Name: Transurethrale Induktion von Maus Harnwegsinfekt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-05T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Lernen Sie die transurethrale Induktion von Harnwegsinfektionen bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht die präzise Inokulation bakterieller Stämme und die quantitative Analyse von Infektionen in vivo.

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Die Autoren bedanken sich bei Shelly Xie und Jennifer Payne für ihre technische Unterstützung durch Experten bestätigt. Diese Arbeit wurde ermöglicht durch Zuschüsse aus dem Society of Pediatric Urology und der Stanford Pediatric Research Fund.

I. Vorbereitung der Harnröhren-Katheter <ol><li> Für jede Maus Blase und Niere entnommen werden, statt 5-6 Edelstahlkugeln (Blase, 1,6 mm Größe oder 0,9-2,0 mm Blend) oder Zirkonoxid-Perlen (Niere, 0,5 mm Größe) in einem Kryoröhrchen Rohr bzw.. Autoclave die Perle enthaltenden Röhrchen. </li><li> Nach der Rohre auf Umgebungstemperatur abkühlen, 200 Mikroliter steriles PBS zu jeder Edelstahl bead-haltigen Schlauch und 400 Mikroliter steriles PBS in jedes Zirkonoxid bead-haltigen Röhre. </li><li> Wir bereiten Harnleiterkatheter wie Hung und Hultgren 13 beschrieben. Autoclave ein sauberes Paar Flat-Head-Pinzette und einer feinen Schere (Iris oder ähnliches) und erlauben die Instrumente auf Raumtemperatur abkühlen. Wischen Sie die Oberflächen einer Sterilbank mit 70% Ethanol. In der Haube, schneiden Sie ein 30 cm (ca.) Segment der PE-Rohre. Aseptischen Bedingungen statt einer sterilen 30-Gauge-Nadel (2.1 inch lange Nadel) auf einer sterilen 3 ml Spritze. Pick-up ein Ende des Schnittes Polyethylen-Schlauch mit dem autoklaviert Zange und schieben Sie den Schlauch auf die Nadel bis sie den Hub erfüllt. Schneiden Sie den Schlauch so, dass ca. 2 cm über die Spitze der Nadel erstreckt. Entfernen Sie den Katheter aus der Spritze und in eine sterile Petrischale. </li><li> Zur Verringerung der Wahrscheinlichkeit einer Kreuzkontamination, machen wir einen Katheter, der für jede Maus. Nachdem alle Katheter vorgenommen werden, sterilisieren durch die Exposition in einer ungedeckten Petrischale UV-Bestrahlung für mindestens 30 Minuten. Schauen Sie nicht direkt an UV-Lampen und setzen jeden Teil des Körpers in der Haube, während Lampen aktiviert werden. Nach UV-Bestrahlung kann Katheter langfristig aufbewahrt in der Petrischale werden. Wir empfehlen Abdichtung der Schale mit Parafilm zu helfen, der Aufrechterhaltung der Sterilität. </li></ol> II. Tierversuch <ol><li> Mäuse ankommen sollten mindestens eine Woche vor dem experimentellen Manipulation, um Stress-induzierten Störfaktoren zu vermeiden. Weibliche Mäuse werden verwendet, weil die männliche Harnröhre Maus ist extrem schwierig, einen Katheter. CBA / J ist ein häufig genutzt, UTI-anfällig Inzucht Mausstamm. Mäuse sollte zwischen 8 und 12 Wochen alt werden, denn dies ist das Fenster der immunologischen Reife vor Seneszenz. Am ersten Tag des Experiments, tauchen am Ende einer sterilen Impföse in ein Fläschchen mit gefrorenen Bakterien Lager. Abkratzen ein kleines Inokulum und Streifen auf einem geeigneten Agarplatte. Generell uropathogene E. coli (UPEC) und andere Stämme können über Nacht auf Luria-Bertani (LB)-Agar bei 37 ° C in der Umgebungsluft. UPEC Stämme wachsen als feste, gelblich-weiße durchscheinende Kolonien auf LB-Agar. Sofort wieder die bakterielle Lager in den Gefrierschrank. Uropathogene Bakterienstämme können sich weniger virulent im Laufe der Zeit mit wiederholten, Serials Kulturen. Wir empfehlen daher, Schlieren eine frische Agarplatte für jedes Experiment. </li><li> Am Tag 2 des Experiments, nach der Bestätigung richtige Koloniemorphologie, nehmen einzelne Kolonien von Agarplatten und in mindestens 5 ccm Bouillonkultur Nacht. LB-Medium kann für die meisten uropathogene Bakterienstämmen verwendet werden können (37 ° C, 200 rpm in der Luft). Halten Sie die Verschlusskappen locker auf der Bouillonkultur Rohre Belüftung zu ermöglichen. </li><li> Am Tag 3 des Experiments, nehmen 10% der ersten Bouillonkultur und Kultur in der Brühe über Nacht wieder (in der Regel 37 ° C und 200 rpm), um Typ-I-Pili Expression zu verstärken. Serielle Brühenkulturen helfen, bakterielle uropathogenicity optimieren, da Typ-I-Pili haben gezeigt worden, um eine kritische Virulenzfaktor für uropathogens in vivo 1 sein. Halten Sie die Verschlusskappen locker auf der Bouillonkultur Rohre Belüftung zu ermöglichen. </li><li> Am Tag 4 des