Beurteilung der Herzfunktion und Energetik in isolierten Maus-Herzen mit ³¹ P-NMR-Spektroskopie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Herzfunktion und Energetik in einem isolierten perfundierten Mausherz zu beobachten. Dies wird durch die Perfusion eines Mausherzens im LOR-Modus erreicht. Mit Krebs Hand Select Puffer, angereichert mit Glukose und Pyruvat als zweitem Schritt, wird ein mit Wasser gefüllter Ballon in den linken Ventrikel oder LV eingeführt, der eine ständige Überwachung der Herzfunktion während des Experiments ermöglicht.

Als nächstes wird das Herz in ein 10-Millimeter-NMR-Röhrchen gelegt und in den Magneten eingeführt, um die Herzenergetik durch Beobachtung der Resonanzen von Phosphokreatinphosphaten eines TP zu beurteilen, und es wurden die anorganischen Phosphatergebnisse erhalten, die die Herzfunktion und -energetik auf der Grundlage der LV-Druckwellen und P 31 und einer Massenspektroskopie zeigen. Ich bin Steve Kitz vom MIT Cadre Metabolism Center in der Abteilung für Anästhesiologie an der University of Washington. Heute zeige ich Ihnen ein Verfahren zur isolierten Herzperfusion in Kombination mit 31 PNMR-Spektroskopie.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Herzfunktion und Energetik in unseren biotechnologisch hergestellten Mausmodellen zu beurteilen. Also lasst uns loslegen. Um dieses Protokoll zu beginnen, bereiten Sie einen Liter Kres vor, also Licht- oder KH-Puffer.

Sie 5 % Kohlendioxid und 95 % Sauerstoffblasen für 10 bis 15 Minuten in die Mischung. Fügen Sie dann zwei millimolare Calciumchloride hinzu, gefolgt von Substraten, 10 millimolare Glukose und 0,5 millimolare Pyruvate. Für diese Experimente werden zwei separate Systeme gleichzeitig pro Aufnahme von P 31 Spektren verwendet.

Ein BRUER 14 T Magnet ist mit der fortschrittlichen Drei-Konsole und einem Computer verbunden, der mit der Top-Spin V 2.1-Software zur Beurteilung der Herzfunktion ausgestattet ist. Ein speziell angefertigtes Herzperfusionssystem ist mit dem Power Lab verbunden. Vier 30 Datenanforderung.

Ausgestattet mit der Software lab chart PRO six für die Datenanalyse. Das Herzperfusionsgerät umfasst eine Mini-Puls-Drei-Peristaltikpumpe, die von einer STH-Pumpensteuerung gesteuert wird, die zur Perfusion des KH-Puffers in die Herztemperaturregulierung während des NMR-Experiments verwendet wird. Beheizte Zirkulatoren werden verwendet, um die Temperatur zwischen 37,0 und 37,5 Grad Celsius zu halten, während sich das Herz im Magneten befindet und die Temperatur für die Dauer des Experiments mit einem faseroptischen Temperaturfühler überwacht wird.

Während des gesamten Experiments werden der NS-Druck und der Perfusionsdruck über Druckmessumformer überwacht, die an ein Datenerfassungssystem angeschlossen sind und mit der mitgelieferten Software angezeigt werden. Ein physiologischer Schallkopf wird zur Überwachung des LV-Drucks und ein Einweg-Blutdruckwandler zur Überwachung des Perfusionsdrucks verwendet. Schließlich wird eine Nabelschnur verwendet, um das Herz mit dem erhitzten sauerstoffhaltigen Puffer zu versorgen.

Sobald Sie sich im Magneten befinden, kalibrieren Sie vor Beginn des Experiments die Druckmessumformer mit dem Standard-Fig-Moment-Manometer an erster Stelle, ohne Druck in den Messumformer, um die Kalibrierung auf Null zu setzen. Pumpen Sie dann dieses Manometer im Feigenmodus auf einen höheren Druck auf. Geben Sie diesen Wert in das Computerprogramm ein.

