Beurteilung der Herzfunktion und Energetik in isolierten Maus-Herzen mit ³¹ P-NMR-Spektroskopie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Herzfunktion und Energetik in einer isoliert perfundierten Maus-Herzpräparation zu beobachten. Dies wird erreicht, indem ein Maus-Herz im LOR-Modus perfundiert wird. Als zweiter Schritt erfolgt die Perfusion mit einem Krebs-Henseleit-Puffer, der mit Glukose und Pyruvat angereichert ist. Danach wird ein mit Wasser gefüllter Ballon in das linke Ventrikel (LV) eingeführt, was eine kontinuierliche Überwachung der Herzfunktion während des Experiments ermöglicht.

Anschließend wird das Herz in eine 10-Millimeter-NMR-Röhre gegeben und in das Magnetfeld eingesetzt, um die Herzenergetik zu untersuchen, indem die Resonanzen von Phosphokreatin, ATP und anorganischem Phosphat beobachtet werden. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen die Herzfunktion und -energetik basierend auf den Druckwellen des linken Ventrikels sowie auf ³¹P-NMR- und Massenspektrometrie-Analysen. Hallo, ich bin Steve Kitz vom MIT Cadre Metabolism Center der Abteilung für Anästhesiologie an der University of Washington. Heute zeige ich Ihnen ein Verfahren zur isolierten Herzperfusion in Kombination mit ³¹P-NMR-Spektroskopie.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Herzfunktion und Energetik in unseren bioingenieurtechnisch hergestellten Mausmodellen zu beurteilen. Beginnen wir also. Um dieses Protokoll zu starten, bereiten Sie einen Liter Kres, also Licht- oder KH-Puffer, vor.

Leiten Sie 5 % Kohlendioxid und 95 % Sauerstoff in Form von Blasen in die Mischung für 10 bis 15 Minuten ein. Fügen Sie anschließend zwei Millimolar Calciumchlorid hinzu, gefolgt von den Substraten, 10 Millimolar Glukose und 0,5 Millimolar Pyruvat. Für diese Experimente werden pro Erfassung von P 31-Spektren zwei getrennte Systeme gleichzeitig verwendet.

Ein BRUER 14-T-Magnet ist mit der fortschrittlichen Dreikonsole und einem Computer, der mit der Top-Spin-V-2.1-Software zur Beurteilung der Herzfunktion ausgestattet ist, verbunden. Ein speziell angefertigtes Herzperfusionssystem ist mit dem PowerLab verbunden. Vier 30 Datenerfassungen.

Ausgestattet mit der Laborkarten-Software PRO six zur Datenanalyse. Die Herzperfusionsapparatur umfasst eine Mini-Puls-Drei-Peristaltikpumpe, die über einen STH-Pumpenregler gesteuert wird und verwendet wird, um den KH-Puffer in das Herz zu perfundieren. Die Temperaturregelung des Herzens während des NMR-Experiments ist entscheidend. Beheizte Zirkulatoren dienen dazu, die Temperatur zwischen 37,0 und 37,5 Grad Celsius aufrechtzuerhalten, während sich das Herz im Magnetfeld befindet, und die Temperatur wird während des gesamten Experiments mithilfe einer faseroptischen Temperatursonde überwacht.

Während des gesamten Experiments werden der LV-Druck und der Perfusionsdruck über Druckmesswandler überwacht, die an ein Datenerfassungssystem angeschlossen sind und mithilfe der beiliegenden Software dargestellt werden. Ein physiologischer Messwandler dient der Überwachung des LV-Drucks, und ein Einweg-Blutdruckmesswandler wird zur Überwachung des Perfusionsdrucks verwendet. Schließlich wird ein Nabelschnurkatheter verwendet, um das erwärmte, mit Sauerstoff angereicherte Pufferlösung zum Herzen zu leiten.

Nachdem die Druckmessgeräte im Magnet platziert wurden, aber vor Beginn des Experiments, kalibrieren Sie die Druckmessgeräte zunächst mit dem Standardeichmanometer, ohne Druck an das Messgerät anzulegen, um die Kalibrierung auf Null zu stellen. Danach pumpen Sie das Eichmanometer auf einen höheren Druck auf. Geben Sie diesen Wert in das Computerprogramm ein.