Experiments, messen Sie die OD 600 der Bouillonkultur von Tag 3. Wenn nicht schon für den Bakterienstamm getestet bekannt, führen Sie das Zehnfache serielle Verdünnungsausstrichtest über mindestens 7 Logs (Verdünnungen mit PBS durchgeführt, Kulturen auf LB-Agar durchgeführt, 37 ° C Inkubation über Nacht), um die Beziehung zwischen OD 600 und cfu bestimmen / ml. Als Faustregel gilt, dass eine OD 600 von 0,4-0,5 allgemein entspricht 1-2x10 7 cfu pro 50 Mikroliter. Nachdem die Beziehung zwischen OD 600 und KBE / ml festgestellt worden ist, kann man die Brühe Kultur der OD 600 entsprechend der gewünschten KBE pro Maus in 50 Mikroliter PBS anpassen. Einige Arbeiten hat vorgeschlagen, dass Inokulation von 10 Mikroliter, anstatt 50, auf weniger Rücklauf in die kidneys6 führt. Allerdings haben die meisten Publikationen Verwendung von 50 Mikroliter pro Maus berichtet. Generell wird die gewünschte cfu liegt zwischen 10 6 und 108 KBE / Maus, aber jeder bakteriellen / Mausstamm Kombination muss empirisch in vivo getestet werden. </li><li> Um sicherzustellen, dass Inokula sind nicht sofort nach der Anwendung ungültig, sollte Mäuse von Wasser für mindestens 30 Minuten vor der Einleitung einer Vollnarkose nicht entzogen werden. Ein weiteres wichtiges Manöver ist zu veranlassen Blasenentleerung vor der Narkose-Induktion durch schnappen Mäusen und leichtes Drücken auf die untere Abdomen. Zwei bis 2,5% Isofluran ist eine sichere Induktionsdosis für 8-12 Wochen alte weibliche CBA Mäusen, durch Aufrechterhaltung der Narkose mit 1,8-2% Isofluran gefolgt. </li><li> Sobald Anästhesie erreicht ist, werden die Mäuse in Rückenlage mit dem Kopf in einem nosecone an Isofluran-Sauerstoff eingesetzt platziert. Der Unterleib ist massiert, um Urin aus der Blase zu evakuieren. Wenn die Blase ist relativ leer, so kann dieses Manöver nicht nachgeben Urin. Der Unterleib und Damm ist mit 70% Ethanol getränkt. </li><li> Eine sterile 1 ml-Spritze ohne Nadel dient zur Erstellung der gewünschten bakteriellen Inokulums. Als nächstes wird eine sterile Harnröhrenkatheter aseptisch auf die Spritze gesetzt. Die überschüssige Schlauch ist aus der Katheter mit einer Schere geschnitten, so dass nur 1-2 Millimeter der Schläuche distal der Spitze der Nadel bleiben. Dann wird die Spritze abgenommen und der Kolben mit der Spritze aufrecht, um alle Luftblasen zu entfernen deprimiert. Ein Klacks bakteriostatische Gleitgel ist auf eine sterile Petrischale oder der Innenseite der sterilen Spritze Wrapper gespritzt. Die Spitze des Katheters (mit angeschlossenem Spritze) ist in das Gelee getaucht. Wenn mehrere Bakterienstämme in das gleiche Experiment getestet werden, darauf achten, nicht den gleichen Tropfen Gelee verwenden, um Katheter mit verschiedenen Stämme zu schmieren. </li><li> Mit einem Stereo-Mikroskop (0.8x bis 5fach-Zoom-Bereich) für die Vergrößerung, ist die Vorhaut der Klitoris der narkotisierten Maus sanft in der nicht-dominanten Hand mit einem Paar feinzahnigen Pinzette gefasst und angehoben kopfwärts auf die dunkelrosa Urethraöffnung aussetzen ( Abbildung 1). Die Spritze (mit angeschlossenem Katheter) wird in der dominanten Hand mit einem Bleistift Grip erfassen und die Spitze des Katheters wird in der Harnröhre in einem 45 Grad-Winkel engagiert. Die Vorhaut der Klitoris entlang der Längsachse der Spritze gespannt ist, effektiv "Laden" die Harnröhre auf den Katheter. Dieses Manöver ist wichtig, da die Maus Harnröhre ist redundant. Der Katheter sollte sich leicht in die Blase (bis auf die Nabe, Bild 2) und kann sanft wirbelte um die Navigation der redundanten Falten der Harnröhre. Sobald der Katheter hubbed, kann die Spritze abgesenkt, bis sie parallel mit der Längsachse der Maus ist. Die nicht-dominante Hand fallen kann die Zange zur Stabilisierung der Position des Katheters und Spritze auf wie die dominante Hand wird verwendet, um langsam zu injizieren das Inokulum (mindestens 5 Sekunden). Wenn Flüssigkeit gesehen fließt um den Katheter während der Injektion, ist entweder die Blase voll ist oder die Katheter wird in die Vagina (nur kaudal der Harnröhre). Die Injektion sollte sofort gestoppt werden und die Position des Katheters sorgfältig geprüft. Wenn der Katheter in der Harnröhre, sollte die angegebene Maus nicht in das Experiment einbezogen werden. Auf der anderen Seite kann ein Katheter in die Vagina verlegt neu positioniert werden und die Injektion wieder versucht. Nach der Injektion wird der Katheter und Spritze langsam von der Maus gezogen. </li><li> Zur