Vergewissern Sie sich dann, dass die Druckmessumformer ausreichend kalibriert wurden, indem Sie dieses Fig-Moment-Manometer auf bekannte Drücke aufblasen und auf dem Computerbildschirm überprüfen. Nachdem die Druckmessköpfe kalibriert wurden, kalibrieren Sie die NMR-Sonde mit einem 10-Millimeter-NMR-Röhrchen, das eine Standardprobe mit 150 millimolarem Natriumphosphat enthält. Führen Sie die Kalibrierung mit dem Softwareprogramm top spin durch.

Stimmen Sie zuerst die Probe ab, um die Frequenz der Phosphorresonanz einzustellen. Scheiben Sie dann die Probe, um ein homogenes Magnetfeld zu erzeugen. Diese Erstkalibrierung erleichtert das Signal und verkürzt die Zeit, die zum Starten der Erfassungsperiode erforderlich ist.

Sobald das Herz in der Sonde positioniert ist, um die Herzextraktion der Maus zu starten, injizieren Sie der Maus 200 Einheiten Heparin intraperitoneal, um die Gerinnung zu reduzieren. Nach fünf Minuten verabreichen Sie 175 Milligramm pro Kilogramm Natrium Penta barbital intraperitoneal. Sobald die Maus betäubt ist, legen Sie sie auf den Rücken und kleben Sie die Arme und Beine ab, um den Brustbereich freizulegen.

Führen Sie eine Zehenkneifung durch, um sicherzustellen, dass die Maus vollständig betäubt ist. Schneiden. Öffnen Sie die Bauchhöhle und den Brustkorb mit einer Schere und verwenden Sie eine Pinzette, um den Brustkorb zurückzuziehen und eine Brusthöhle mit einer Pinzette freizulegen. Halten Sie sich am Lungengewebe fest und heben Sie das Herz vorsichtig mit einer gebogenen Schere an.

Schneiden Sie die großen Gefäße hinter dem Herzen ab und fahren Sie langsam in Richtung des Mauskopfes fort, bis das Herz frei ist. Halten Sie das Herz sofort in eiskaltem KH-Puffer an. Halten Sie die Organe auf Eis und entfernen Sie schnell die Lunge.

Identifiziere die Lappen des Thymus und schäle sie vorsichtig zurück, um die Aorta freizulegen. Entfernen Sie dann die Thymusdrüse. Isolieren Sie schließlich die Aorta, indem Sie vorsichtig das umgebende Gewebe entfernen.

Halten Sie mit einer Mikronahzange in der Regel beide Wände der Aorta fest, um das Lumen freizulegen. Legen Sie dann die Aorta vorsichtig auf die Kanüle. Hergestellt aus Polyethylenrohren mit einem Außendurchmesser von 0,965 Millimetern.

Halten Sie die Aorta mit einer Mikrogefäßklemme an Ort und Stelle und binden Sie schnell Nähte um die Aorta. Sobald die Nähte gebunden sind, entfernen Sie die Klemme. Prüfen Sie mit der Pinzette genau, ob sich die Kanüle über der Aortenwurzel befindet.

Füge alle zusätzlichen Bänder hinzu, die notwendig sind, um das Herz an Ort und Stelle zu halten. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe mit der Pinzette und der Mikroschere. Mache dann einen kleinen Schnitt in das linke Orakel.

Halten Sie das Herz vorsichtig fest und führen Sie vorsichtig einen 0,61 Millimeter großen Polyethylenschlauch durch den linken Vorhof, die linke Ventrikelhöhle und durch die Spitze heraus. Schneiden Sie die überschüssigen Schläuche ab. Führen Sie als Nächstes einen entleerten, mit Wasser gefüllten Ballon durch den Vorhof in den linken Ventrikel ein.

Halte den Ballon mit Klebeband fest. Erhöhen Sie dann allmählich die Geschwindigkeit der peristaltischen Pumpe, um eine ausreichende Durchblutung des Herzens zu gewährleisten. Perfundieren Sie das Herz weiterhin mit KH-Puffer bei einem konstanten Fluss, der etwa zwei Millilitern pro Minute entspricht, bis das Herz in die NMR-Sonde eingesetzt wird.

