Name: Beurteilung der Herzfunktion und Energetik in isolierten Maus-Herzen mit 31 P-NMR-Spektroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-31T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die Herzfunktion und Energetik in isolierten Maus-Herzen mit 31P-NMR-Spektroskopie bewerten. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Messung von Hochleistungsphosphaten und kardialer Funktion in Echtzeit.

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Die Autoren bedanken sich bei Lynne Spencer für ihre Unterstützung danken während der NMR-Spektroskopie Teil des Experiments. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health Fund R01 HL059246, R01 HL067970, R01 HL088634 (zu Dr. Tian) und F32 HL096284 (Dr. Kolwicz) unterstützt.

<ol><li> Für diese Experimente werden zwei getrennte Systeme genutzt gleichzeitig. Für den Erwerb von 31 P-Spektren wird ein Bruker 14T Magnet Schnittstelle mit dem Avance III-Konsole und einen Computer mit TopSpin V2.1 Software ausgestattet. Für die Beurteilung der Herzfunktion ist ein custom built Herz Perfusion System über Schnittstellen mit den PowerLab 4 / 30 Datenerfassung, mit der LabChartPro 6 Software für die Datenanalyse ausgestattet. </li><li> 0,5 mM EDTA, 5,3 KCl, 1,2 MgSO 4, 118mm NaCl und 25 mM NaHCO 3: Am Tag des Experiments wird 1 Liter Krebs-Henseleit-Puffer wie folgt hergestellt. Die Mischung wird dann mit 5% CO 2 / 95% O 2 für 10-15 Minuten vor der Zugabe von 2 mM CaCl 2 geleitet. Schließlich Substrate in Form von 10 mM Glukose und 0,5 mM Pyruvat, hinzugefügt werden. </li><li> Temperaturregelung während des Experiments ist von entscheidender Bedeutung. Beheizte Umwälzpumpen werden verwendet, um die Temperatur zwischen 37,0 pflegen - 37,5 ° C, während das Herz im Inneren des Magneten ist. Die Temperatur ist für die Dauer des Experiments mit einem faseroptischen Temperatursensor überwacht. </li><li> Perfusionsdruck und linksventrikulärer Druck werden über Drucksensoren an ein Datenerfassungssystem und angezeigt mit der mitgelieferten Software überwacht. Diese sind mit einem Standard-Blutdruckmessgerät vor dem Experiment kalibriert. Darüber hinaus sind Druckleitungen ausreichend, um alle Luftblasen zu entfernen gespült. </li><li> Ein Standard-Probe von 150 mM Natriumphosphat (was gleichbedeutend ist mit der Ionenstärke der KH-Puffer) wird verwendet, um "kalibrieren" der Sonde vor dem Einsetzen des Herzens. Dies erleichtert das Signal und verringert die notwendige Zeit, um den Erwerb Zeitraum beginnen, sobald das Herz in der Sonde positioniert ist. </li><li> Zur Verringerung der Koagulation wird die Maus mit 200 Einheiten Heparin IP Nach 5 Minuten, Natrium-Pentobarbital (175 mg / kg) IP gegeben injiziert. </li><li> Das Herz ist stark ausgeschnitten (mit Lungen und der Thymusdrüse intakt) und verhaftet in eiskaltem KH-Puffer. </li><li> Während auf Eis gehalten, sind die Lungen schnell entfernt. Die Lappen des Thymus identifiziert und sanft zurück in die Aorta aussetzen geschält. Der Thymus ist entfernt. Die Aorta wird dann durch vorsichtiges Entfernen von umgebenden Gewebe isoliert. </li><li> Micro Naht Pinzette werden verwendet, um sanft halten beide Wände der Aorta in das Lumen aussetzen. Die Aorta ist sorgfältig auf die Kanüle aus 0,965 mm OD Polyethylen-Schlauch (PE50) gemacht platziert. Die Aorta ist in Ort mit einem Mikro-Behälter Klammer gehalten, während Nähte schnell um die Aorta gebunden sind. Der Clip wird entfernt und die Zangen werden verwendet, um sorgfältig zu prüfen, dass die Kanüle über Aortenwurzel ist. Zusätzliche Verbindungen werden als notwendig, um das Herz in Position zu halten aufgenommen. </li><li> Alle zusätzlichen Gewebe entfernt mit einer Pinzette und Mikroschere. Durch einen kleinen Schnitt in der linken Ohrmuschel. Ein 0,61 mm OD Polyethylen-Schlauch (PE10) ist vorsichtig durch den linken Vorhof, LV Hohlraum, und durch den Scheitelpunkt eingefügt