Verringerung der Wahrscheinlichkeit des frühen post-Impfung ungültig erklären, die verabreichten Bakterien evakuieren können und dadurch variable Infektionsraten führen, halten einige Forscher Mäusen unter Narkose für 30 Minuten nach transurethralen inoculation10. Nach der Operation sollte Mäusen auf eine saubere wärmende Decke mit kontinuierlicher Beobachtung wieder zur Rückkehr der normalen Atmung und Aktivität zu bestätigen. Sobald Tiere haben völlig die Fähigkeit zu kriechen erholt, können sie auf Betten-haltigen Käfige zurückgebracht werden. </li></ol> III. Mess-CFU in infiziertem Gewebe <ol><li> Verschiedene Maus UTI Publikationen zu Kultur Ergebnisse von 6 Stunden bis eine Woche oder länger nach der Impfung berichtet. Der optimale Zeitpunkt Punkte müssen empirisch für jede bakterielle / Mausstamm Kombination bestimmt werden. Gelassene Urin ist für die Kultur schnappen Maus über eine sterile Petrischale erhalten. Gesammelten Urin sollte auf Eis zu jeder Zeit eingehalten werden. Mehrere Versuche, gelassene Urin über viele Stunden erhalten kann es notwendig sein, da Maus Blasenentleerung ist häufig, geringes Volumen (30-100 Mikroliter pro void) und Stress-abhängig. </li><li> Nach Erhalt ungültig Urinproben, opfern wir Mäuse mit Isofluran und Genickbruch. Der Bauch ist aseptisch geöffnet. Wenn eine gelassene Urin Probe wurde nicht erfolgreich gewonnen erwähnt, kann eine kleine Menge von Urin oft durch die Blasenwand mit einer 30-Gauge-Nadel und Spritze abgesaugt werden. </li><li> Eine oder beide Nieren entfernt werden, Hackfleisch in mindestens 4 Stück (je Stück sollte weniger als 50 Mikrogramm) auf einer sterilen Petrischale, und legte in Zirkon Perlen / PBS-haltigen Kryoröhrchen auf Eis. Die Blase wird entfernt, fein gehackt in mindestens 4 Stück, und legte in Edelstahl Perle / PBS-haltigen Kryoröhrchen auf Eis. Das Gewebe / Perlen / PBS-haltigen Kryoröhrchen werden in a Bullet Blender Homogenisator gegeben und das Gewebe homogenisiert mit der "8" Geschwindigkeit für 1 Minute. Es ist üblich, für einige Gewebestücke nach der Homogenisierung bleiben. Solange 50-100 Mikroliter Flüssigkeit Homogenat pipettiert werden kann, feste Fragmentesind nicht unbedingt ein Problem. Wenn Homogenisierung Zeit für ein paar Proben erhöht wird, ist es wichtig, dies zu tun für alle Gewebe, um die Konsistenz der Homogenisierung zu halten. Wir verwenden a Bullet Blender homogenisiert, weil es die Möglichkeit einer Kreuzkontamination vermieden wird, ist schneller als die Verarbeitung einzelner Proben nacheinander mit einem Standard-Homogenisator, und nicht wesentlich erwärmen die Proben homogenisiert. </li><li> Mindestens zwei oder drei zehnfachen Verdünnungen der gesammelten Urin und Gewebehomogenaten sollte in einer Mikrotiterplatte durchgeführt werden. Für Vorversuche kann es ratsam, mindestens sieben Zehnfache Verdünnungen machen. Kultur bis zu 100 Mikroliter Urin, Blasen-und / oder Nieren-Homogenaten auf geeigneten Agar. Da Urinproben können Volumen-begrenzt, kann es notwendig sein, um ihr Volumen auf 100 Mikroliter vor zu bringen, um die Durchführung Zehnfache Verdünnungen. Wenn dies erforderlich ist, wird die anfängliche Verdünnung (vor zehnfachen Verdünnung) müssen in die endgültige Berechnung der bakteriellen Erträge berücksichtigt. Wir bevorzugen Kultivierung UPEC auf Eosin-Methylenblau oder MacConkey Agar (Inkubation über Nacht bei 37 ° C), da diese Medien für Gram-negative Organismen selektiv. UPEC Stämme wachsen auf MacConkey Agar als zentral genabelt, rot-rosa Kolonien aufgrund ihrer Fähigkeit, Laktose zu fermentieren. </li><li> Nach Übernacht-Kultur, zählen die cfu für jede Platte. Für seriell verdünnten Proben wird die Platte Verdünnung mit 50-100 Kolonien als die genaueste Zählung. "Zurück"-Berechnung KBE pro Gewebe pro Milligramm Gewebe oder pro ml. </li></ol> IV. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Harnröhre (dunkelrosa Gewebe) durch Anheben Klitorisvorhaut mit einer Pinzette (jenseits oben Foto) kopfwärts ausgesetzt <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Harnröhre katheterisiert. Die gespaltene Klitoris kann direkt über den Katheter zu sehen. <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Bladder cfu zählt 2 Tage nach der transurethralen Infektion von 8 Wochen alte weibliche CBA / J-Mäusen mit uropathogene E. coli. Blasen wurden homogenisiert und KBE / ml bestimmt durch serielle Verdünnung Plattierung auf MacConkey Agar. Diamanten weisen KBE / ml für einzelne Mäuse, zeigt Reck Median KBE / ml.