Blasen Sie den LV-Ballon mit einer Mikrometerspritze mit einem kleinen Volumen auf, um zu überprüfen, ob der LV-Druckwandler für die NMR-Spektroskopie funktioniert. Führen Sie zunächst das Herz vorsichtig in ein 10-Millimeter-NMR-Röhrchen ein. Ein breiter Wildschwein-Spinner wird um die NMR-Röhre gelegt, um die Röhre in die richtige Position zu führen.

Befestigen Sie innerhalb der Sonde das gesamte Gerät mit Klebeband fest an der Nabelschnur. Senken Sie dann die Nabelschnur langsam in die obere Bohrung des Magneten ab, bis sich der NMR-Schlauch mit dem Herzen in der Spule der 10-Millimeter-NMR-Sonde befindet. Sobald sich das Herz in der Sonde in der richtigen Position befindet, stellen Sie den Fluss der parasitären Pumpe so ein, dass ein Perfusionsdruck von 80 Millimetern Quecksilbersäule erreicht wird.

Halten Sie den Perfusionsdruck aufrecht, indem Sie den Haltemechanismus an der Pumpensteuerung aktivieren. Gönnen Sie dem Herzen eine E-Gleichgewichtsphase von 15 bis 20 Minuten. Während der Gleichgewichtsphase passen Sie das Volumen des LV-Ballons an, um einen enddiastolischen Druck von acht bis 10 Millimetern Quecksilbersäule zu erreichen.

Optimieren Sie dann die Spektrometerparameter, um das bestmögliche Phosphorsignal zu erhalten. Stimmen Sie das NMR-Instrument ab, indem Sie den Radiopuls einstellen, also die Frequenz, mit der der Phosphorkern schwingt. Schneiden Sie dann die Probe, um das Magnetfeld nach der Äquilibrierungszeit homogen zu machen.

Beginnen Sie mit der Aufnahme mehrerer P 31 NMR-Spektren. Die Erfassungsdauer für jedes Spektrum hängt von der Feldstärke des Magneten, der Größe der Probe und dem für ein bestimmtes Experiment erforderlichen Signal-Rausch-Verhältnis ab. Hier werden Spektren mit einem 14-Tesla-Magneten erhalten, indem das Signal von 256 Radiofrequenzpulsen von 20 Mikrosekunden mit einem Klappwinkel von 60 Grad und Verzögerungen von 2,0 Sekunden gemittelt wird.

Dieses Experiment dauert etwa 10 Minuten. Der entwickelte LV-Druck, ein typisches Maß für die Herzfunktion, wird durch Subtraktion des enddiastolischen Drucks oder EDP vom systolischen Druck ermittelt. Bei einer normalen C 57 Black Six-Maus liegt der LV-Druck des Herzens typischerweise zwischen 100 und 110 Millimeter Quecksilbersäule bei einem diastolischen Druck mit festem Ende von acht bis 10 Millimetern Quecksilbersäule.

Repräsentative Stylingkurven sind von Kontroll- und Aortenmäusen mit Bändern dargestellt. Die systolische Funktion wird durch den von LV entwickelten Druck über zunehmendem LV-Volumen dargestellt, der durch das Volumen des LV-Ballons bestimmt wird. Die diastolische Funktion wird durch EDP gegenüber zunehmendem LV-Volumen dargestellt.

P 31 NMR-Spektren eines isolierten perfundierten Mausherzens liefern Signale von PHOSPHOKREATIN oder PCR, den drei Phosphaten aus einem TP und anorganischem Phosphat oder Pi. Hier ist der PI-Peak relativ klein. Dies ist typisch für ein aerob überlastetes Herz, das mit Pyruvat oder Fettsäuren versorgt wird.

Zusätzlich zur Glukose in Zeiten der Ischämie steigt dieser Peak, während der PCR-Peak abnimmt. Ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie man ein Mausherz für die Perfusion vorbereitet, so dass sowohl die Herzfunktion als auch die Energetik während des Experiments gleichzeitig gemessen werden können. Es ist wichtig, darauf zu achten, dass das Herz ausreichend durchblutet ist.

Andernfalls sind Ihre NMR-Daten nicht zuverlässig. Das war's also. Vielen Dank und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.