Danach überprüfen, ob die Druckaufnehmer ausreichend kalibriert wurden, indem man dieses Füllstand-Manometer auf bekannte Drücke aufbläst und diese auf dem Computerbildschirm verifiziert. Sobald die Druckaufnehmer kalibriert sind, kalibrieren Sie die NMR-Sonde mit einer 10-Millimeter-NMR-Röhre, die eine Standardprobe aus 150 Millimolar Natriumphosphat enthält. Führen Sie die Kalibrierung mit dem Top-Spin-Softwareprogramm durch.

Zunächst justieren Sie die Probe, um die Frequenz der Phosphor-Resonanz einzustellen. Danach führen Sie ein Shimming der Probe durch, um ein homogenes Magnetfeld zu erzeugen. Diese anfängliche Kalibrierung verbessert das Signal und verkürzt die Zeit, die notwendig ist, um die Erfassungsphase zu beginnen.

Wenn das Herz in der Sonde positioniert ist, um die Entnahme des Mausherzens zu beginnen, injizieren Sie der Maus 200 Einheiten Heparin intraperitoneal, um die Gerinnung zu verringern. Nach fünf Minuten verabreichen Sie 175 Milligramm pro Kilogramm Natrium-Pentobarbital intraperitoneal. Sobald die Maus anästhesiert ist, legen Sie sie auf den Rücken und befestigen Sie die Vorder- und Hinterbeine mit Klebeband, um den Brustbereich freizulegen.

Führen Sie einen Zehenquetschtest durch, um sicherzustellen, dass die Maus vollständig anästhesiert ist. Öffnen Sie die Bauchhöhle und den Brustkorb mit einer Schere und verwenden Sie eine Pinzette, um den Rippenkäfig zurückzuklappen und die Brusthöhle freizulegen. Halten Sie das Lungengewebe fest und heben Sie das Herz vorsichtig mit einer gebogenen Schere an.

Schneiden Sie die großen Gefäße hinter dem Herzen ab und fahren Sie langsam in Richtung Kopf der Maus fort, bis das Herz gelöst ist. Stoppen Sie das Herz unverzüglich in eiskaltem KH-Puffer. Halten Sie die Organe auf Eis und entfernen Sie schnell die Lungen.

Identifizieren Sie die Lappen des Thymus und klappen Sie diese vorsichtig zurück, um die Aorta freizulegen. Entfernen Sie anschließend den Thymus. Isolieren Sie abschließend die Aorta, indem Sie sorgfältig das umgebende Gewebe entfernen.

Halten Sie mit mikrochirurgischen Pinzetten in der Regel beide Wände der Aorta, um das Lumen freizulegen. Setzen Sie die Aorta dann vorsichtig auf die Kanüle auf. Hergestellt aus Polyäthylen-Rohr mit einem Außendurchmesser von 0,965 mm.

Halten Sie die Aorta mit einer Mikrogefässklemme an Ort und Stelle und binden Sie schnell Nahtfäden um die Aorta. Sobald die Nähte gebunden sind, entfernen Sie die Klemme. Prüfen Sie vorsichtig mit der Pinzette, ob die Kanüle über der Aortenwurzel liegt.

Fügen Sie alle erforderlichen zusätzlichen Fäden hinzu, um das Herz an Ort und Stelle zu halten. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe mit der Pinzette und der Mikroschere. Anschließend führen Sie einen kleinen Einschnitt in den linken Atriumohr (left oracle) ein.

Halten Sie das Herz vorsichtig und führen Sie vorsichtig Polyäthylenrohr mit einem Außendurchmesser von 0,61 Millimeter durch das linke Vorhof, den linken Ventrikelhohlraum und durch die Herzspitze heraus ein. Schneiden Sie das überschüssige Rohr ab. Führen Sie anschließend einen entleerten, mit Wasser gefüllten Ballon durch den Vorhof in den linken Ventrikel ein.

Halten Sie den Ballon mit Klebeband an Ort und Stelle. Erhöhen Sie dann schrittweise die Drehzahl der peristaltischen Pumpe, um dem Herzen einen ausreichenden Durchfluss zu gewährleisten. Setzen Sie die Perfusion des Herzens mit KH-Puffer unter konstantem Fluss, entsprechend etwa zwei Milliliter pro Minute, fort, bis das Herz in die NMR-Sonde eingebracht wird.