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</ol>

Die Induktion der Maus Harnwegsinfektion durch transurethrale Inokulation von Bakterien ist eine seit langem etablierte, aber technisch anspruchsvollen Verfahren 11. Hung und Hultgren kürzlich veröffentlichten einen ausgezeichneten Überblick über transurethralen Techniken der Maus Harnwegsinfektion 13. In diesem Papier versuchen wir, weiter zu veranschaulichen, die Feinheiten dieser experimentelle Ansatz. Anfänger können ihre Technik, indem Sie eine Mittellinie Laparoto...

<table><tbody><tr><td>Kryoröhrchen, 2,0 ml aus Polypropylen (ohne Deckel)</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>640201</td><td></td></tr><tr><td>Deckel für Kryoröhrchen, mit &amp;rsquo;O&amp;rsquo;-Ring</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>440011-N</td><td></td></tr><tr><td>Bullet-Blender</td><td>Next Advance</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>Zirkoniumoxid-Kügelchen (0,5 mm)</td><td>Next Advance</td><td>ZROB05</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahlkügelchen (1,6 mm)</td><td>Next Advance</td><td>SSB16</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahlkügelchen-Mischung (0,9–2,0 mm)</td><td>Next Advance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>CBA/J-Mäuse, weiblich, 8–12 Wochen alt</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000656</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 4,3 mM, KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 1,4 mM)</td><td>EMD Millipore</td><td>EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;) EM-5108-1 (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td></td></tr><tr><td>LB-Agar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB-Brühe</td><td>EMD Millipore</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran (Aerrane)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>NDC 10019-773-60</td><td></td></tr><tr><td>Inokulationshaken</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-601</td><td></td></tr><tr><td>Eosin-Methylenblau (EMB)-Agar-Pulver</td><td>Himedia Laboratories</td><td>MM022-500G</td><td></td></tr><tr><td>MacConkey-Agar-Pulver</td><td>Difco Laboratories</td><td>212123</td><td></td></tr><tr><td>LB-Agar-Pulver</td><td>Difco Laboratories</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Intramedic nicht-röntgenopakes Polyethylenrohr, PE10 [Innendurchmesser 0,28 mm (0,011 Zoll); Außendurchmesser 0,61 mm (0,024 Zoll)]</td><td>BD Biosciences</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>30-Gauge-Nadeln, 1/2 Zoll</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>1-ml-Tuberkulinspritze mit Slip-Tip</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>3-ml-Luer-Lock-Spritze</td><td>BD Biosciences</td><td>309585</td><td></td></tr></tbody></table>