werden, während sanft hält das Herz. Die überschüssige Schlauch wird getrimmt. </li><li> Ein deflationiert mit Wasser gefüllten Ballon wird durch das Atrium in die LV eingesetzt und ist in Ort mit Klebeband oder Fäden gehalten. Die Schlauchpumpe Geschwindigkeit schrittweise erhöht, um eine ausreichende Strömung des Herzens geben. Bis das Herz ist Platz in der NMR-Sonde, wird das Herz auch weiterhin mit konstantem Durchfluss entspricht etwa 2 ml / min perfundiert werden. Die LV Ballon wird mit einem kleinen Volumen mit einem Mikrometer Spritze, um sicherzustellen, dass die LV Druckwandler funktioniert aufgeblasen. </li><li> Das Herz ist vorsichtig in eine 10 mm-NMR-Rohr eingesetzt. Eine große Bohrung "Spinner" wird verwendet, um zu helfen, die Röhre in die richtige Position innerhalb der Sonde. Die gesamte Apparatur wird dann fest mit der "Nabelschnur" mit Klebeband befestigt. </li><li> Die Nabelschnur wird langsam in die obere Bohrung des Magneten abgesenkt, bis das Herz / NMR-Rohr ist im Inneren der Spule des 10 mm-NMR-Sonde. </li><li> Sobald das Herz in die richtige Position innerhalb der Sonde ist die Schlauchpumpe flow angepasst, um ein Perfusionsdruck von 80mmHg zu erreichen. (Denken Sie daran, dass bis zu diesem Zeitpunkt das Herz mit einem konstanten Durchfluss von ca. 2 ml / min wurde perfundierten). Der Perfusionsdruck wird dann, indem Sie die "Hold"-Mechanismus auf die Pumpe-Controller erhalten. Das Herz wird dann 15-20 Minuten Äquilibrierung Frist. Während dieser Zeit ist das Volumen des LV Ballon angepasst, um eine End-diastolische Druck von 8-10 mmHg zu erreichen. </li><li> Während der Aquilibrierungsperiode, ist es notwendig, das Spektrometer Parameter zu optimieren, um die bestmögliche Phosphor Signal zu erhalten. Dies geschieht, indem die Funk-Impuls bei der Frequenz, bei dem die Phosphor-Kern schwingt ("Tuning") und macht das Magnetfeld homogen ("Shim") durchgeführt. </li><li> Nach der Equilibrierung Zeitraum können mehrere 31 P-NMR-Spektren erhalten werden. Der Erfassungszeitraum für jedes Spektrum ist abhängig von ter Feldstärke des Magneten, die Größe der Probe, und das Signal-Rausch-Verhältnis für ein bestimmtes Experiment erforderlich. Spectra werden unter Verwendung eines 14 Tesla Magnet durch Mittelung des Signals von 256 Hochfrequenzpulse von 20 us mit einem 60-Grad-Flip-Winkel und Verzögerungen von 2,0 Sekunden erreicht. Dieses Experiment erfordert ca. 10 min. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Von der Hardware zur Datenerfassung und die LabChart Software, können verschiedene Parameter der Herzfunktion während des experimentellen Protokolls gemessen werden. Die typische Maßnahme der Herzfunktion, der linksventrikulären entwickelten Druck (LVDevP), durch Subtraktion der enddiastolische Druck (EDP) von der systolische Druck (Abbildung 1). Diese Maßnahme kann je nach Belastung der Maus und der Zustand des Herzens (dh Druck Überlast). Doch in einem normalen C57BL6 Mäuseherzen LVDevP ist in der Regel zwischen 100-110 mmHg zu festen end-diastolischen Druck von 8-10 mmHg. Darüber hinaus ermöglicht die LabChart Programm für die Messung der Herzfrequenz auf den zyklischen Messungen der LV Druckwellen basiert. Auch hier kann diese Maßnahme variieren, aber typische Werte sind 350-400 bpm, wenn Herzen erlaubt wird, auf intrinsische Preise schlagen. Allerdings können Herz standardisiert werden mit einer Stimulation System, in dem die Herzfrequenz bei 420 Schlägen pro Minute gehalten wird. Darüber hinaus können Maßnahmen der Kontraktilität (+ dP / dt) und Entspannung (-dP/dt) unter Verwendung der ersten Ableitung des LV Druckwelle werden. Während des experimentellen Protokolls ist es leicht, den Starling-Mechanismus durch den Einbau eines Druck-Volumen-Verhältnis zu bewerten. Dies wird durch schrittweise Erhöhung der LV Ballonvolumen und in Anbetracht der LVDevP sowie der EDV durchgeführt. Diese Werte können dann