumliche Verteilung von Lignin durch Integration der Intensität spezifischer Ramanbanden dargestellt wird, die molekularen Schwingungen des Lignins zuzuordnen sind. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die räumliche Verteilung von Lignin ohne Anfärbung oder Markierung der Proben zeigen.Mithilfe der konfokalen Raman-Mikroskopie können die Lignin-Signalintensitäten zwischen verschiedenen Messungen, Geweben, Proben und Arten ve

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Forschung

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Biology

Biologie

Pflanzlicher Biomasse ist ein wichtiger klimaneutrale erneuerbare Ressource, die für die Herstellung von Biokraftstoffen verwendet werden könnten. Pflanzliche Biomasse besteht im Wesentlichen aus Zellwände, eine strukturell komplexen Verbundwerkstoff bezeichnet Lignocellulose. Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine umfassende Analyse des Inhalts und der Zusammensetzung der Polyphenol-Lignin.

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In diesem Video beschreiben wir die Maule-Färbetechnik zur Färbung von Syringyllignin, das in den spezialisierten Pflanzenzellen vorhanden ist. Diese Färbetechnik hilft bei der Charakterisierung der Ligninverteilung im Xylem und in den interfaszikulären Fasern.

Maule-Färbung für Lignin: Eine Technik zur Charakterisierung der Ligninverteilung in Stammschnitten von Arabidopsis thaliana

Die Zusammensetzung der pflanzlichen Zellwand variiert je nach Gewebetyp und kann Lignin, Zellulose, Hemicellulosen und Pektin umfassen. Es wurden verschiedene Färbetechniken entwickelt, um Unterschiede auf Zelltypebene sichtbar zu machen. Dieser Artikel ist eine Zusammenstellung häufig verwendeter Techniken zur Zellwandfärbung.

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