transurethrale induktion von maus harnwegsinfekt

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Uropathogene Bakterienstämme von Interesse sind, auf Agar gewachsen. Generell uropathogene<em&gt; E. coli</em&gt; (UPEC) und andere Stämme können über Nacht auf Luria-Bertani (LB)-Agar bei 37 ° C in der Umgebungsluft. UPEC Stämme wachsen als gelblich-weiße durchscheinende Kolonien auf LB-Agar. Nach der Bestätigung der entsprechenden Koloniemorphologie sind einzelne Kolonien griff dann in Brühe gezüchtet werden. LB-Medium kann für die meisten uropathogene Bakterienstämmen verwendet werden können. Zwei serielle, über Nacht LB Bouillon-Kulturen eingesetzt, um die Expression von Typ-I-Pili, eine gut definierte Virulenzfaktor für uropathogene Bakterien zu verbessern. Bouillon-Kulturen sind auf die gewünschte Konzentration in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Acht bis 12 Wochen alte weibliche Mäuse werden unter Isofluran-Narkose gelegt und transurethral mit Bakterien mit Polyethylen-Rohr bedeckt 30-Gauge-Spritzen geimpft. Typische Inokula, die empirisch für jede bakterielle / Maus-Stamm-Kombination ermittelt werden, sind 10<sup&gt; 6</sup&gt; Bis 10<sup&gt; 8</sup&gt; KBE pro Maus in 10 bis 50 Mikroliter PBS. Nachdem die gewünschte Infektion Zeitraum (ein Tag bis zu mehreren Wochen), Urinproben und der Blase und beide Nieren entnommen. Jedes Organ ist Hackfleisch, platziert in PBS und homogenisiert in einem Blue Bullet Homogenisator. Urin-und Gewebehomogenaten werden seriell in PBS verdünnt und über geeignete Agar. Am nächsten Tag sind koloniebildende Einheiten gezählt.

Dieses Video demonstriert Methoden zur transurethral induzieren Maus Harnwegsinfektionen und zu quantifizieren, das Ausmaß der daraus resultierenden Infektionen.

Transurethrale Induktion von Maus Harnwegsinfekt

Die relevanten uropathogenen Bakterienstämme werden auf Agar kultiviert. Im Allgemeinen können uropathogene E. coli (UPEC) und andere Stämme über Nacht auf ... grown werden.