dargestellt, wie in Abbildung 2 dargestellt werden. Während die Starling-Kurve optimal ist, unter Hinweis auf die notwendige Volumen zu einem EDV von 8-10 mmHg zu erreichen kann eine indirekte Idee der LV Kammer Dimension zu geben. Dies kann in Modellen der Aorten-banding als hypertrophierten Herzen verwendet werden typischerweise eine kleinere Ballon Volumen erfordern, während dilatierten Herzen ein größeres Volumen benötigt, wenn im Vergleich zu Kontrollen. Tabelle 1 zeigt repräsentative Herzfunktion Daten während der Perfusion Protokoll übernommen. Die 31 P-NMR-Spektrometer liefert Signale von Phosphokreatin (PCr) und die drei Phosphate aus ATP (γ-ATP, α-ATP und β-ATP) sowie anorganisches Phosphat (Pi), wie in Abbildung 2 dargestellt. Analyse von jedem dieser Gipfel stellt einen Wert für die Fläche unter der Kurve. Die Höhe des ATP wird durch Mittelung der γ-ATP und β-ATP Bereichen geschätzt. (Die α-ATP wird nicht verwendet, weil NAD-Moleküle zu einem unbekannten Teil der gesamten Signal beitragen). Die energetische Zustand des Herzens ist durch den Quotienten aus der PCr und ATP Bereichen (: ATP-Verhältnis PCr) bestimmt. Dieser Wert wird in der Regel 1,5 bis 1,7 in einem Maus-Herz mit Glukose als primäre Substrat zugeführt. Obwohl 31 P NMR nicht zur Verfügung stellt direkte Maßnahmen der ATP oder PCR wird die Fläche der Peaks proportional zur Menge der Phosphor-enthaltenden Verbindungen in der Probe. Die Werte für diese Signale können durch die Verwendung anderer Methoden geschätzt werden. Zum Beispiel können direkte Messungen der ATP durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) in einer Kohorte von Herzen ergeben eine durchschnittliche Konzentration. Dieser Wert kann dann verwendet werden, um die durchschnittliche ATP Bereiche in den Spektren zu kalibrieren. Die PCR-Konzentration kann auf Basis der PCR-Bereich in Bezug auf die ATP-Bereich berechnet werden. Es ist auch möglich, pH-Wert durch die Analyse der relativen chemischen Verschiebung des anorganischem Phosphat (Pi) Signal an die PCR-Signal zu schätzen. 1 Mit verschiedenen Radio-Pulssequenzen, die Kreatin-Kinase Reaktionsgeschwindigkeit oder die ATP-Synthese Reaktionsgeschwindigkeit kann auch gemessen werden. Be 2 <img src="/files/ftp_upload/2069/2069tab1.jpg" alt="Tabelle 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabelle 1"> Tabelle 1. Baseline Herzfunktion aus isoliert perfundierten Herzen. LVDevP: linksventrikulären entwickelten Druck; LVEDP: linksventrikulären enddiastolischen Druck, HR: Herzfrequenz; RPP: rate pressure product; + dP / dt: erste Ableitung LV Druck positiv; -dP/dt: erste Ableitung LV Druck negativ; PP : Perfusionsdruck; CF: Koronarfluss. <img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Representative LV Druckwellen aus LabChart Pro Software. <img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Representative Starling-Kurven von der Steuerung (durchgezogene Linie) und Aorten-gebändert (gepunktete Linie) Mäusen. A) Der systolische Funktion als durch LVDevP über zunehmende LV Volumina dargestellt als durch das Volumen des LV Ballon bestimmt. B) Der diastolische Funktion als von EDV über zunehmende LV Volumina dargestellt als Volumen des LV Ballon bestimmt. LVDevP: linksventrikulären entwickelten Druck (systolischer minus diastolischer pressure); EDV: enddiastolischen Druck. <img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Representative 31 P NMR-Spektren der isolierten perfundierten Maus Herzen. Beachten Sie die relativ kleine Pi Höhepunkt. In einem aerob perfundierten Herzen mit Pyruvat oder Fettsäuren zusätzlich zu Glukose versorgt, sollte diese Spitze minimal sein. Während der Dauer der Ischämie, diese Spitze erhöht, während die PCr Spitze ab. Beachten Sie die Schulter an der rechten Seite der α-ATP Höhepunkt. Dies ist der Beitrag der NAD-Moleküle. Pi: anorganischem Phosphat; PCr: Phosphokreatin, ATP: Adenosintriphosphat.