Den LV-Ballon mit einem kleinen Volumen unter Verwendung einer Mikrometerspritze aufblasen, um zu überprüfen, ob der LV-Druckwandler für die NMR-Spektroskopie funktioniert. Zunächst das Herz vorsichtig in eine 10-Millimeter-NMR-Röhre einsetzen. Um die Röhre in die richtige Position zu führen, wird ein breiter Spinner um die NMR-Röhre platziert.

Befestigen Sie innerhalb der Sonde die gesamte Vorrichtung mit Klebeband am Nabelstrang. Senken Sie anschließend den Nabelstrang langsam in die obere Bohrung des Magneten ab, bis sich die NMR-Röhre mit dem Herzen innerhalb der Spule der 10-Millimeter-NMR-Sonde befindet. Sobald sich das Herz in der richtigen Position innerhalb der Sonde befindet, stellen Sie den Durchfluss der parasitären Pumpe so ein, dass ein Perfusionsdruck von 80 Millimetern Quecksilbersäule erreicht wird.

Halten Sie den Perfusionsdruck aufrecht, indem Sie die Haltefunktion des Pumpenreglers aktivieren. Lassen Sie eine 15 bis 20 Minuten dauernde Gleichgewichtsphase für das Herz folgen. Während der Gleichgewichtsphase stellen Sie das Volumen des linksherzventrikulären Ballons so ein, dass ein enddiastolischer Druck von acht bis zehn Millimeter Quecksilbersäule erreicht wird.

Danach optimieren Sie die Spektrometerparameter, um das bestmögliche Phosphor-Signal zu erhalten. Stimmen Sie das NMR-Gerät ab, indem Sie den Radiofrequenzimpuls so einstellen, dass er der Frequenz entspricht, bei der der Phosphorkern resoniert. Anschließend führen Sie ein Shimming der Probe durch, um nach der Einstellphase das Magnetfeld homogen zu machen.

Beginnen Sie die Aufnahme mehrerer P-31-NMR-Spektren. Die Aufnahmedauer für jedes Spektrum hängt von der Feldstärke des Magneten, der Probengröße und dem für ein bestimmtes Experiment erforderlichen Signal-Rausch-Verhältnis ab. Hier werden Spektren mithilfe eines 14-Tesla-Magneten erhalten, indem das Signal aus 256 Radiowellenimpulsen mit einer Dauer von 20 Mikrosekunden, einem Kippwinkel von 60 Grad und Verzögerungen von 2,0 Sekunden gemittelt wird.

Dieses Experiment erfordert etwa 10 Minuten. Eine typische Messgröße der Herzfunktion, der linksventrikuläre entwickelte Druck, wird ermittelt, indem der enddiastolische Druck oder EDP vom systolischen Druck subtrahiert wird. Bei einer normalen C57BL/6-Maus liegt der linksventrikuläre entwickelte Druck bei einem festgelegten enddiastolischen Druck von acht bis 10 Millimeter Quecksilbersäule typischerweise zwischen 100 und 110 Millimeter Quecksilbersäule.

Vertreterische Druck-Volumen-Kurven werden von Kontroll- und aortenbandagierten Mäusen gezeigt. Die systolische Funktion wird durch den linksventrikulären entwickelten Druck bei zunehmenden linksventrikulären Volumina dargestellt, wie sie durch das Volumen des linksventrikulären Ballons bestimmt wurden. Die diastolische Funktion wird durch den enddiastolischen Druck (EDP) bei zunehmenden linksventrikulären Volumina dargestellt.

Das 31P-NMR-Spektrum eines isoliert perfundierten Mäuseherzens zeigt Signale von PHOSPHOCREATIN oder PCR, den drei Phosphaten von ATP und anorganischem Phosphat oder Pi. Hier ist der Pi-Peak relativ klein. Dies ist typisch für einen aerob perfundierten Herzen, das mit Pyruvat oder Fettsäuren versorgt wird.

Neben der Glukose während Ischämiephasen steigt dieses Signal an, während das PCR-Signal abnimmt. Ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie man ein Mausherz für die Perfusion vorbereitet, damit sowohl die Herzfunktion als auch die Energetik während des Experiments gleichzeitig gemessen werden können. Es ist wichtig sicherzustellen, dass das Herz ausreichend perfundiert ist.

Andernfalls sind Ihre NMR-Daten nicht zuverlässig. Das war's. Vielen Dank und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.