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Harnwegsinfektion bei der Maus transurethral zu induzieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die gewünschten Bakterienstämme kultiviert und die Kulturen auf die gewünschte Konzentration verdünnt werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Mausblase transurethral mit den gewünschten Bakterienstämmen zu infizieren.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, Urinproben zu sammeln und Nieren sowie Blasen zu entnehmen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Inokulation von Auger-Platten mit Urin sowie homogenisierten Nieren- und Blasenproben. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die auf eine erfolgreiche Infektion des Harntrakts basierend auf dem Vorhandensein bakterieller Kolonien in den ausgestrichenen Proben hinweisen.Hallo, ich bin Michael Shea, und herzlich willkommen in meinem Labor der Abteilung für Urologie an der medizinischen Fakultät der Stanford University. Ich bin Annu ti, ebenfalls aus dem Shea-Labor. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur transurethralen Katheterisierung bei Mäusen.Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Induktion einer Harnwegsinfektion bei Mäusen zu untersuchen. Beginnen wir also. In einer laminaren Flusswerkbank schneiden Sie ein 30 Zentimeter langes Stück Polyethylenrohr ab und befestigen eine 30-Gauge-Nadel an einer sterilen 3-Kubikzentimeter-Spritze.Verwenden Sie sterile Pinzette, um ein Ende des durchtrennten Schlauchs aufzunehmen, und schieben Sie ihn auf die Nadel, bis er am Nadelaufsatz anliegt. Schneiden Sie den Schlauch so zu, dass etwa zwei Zentimeter über die Nadelspitze hinausragen. Dies trägt dazu bei, Verletzungen an Mäusen während der Katheterisierung zu vermeiden.Entfernen Sie den Katheter von der Spritze und legen Sie ihn in eine sterile Petrischale. Bereiten Sie einen Katheter pro Maus vor, die infiziert werden soll. Sterilisieren Sie die Katheter mittels UV-Bestrahlung für mindestens 30 Minuten.Versiegeln Sie eine Petrischale mit Parafilm, um den Katheter für die Langzeitlagerung steril zu halten. Impfen Sie eine geeignete Agarplatte mit einem Inokulum einer gefrorenen Stammlösung des gewünschten Bakterienstamms aus. Hier wird ein Inokulum von uropathogenem E. coli oder UPEC zur Übernachtbebrütung bei 37 Grad Celsius ausgestrichen.Entnehmen Sie einzelne Kolonien mit der korrekten Morphologie, die im Fall von UPEC feste, gelbliche, durchsichtige Kolonien auf LB-Agar sind, und geben Sie sie in mindestens fünf Milliliter flüssige Brühe zur Übernachtkultur bei 37 Grad Celsius unter Schütteln mit 200 Umdrehungen pro Minute. Geben Sie 10 % der ersten Brühe-Kultur frischem Medium hinzu und kultivieren Sie erneut über Nacht. Um erneut die Expression von Typ-1-Pilus, die mit der uropathogenen Pathogenese in vivo assoziiert ist, zu verstärken, messen Sie den OD600 der Kultur, um die Anzahl an koloniebildenden Einheiten zu bestimmen.Abgekürzt: KBE pro Milliliter Kultur. Verdünnen Sie die Kultur mit steriler 1× PBS, sodass die Endkonzentration zwischen 10⁶ und 10⁸ KBE in 10 bis 50 Mikroliter liegt, um sicherzustellen, dass die Inokula nicht sofort ausgeschieden werden. Nach der Applikation entziehen Sie den Mäusen 30 Minuten vor der Anästhesie Wasser, greifen die Maus im Nackenfell und drücken vorsichtig auf den unteren Bauchbereich, um das Ausscheiden von Urin zu fördern.Legen Sie die anästhesierte Maus auf den Rücken, wobei der Kopf in einer Nasenkappe steckt, die mit Sauerstoff und Isofluran verbunden ist. Massieren Sie den Bauch, um restlichen Urin aus der Harnblase zu entfernen. Benutzen Sie eine Sprühflasche, um den unteren Bauchbereich und das Perineum mit 70 %igem Ethanol zu benetzen.Verwenden Sie anschließend eine sterile Ein-Milliliter-Spritze, um den bakteriellen Inokulum aufzuziehen. Befestigen Sie einen vorbereiteten sterilen Katheter an der Spritze. Schneiden Sie das Schlauchstück mit einer Schere so ab, dass es nur ein bis zwei Millimeter über die Nadelspitze hinausragt.Dies hilft, Verletzungen an Mäusen während der Katheterisierung zu vermeiden. Klopfen Sie leicht auf die Spritze und drücken Sie den Kolben zusammen. Um Luftblasen zu entfernen, befeuchten Sie den Katheter, indem Sie ihn in einen Klecks bakteriostatischer Schmiergel tauchen. Verwenden Sie für jeden zu testenden Bakterienstamm unbedingt einen separaten Klecks Gel unter dem Stereomikroskop.Verwenden Sie eine feinzahnige Pinzette in der nicht-dominanten Hand, um die Vorhaut des Klotis vorsichtig zu fassen und anzuheben, um die tiefrosa Harnröhre ATU in der dominanten Hand freizulegen. Greifen Sie die Spritze mit angebrachtem Katheter. Führen Sie mit