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</ol>

31 P-NMR-Spektroskopie in der Langendorff-perfundierten isolierten Maus Herz bietet eine zuverlässige und reproduzierbare Daten. 3, 4 Allerdings ist es unerlässlich, dass Kanülierung der Aorta und der Einführung des LV Ballon fertig sind richtig wie eine stabile Herzfunktion zu ermöglichen, während im Inneren der NMR Rohr. Darüber hinaus ist Temperaturregulierung, um einen ordnungsgemäßen Baseline-Funktion zu erreichen im Vordergrund. Ein wichtiger Faktor bei der Beschaffung von guten, auswertbare NMR-Spektren ist die Erhöhung der Signal-Rausch-Verhältnis. Dies kann durch eine optimale &quot;Tuning&quot; und &quot;Shim&quot; auf die Probe erreicht werden. Wie im Protokoll Text erwähnt, kann die Verwendung eines Standard-Probe vor dem Einsetzen des Herzens dies erleichtern. Es ist auch hilfreich, um eine ausreichende Größe &quot;Probe&quot; zu haben. Herzen mit einem Gewicht von weniger als 100 mg bieten in der Regel niedrigere PCr und ATP-Signale so erhöht sich bei der Aufnahmezeit wird notwendig sein, um gute Phosphor-Spektren zu erhalten. Es gibt mehrere Möglichkeiten, die bestehenden Protokoll zu ändern, um zusätzliche Informationen über die Herzfunktion und Energetik zu sammeln. In unserem Labor haben wir Herzen mit gemischten Substrat Puffer, die das Vorhandensein von verschiedenen Kombinationen von Fettsäuren (in niedrigen und hohen Konzentrationen), Laktat, Ketone und Insulin enthalten kann perfundiert. Mit dem Einsatz von stabilen Isotopen in der Perfusionspuffer (dh 13 C markierten Substraten), wir die Möglichkeit, Substrat-Verwertung durch den relativen Beitrag von markiertem Acetyl-CoA zu den TCA-Zyklus Schätzung besitzen. 5-7 Für diese Anwendung führen wir Isotopomer Analyse von 13 C3-und 13 C4-Glutamat mit 13 C-NMR-Spektroskopie. Dies erfordert freeze-Spannen des Herzens am Ende der Perfusion-Protokoll und die Durchführung einer Extraktion des gefrorenen Gewebe. Dies wird ein weiterer Versuch der Analyse der Verwendung einer anderen Sonde mit separatem Setup-Parameter erfordert. Andere Anwendungen umfassen die Substitution von Glucose mit Desoxyglucose in der Puffer während der Überwachung des zeitabhängigen Akkumulation von 2-Desoxyglucose Phosphat im Herzen mit 31 P-NMR-Spektroskopie. Diese Methode ermöglicht die Messung der myokardialen Glukoseaufnahme. 7, 8 Darüber hinaus hat unser Labor Herzfunktion und Energetik in Perfusion Protokolle aus der Ischämie / Reperfusion und hohe Arbeitsbelastung Herausforderung analysiert. 6, 8-10 Zusammenfassend ist 31 P-NMR-Spektroskopie in isolierten Mäuseherzen eine technisch anspruchsvolle Verfahren erfordern den Einsatz von hoch entwickelten Geräten. Allerdings werden die Daten, dass es Erträge von unschätzbarem Wert für den Forscher, der die Funktion und Energetik von biotechnologisch Mausmodellen analysieren will. Für unser Labor wurden diese Techniken in unser Verständnis der Konsequenzen aus einer Vielzahl von Stressoren auf die Herzfunktion, die Energetik und Stoffwechsel von entscheidender Bedeutung. 1, 11, 12

<table><tbody><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1644</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4505</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dihydrat</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Ultrashield 600WB Plus</td><td>Gerät</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank"&gt;PowerLab 4/30&lt;/a&gt;</td><td>Gerät</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank"&gt;ML866/P&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/" target="_blank"&gt;LabChart 6 Pro&lt;/a&gt;</td><td>Gerät</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/" target="_blank"&gt;MLS260/6&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/FE224/" target="_blank"&gt;Quad Bridge Amp&lt;/a&gt;</td><td>Gerät</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/FE224/" target="_blank"&gt;ML224&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/research/product/ML175/" target="_blank"&gt;STH Pump Controller&lt;/a&gt;</td><td>Gerät</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/research/product/ML175/" target="_blank"&gt;ML175&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML172/" target="_blank"&gt;Minipuls 3 Peristaltikpumpe&lt;/a&gt;</td><td>Gerät</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML172/" target="_blank"&gt;ML172&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT0699/" target="_blank"&gt;Einweg-Blutdruckmesswandler&lt;/a&gt;</td><td>Gerät</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT0699/" target="_blank"&gt;MLT0699&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>10-mm-NMR-Probenröhrchen</td><td>Gerät</td><td>Wilmad LabGlass</td><td>513-7PP-7</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylen-Schlauch PE10</td><td>Gerät</td><td>BD Biosciences</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT844/" target="_blank"&gt;Physiologischer Druckwandler&lt;/a&gt;</td><td>Gerät</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT844/" target="_blank"&gt;MLT844&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylen-Schlauch PE50</td><td>Gerät</td><td>BD Biosciences</td><td>427411</td><td></td></tr><tr><td>Mikrometerspritze</td><td>Gerät</td><td>Gilmont Instruments</td><td>GS-1101</td><td></td></tr><tr><td>McPherson-Präparationspinzette</td><td>Gerät</td><td>Miltex Inc.</td><td>18-949</td><td></td></tr><tr><td>Castraviejo-Mikroschere</td><td>Gerät</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5650</td><td></td></tr><tr><td>Neoptix-Signalverstärker</td><td>Gerät</td><td>Neoptix, Inc.</td><td>Reflex - 1</td><td></td></tr></tbody></table>

beurteilung der herzfunktion und energetik in isolierten maus-herzen mit 31 p-nmr-spektroskopie

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Biotechnologisch Mausmodellen haben mächtig geworden Recherche-Tools bei der Bestimmung kausaler Zusammenhänge zwischen molekularen Veränderungen und Modelle von Herz-Kreislauf-Erkrankung. Obwohl der Molekularbiologie ist notwendig, in denen die wichtigsten Änderungen in den Signalweg, ist es nicht ein Surrogat für funktionelle Bedeutung. Während Physiologie Antworten auf die Frage nach der Funktion bereitstellen kann, die Kombination von Physiologie mit biochemischen Beurteilung der Metaboliten in die intakte, schlagende Herz erlaubt ein vollständiges Bild der Herzfunktion und Energetik. Seit Jahren hat unser Labor isolierten Herzen Infusionen mit Kernspinresonanz (NMR)-Spektroskopie kombiniert, um diese Aufgabe zu erfüllen genutzt. Die linksventrikuläre Funktion wird von Langendorff-Modus isolierten Herzen Perfusionen beurteilt, während kardiale Energetik, indem gemessen wird<sup&gt; 31</sup&gt; P Magnetresonanz-Spektroskopie des perfundierten Herzen. Mit diesen Techniken können Indizes der kardialen Funktion in Kombination mit einem Gehalt an Phosphokreatin und ATP gleichzeitig in schlagenden Herzen gemessen werden. Darüber hinaus können diese Parameter überwacht, während physiologische oder pathologische Stressoren eingeleitet werden. Zum Beispiel kann Ischämie / Reperfusion oder hohe Arbeitsbelastung Herausforderung Protokolle angenommen werden. Die Verwendung von Aorten-banding oder andere Modelle der kardialen Pathologie apt auch. Unabhängig von der Varianten innerhalb des Protokolls kann die funktionelle und energetische Bedeutung der molekularen Modifikationen von transgenen Mausmodellen adäquat beschrieben werden, was zu neuen Einsichten in die damit verbundenen enzymatischen und Stoffwechselwege. Daher<sup&gt; 31</sup&gt; P-NMR-Spektroskopie in der isoliert perfundierten Herzen ist eine wertvolle Forschungs-Technik in Tiermodellen von Herz-Kreislauf-Erkrankung.

Langendorff-Modus isolierten Herzen Perfusion, in Verbindung mit<sup&gt; 31</sup&gt; P-NMR-Spektroskopie, kombiniert den Gebieten der Biochemie und Physiologie in einem Experiment. Das Protokoll ermöglicht die dynamische Messung von hohen Energie-Phosphat-Gehalt und Umsatz im Herzen, während gleichzeitig die Überwachung physiologischer Funktion. Wenn richtig ausgeführt, ist dies eine wertvolle Technik für die Beurteilung von Herz-Energetik.