einem Bleistiftgriff die Katheterspitze in einem Winkel von 45 Grad relativ zum Bauch der Maus in die Harnröhre ATU ein.In der mittigen sagittalen Ebene. Dehnen Sie die Klitorishaut entlang der langen Achse der Spritze. Dadurch wird die Harnröhre effektiv auf den Katheter aufgebracht.Der Katheter sollte bei Bedarf leicht in die Blase gleiten. Drehen Sie den Katheter vorsichtig, um die überzähligen Falten der Harnröhre zu passieren. Sobald der Katheter bis zum Ansatz eingeführt ist, senken Sie die Spritze parallel zum Abdomen der Maus ab.Legen Sie die Pinzette ab und stabilisieren Sie mit der nicht-dominanten Hand den Katheter und die Spritze. Injizieren Sie das Inokulum langsam über einen Zeitraum von mindestens fünf Sekunden. Wenn während der Injektion Flüssigkeit um den Katheter herum sichtbar ist, ist die Harnblase voll oder der Katheter befindet sich in der Vagina.Beenden Sie die Injektion und überprüfen Sie die Katheterposition. Positionieren Sie den Katheter bei Bedarf erneut in der Harnröhre. Ziehen Sie den Katheter nach der Injektion langsam zurück.Halten Sie die Maus nach der Inokulation eine halbe Stunde unter Anästhesie. Um das Risiko einer Harnentleerung nach der Operation zu verringern, lassen Sie die Maus auf einer sauberen Heizdecke unter kontinuierlicher Beobachtung aus der Narkose aufwachen, um die Wiederherstellung normaler Atemmuster und Aktivität zu bestätigen. Sobald sie sich vollständig erholt hat und kriechen kann, bringen Sie die Maus in einen Käfig mit Einstreu zurück.Je nach Kombination der Bakterien- und Mausstämme kann eine vollständige Infektion zwischen sechs Stunden und einer Woche dauern. Um dies zu erreichen, stellen Sie während mehrerer Stunden für jede infizierte Maus eine sterile Petrischale auf Eis. Greifen Sie die Maus am Nackenfell über der Schale, um Urin zur Kultur zu sammeln.50 Mikroliter Urin sollten ausreichen. Pipettieren Sie den Urin in ein Mikrozentrifugenröhrchen, verschließen Sie es und bewahren Sie den Urin auf Eis auf. Unter dem Stereomikroskop legen Sie eine euthanasierte Maus auf den Rücken auf ein Präparationsbrett.Sprühen Sie den Bauch mit 70 % Ethanol ein. Verwenden Sie eine Schere, um einen drei bis vier Zentimeter langen Schnitt in die Haut und die darunterliegende Bauchwand zu machen. Falls nötig, verwenden Sie Nadeln, um die Bauchwand von den Bauchinhalten wegzuziehen.Falls frühere Versuche zur Urinsammlung erfolglos waren, Urin mithilfe einer 30-Gauge-Nadel und einer Spritze direkt durch die Blasenwand aspirieren. Die Nieren mit Pinzette und Schere entfernen. In eine sterile Petrischale überführen und jede Niere in mindestens vier Stücke zerkleinern, die jeweils etwa zwei bis drei Millimeter groß sind.Überführen Sie jedes Nierenfragment in ein Kryoröhrchen, das fünf bis sechs sterile Zirkoniumoxidkugeln mit einem Durchmesser von 0,5 Millimetern und 400 Mikroliter sterilem PBS enthält. Bewahren Sie die Nierenproben auf Eis auf. Entfernen Sie die Harnblase mithilfe von Pinzette und Schere.Zerkleinern Sie die Harnblase mit derselben Methode wie die Nieren. Überführen Sie jedes Harnblasenfragment in ein Kryoröhrchen, das 1,6 Millimeter große Stahlkugeln und 200 Mikroliter sterile PBS enthält, und bewahren Sie die Röhrchen auf Eis auf. Stellen Sie die Röhrchen in einen Bullet-Blender-Homogenisator und homogenisieren Sie das Gewebe bei Stufe acht für mindestens eine Minute.Es ist üblich, dass nach der Homogenisierung einige Gewebefragmente verbleiben. Alle Proben sollten für die gleiche Dauer in einer Mikrotiterplatte homogenisiert werden. Stellen Sie serielle zehnfache Verdünnungen des gesammelten Urins und des Gewebehomogenats mit Eis her.Kalte PBS-Aufschwemmung. Die Verdünnung ist abgeschlossen. Geeignete Agarplatten werden über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert.Die koloniebildenden Einheiten (CFU) pro Organ, Milligramm Gewebe oder Milliliter Urin können anhand der Anzahl der Kolonien auf jeder Platte rückgerechnet werden. Mithilfe dieser Techniken untersuchen wir, wie Mutationen in bakteriellen Stressantworten die Fähigkeit von UPEC beeinflussen, eine Harnwegsinfektion in vivo auszulösen sowie Antibiotika, die infizierten Mäusen verabreicht werden, zu widerstehen. Diese Tabelle zeigt die Fähigkeit des wildtypischen UPEC, die Mausblase nach transurethraler Inokulation zu infizieren.Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Mäusen transversal Harnwegsinfektionen induziert. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Mäuse schonend zu katheterisieren. Eine korrekte Technik ermöglicht eine leichte Katheterisierung, erfordert jedoch möglicherweise etwas Übung.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