Beurteilung der Herzfunktion und Energetik in isolierten Maus-Herzen mit 31 P-NMR-Spektroskopie

Bioengineered Mausmodelle sind zu leistungsstarken Forschungsinstrumenten geworden, um kausale Zusammenhänge zwischen molekularen Veränderungen und Modellen von ... zu bestimmen.

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Herzfunktion und Energetik in einem isoliert perfundierten Mausherzen zu beobachten. Dies wird erreicht, indem ein Mausherz im LOR-Modus perfundiert wird. Als zweiter Schritt erfolgt die Perfusion mit einem Krebs-Henseleit-Puffer, der mit Glukose und Pyruvat angereichert ist. Anschließend wird ein mit Wasser gefüllter Ballon in das linke Ventrikel oder lv eingeführt, was eine kontinuierliche Überwachung der Herzfunktion während des Experiments ermöglicht.Anschließend wird das Herz in eine 10-Millimeter-NMR-Röhre gegeben und in das Magnetfeld eingesetzt, um die Herzenergetik zu untersuchen, indem die Resonanzen von Phosphokreatinphosphaten von ATP und das Ergebnis des anorganischen Phosphats beobachtet werden. Es wurden Ergebnisse erhalten, die die Herzfunktion und -energetik anhand der Druckkurven des linken Ventrikels sowie mittels ³¹P-NMR-Spektroskopie und Massenspektrometrie darstellen. Hallo, ich bin Steve Kitz vom MIT Cadre Metabolism Center der Abteilung für Anästhesiologie an der University of Washington. Heute zeige ich Ihnen ein Verfahren zur isolierten Herzperfusion in Kombination mit ³¹P-NMR-Spektroskopie.Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Herzfunktion und Energetik in unseren bioingenieurtechnisch hergestellten Mausmodellen zu beurteilen. Beginnen wir also. Um dieses Protokoll zu starten, bereiten Sie einen Liter Kres, also Licht- oder KH-Puffer, vor.Leiten Sie 5 % Kohlendioxid und 95 % Sauerstoff in Form von Blasen zehn bis fünfzehn Minuten lang in die Mischung ein. Fügen Sie anschließend zwei Millimolar Calciumchlorid sowie die Substrate, 10 Millimolar Glukose und 0,5 Millimolar Pyruvat, hinzu. Für diese Experimente werden pro Erfassung von P 31-Spektren zwei getrennte Systeme gleichzeitig verwendet.Ein BRUER 14-T-Magnet ist mit der fortschrittlichen Dreikonsole und einem Computer, der mit der Top-Spin-V-2.1-Software zur Beurteilung der Herzfunktion ausgestattet ist, verbunden. Ein speziell angefertigtes Herzperfusionssystem ist mit dem PowerLab verbunden. Vier 30 Datenerfassungen.Ausgestattet mit der Laborkarten-Software PRO six zur Datenanalyse. Die Herzperfusionsapparatur umfasst eine Mini-Puls-drei-Peristaltikpumpe, die über einen STH-Pumpenregler gesteuert wird und verwendet wird, um den KH-Puffer in das Herz zu perfundieren. Die Temperaturregelung des Herzens während des NMR-Experiments ist entscheidend. Beheizte Zirkulatoren dienen dazu, die Temperatur zwischen 37,0 und 37,5 Grad Celsius aufrechtzuerhalten, während sich das Herz im Magnetfeld befindet, und die Temperatur wird während des gesamten Experiments mithilfe einer faseroptischen Temperatursonde überwacht.Während des gesamten Experiments werden der linksventrikuläre Druck und der Perfusionsdruck über Druckmesswandler überwacht, die an ein Datenerfassungssystem angeschlossen sind und mithilfe der beiliegenden Software dargestellt werden. Ein physiologischer Messwandler dient der Überwachung des linksventrikulären Drucks, und ein Einweg-Blutdruckmesswandler wird zur Überwachung des Perfusionsdrucks verwendet. Schließlich dient ein Nabelschnurkatheter der Zufuhr des erwärmten, mit Sauerstoff angereicherten Puffers zum Herzen.Nachdem die Druckmessgeräte im Magnet platziert wurden, aber vor Beginn des Experiments, kalibrieren Sie die Druckmessgeräte zunächst mit dem Standardeichmanometer, ohne Druck an das Messgerät anzulegen, um die Kalibrierung auf Null zu stellen. Danach pumpen Sie das Eichmanometer auf einen höheren Druck auf und geben diesen Wert in das Computerprogramm ein.Danach überprüfen, ob die Druckaufnehmer ausreichend kalibriert wurden, indem man dieses Füllstand-Manometer auf bekannte Drücke aufbläst und diese auf dem Computerbildschirm verifiziert. Sobald die Druckaufnehmer kalibriert sind, kalibrieren Sie die NMR-Sonde mit einer 10-Millimeter-NMR-Röhre, die eine Standardprobe aus 150 Millimolar Natriumphosphat enthält. Führen Sie die Kalibrierung mit dem TopSpin-Softwareprogramm durch.Zunächst wird die Probe abgestimmt, um die Frequenz der Phosphor-Resonanz einzustellen. Anschließend wird die Probe geshimmt, um ein homogenes Magnetfeld zu erzeugen. Diese anfängliche Kalibrierung verbessert das Signal und verkürzt die Zeit, die notwendig ist, um die Erfassungsphase zu beginnen.Wenn das Herz in der Sonde positioniert ist, um die Mausherz-Extraktion zu beginnen, injizieren Sie der Maus 200 Einheiten Heparin intraperitoneal, um die Gerinnung zu verringern. Nach fünf Minuten verabreichen Sie 175 Milligramm pro Kilogramm Natrium-Pentobarbital intraperitoneal. Sobald die Maus anästhesiert ist, legen Sie sie auf den Rücken und befestigen Sie die Gliedmaßen mit Klebeband, um den Brustbereich freizulegen.Führen Sie einen Zehenquetschtest durch, um sicherzustellen, dass die Maus vollständig anästhesiert ist. Öffnen Sie die Bauchhöhle und den Brustkorb mit einer Schere und verwenden Sie eine Pinzette, um den Rippenkäfig zurückzuklappen und die Brusthöhle freizulegen. Halten Sie das Lungengewebe fest und heben Sie das Herz vorsichtig mit einer gebogenen Schere an.Schneiden Sie die großen Gefäße hinter dem Herzen durch und arbeiten Sie langsam in Richtung Kopf der Maus, bis das Herz gelöst ist. Setzen Sie das Herz unverzüglich in eiskaltem KH-Puffer still. Halten Sie die Organe auf Eis und entfernen Sie schnell die Lunge.Identifizieren Sie die Lappen des Thymus und klappen Sie diese vorsichtig zurück, um die Aorta freizulegen. Entfernen Sie anschließend den Thymus. Isolieren Sie abschließend die Aorta, indem Sie sorgfältig das umgebende Gewebe entfernen.Unter Verwendung von mikrochirurgischen Pinzetten die beiden Wände der Aorta festhalten, um das Lumen freizulegen. Anschließend die Aorta vorsichtig auf die Kanüle aufsetzen. Hergestellt aus Polyethylen-Röhrchen mit einem Außendurchmesser von 0,965 Millimeter.Halten Sie die Aorta mit einer Mikrogefä&szlig;klemme fest und binden Sie schnell Nahtmaterial um die Aorta. Sobald die F&auml;den gebunden sind, entfernen Sie die Klemme. Pr&uuml;fen Sie vorsichtig mit der Pinzette, ob die Kan&uuml;le &uuml;ber der Aortenwurzel liegt.Fügen Sie zusätzliche Fäden hinzu, die erforderlich sind, um das Herz an Ort und Stelle zu halten. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe mithilfe der Pinzette und des Mikroskalpells. Anschließend führen Sie einen kleinen Einschnitt in den linken Atriumvorhof durch.Halten Sie das Herz vorsichtig und führen Sie vorsichtig Polyäthylenrohr mit einem Außendurchmesser von 0,61 Millimeter durch das linke Vorhof, den linken Ventrikelhohlraum und durch die Herzspitze heraus ein. Schneiden Sie das überschüssige Rohr ab. Führen Sie danach einen entleerten, mit Wasser gefüllten Ballon durch den Vorhof in den linken Ventrikel ein.Halten Sie den Ballon mit Klebeband an Ort und Stelle. Erhöhen Sie dann schrittweise die Drehzahl der peristaltischen Pumpe, um dem Herzen einen ausreichenden Durchfluss zu gewährleisten. Spülen Sie das Herz weiterhin mit KH-Puffer bei konstantem Durchfluss, entsprechend etwa zwei Milliliter pro Minute, bis das Herz in die NMR-Sonde eingebracht wird.Den LV-Ballon mit einem kleinen Volumen unter Verwendung einer Mikrometerspritze aufblasen, um zu überprüfen, ob der LV-Druckwandler für die NMR-Spektroskopie funktioniert. Zunächst das Herz vorsichtig in eine 10-Millimeter-NMR-Röhre einsetzen. Um die Röhre in die richtige Position zu führen, wird ein breiter Spinner um die NMR-Röhre platziert.Befestigen Sie innerhalb der Sonde die gesamte Apparatur mit Klebeband am Nabelstrang. Senken Sie anschließend den Nabelstrang langsam in die obere Bohrung des Magneten, bis sich die NMR-Röhre mit dem Herz in der Spule der 10-Millimeter-NMR-Sonde befindet. Sobald sich das Herz in der richtigen Position innerhalb der Sonde befindet, stellen Sie den Durchfluss der parasitären Pumpe so ein, dass ein Perfusionsdruck von 80 Millimetern Quecksilbersäule erreicht wird.Halten Sie den Perfusionsdruck aufrecht, indem Sie die Haltefunktion des Pumpenreglers aktivieren. Lassen Sie eine Equilibrierungsphase von 15 bis 20 Minuten für das Herz folgen. Während der Equilibrierungsphase stellen Sie das Volumen des linken Ventrikels (LV) so ein, dass ein enddiastolischer Druck von acht bis zehn Millimeter Quecksilbersäule erreicht wird.Danach optimieren Sie die Spektrometerparameter, um das bestmögliche Phosphorsignal zu erhalten. Stimmen Sie das NMR-Gerät ab, indem Sie den Radiofrequenzimpuls so einstellen, dass er der Frequenz entspricht, bei der der Phosphorkern resoniert. Anschließend führen Sie ein Shimming der Probe durch, um nach der Einstellphase das Magnetfeld homogen zu machen.Beginnen Sie die Aufnahme mehrerer P-31-NMR-Spektren. Die Aufnahmedauer für jedes Spektrum hängt von der Feldstärke des Magneten, der Probengröße und dem für ein bestimmtes Experiment erforderlichen Signal-Rausch-Verhältnis ab. Hier werden Spektren mithilfe eines 14-Tesla-Magneten erhalten, indem das Signal aus 256 Radiowellenimpulsen mit einer Dauer von 20 Mikrosekunden, einem Kippwinkel von 60 Grad und Verzögerungen von 2,0 Sekunden gemittelt wird.Dieses Experiment erfordert etwa 10 Minuten. Eine typische Messgröße der Herzfunktion, der linksventrikuläre entwickelte Druck, wird ermittelt, indem der enddiastolische Druck (EDP) vom systolischen Druck subtrahiert wird. Bei einer normalen C57BL/6-Maus liegt der linksventrikuläre entwickelte Druck bei einem festgelegten enddiastolischen Druck von acht bis 10 Millimeter Quecksilbersäule typischerweise zwischen 100 und 110 Millimeter Quecksilbersäule.Repräsentative Druck-Volumen-Kurven werden von Kontroll- und aortenbandagierten Mäusen gezeigt. Die systolische Funktion wird durch den linksventrikulären entwickelten Druck in Abhängigkeit von zunehmenden linksventrikulären Volumina dargestellt, wie sie durch das Volumen des linksventrikulären Ballons bestimmt wurden. Die diastolische Funktion wird durch den enddiastolischen Druck (EDP) in Abhängigkeit von zunehmenden linksventrikulären Volumina dargestellt.Das 31P-NMR-Spektrum eines isoliert perfundierten Mäuseherzens zeigt Signale von PHOSPHOCREATIN oder PCR, den drei Phosphaten von ATP sowie anorganischem Phosphat oder Pi. Hier ist der Pi-Peak relativ klein. Dies ist typisch für einen aerob perfundierten Herzen, das mit Pyruvat oder Fettsäuren versorgt wird.Zusätzlich zu Glukose während Ischämiephasen nimmt dieser Peak zu, während der PCR-Peak abnimmt. Ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie man ein Mausherz für die Perfusion vorbereitet, sodass sowohl die Herzfunktion als auch die Energetik während des Experiments gleichzeitig gemessen werden können. Es ist wichtig sicherzustellen, dass das Herz ausreichend perfundiert ist.Andernfalls sind Ihre NMR-Daten nicht zuverlässig. Das war's. Vielen Dank und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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