transurethral-induction-of-mouse-urinary-tract-infection

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Luyts, N., et al. Longitudinale Nachbeobachtung von Harnwegsinfektionen und deren Behandlung bei Mäusen mittels Biolumineszenzbildgebung. J. Vis. Exp. (2021).Dieses Video demonstriert die Induktion und Verfolgung einer Harnwegsinfektion in einem Mausmodell unter Verwendung biolumineszenter E. coli, die in die Blase injiziert wird, wo bakterielle Adhäsion, Invasion und intrazelluläre Replikation stattfinden. Das vom biolumineszente Operon ausgesendetes Licht dient als Echtzeit-Marker für...

Visualisierung der Harnwegsinfektion in einem Mausmodell mittels Biolumineszenz

Quelle: Conover, M. S. et al., J. Etablierung und Charakterisierung von Harnwegsinfektionen und CAUTI in einem Mausmodell. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video zeigt das Verfahren zur Montage und Implantation eines transurethralen Katheter in einer weiblichen Maus, gefolgt von einer bakteriellen Impfung zur Etablierung katheterassoziierter Harnwegsinfektion und zur Untersuchung biofilmvermittelter Wirts-Pathogen-Interaktionen.

Katheterassoziierte Harnwegsinfektion in einem Mausmodell

Quelle: Conover, M. S. et al., Etablierung und Charakterisierung von Harnwegsinfektionen und CAUTI in einem Mausmodell. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video demonstriert den Nachweis intrazellulärer bakterieller Gemeinschaften (IBCs) im Gewebe der Mausblase, infiziert mit β-galactosidase-exprimierender Escherichia coli. Nach Gewebefixation, Permeabilisierung und Färbung mit X-gal erscheinen IBCs als blaue Puncta unter einem Sektionsmikroskop, was eine bakterielle Invasion während der...

Visualisierung intrazellulärer Bakteriengemeinschaften in einer infizierten Mausblase

In diesem Video beschreiben wir die Technik zur intravesikalen Verabreichung von uropathogenen Bakterien, um ein Harnwegsinfektionsmodell bei Mäusen zu erstellen. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Ausbreitung uropathogener bakterieller Infektionen im Harnsystem und die Mechanismen zu verstehen, die die Anfälligkeit für Harnwegsinfektionen bestimmen.

Generierung eines Harnwegsinfektionsmodells: Eine Technik zur Verabreichung uropathogener Bakterien in der Maus zur Entwicklung eines Harnwegsinfektionsmodells

Dieses Video zeigt die Etablierung einer uropathogenen Escherichia coli-Infektion in einer weiblichen Mausblase durch transurethrale Katheterinstillation. Die injizierten Bakterien etablieren erfolgreich eine Harnwegsinfektion in der Blase und bieten eine wertvolle Plattform für die Untersuchung von nosokomialen Erkrankungen im Zusammenhang mit den Harnwegen.

Transurethrale Katheterisierung und bakterielle Inokulation zur Erstellung eines Harnwegsinfektionsmodells bei männlichen Mäusen

Etablierung eines Modells für Harnwegsinfektionen bei weiblichen Mäusen

Die Fähigkeit, Harnwegsinfektionen (HWI) zu modellieren, ist entscheidend, um die bakterielle Pathogenese verstehen und die Entwicklung neuartiger Therapeutika vorantreiben zu können. Das Ziel dieser Arbeit ist es, Mausmodelle für experimentelle Harnwegsinfektionen und katheterassoziierte Harnwegsinfektionen zu demonstrieren, die die beim Menschen beobachteten Ergebnisse rekapitulieren und vorhersagen.

Aufbau und Charakterisierung von UTI und CAUTI in einem Mausmodell

Das etablierte Modell der transurethrale Katheterisierung von Mäusen ermöglicht die Untersuchung von Erkrankungen der Blase, einschließlich urinausscheidende Fläche Infektion, aber kann nur bei Frauen durchgeführt werden. Ein neues Modell der männlichen transurethrale Instillation, das hier vorgestellte wird Forschung in einem Gebiet, geprägt von starken klinischen und epidemiologischen Unterschiede zwischen den Geschlechtern zu ermöglichen.

Urinausscheidende Fläche Infektion in eine kleine Tiermodell: transurethrale Katheterisierung von männlichen und weiblichen Mäusen

Transurethrale Instillation ist eine anspruchsvolle Verfahren und nicht gut in der Literatur beschrieben. Dieses Manuskript soll eine Technik für transurethrale einführen eines Katheters für intravesikale Lieferung von Flüssigkeiten mit Wirkstoffen in der urinausscheidenden Blase und/oder Prostata bei erwachsenen männlichen Mäusen zu beschreiben.

Transurethrale Instillation Verfahren bei erwachsenen männlichen Maus

Ein Mausmodell der uropathogenen transurethralen E. coli (UPEC) -Inokulation zur Etablierung latenter intrazellulärer Blasenreservoirs und einer anschließenden Blasenexposition gegenüber G. vaginalis zur Induktion einer rezidivierenden UPEC-Harnwegsinfektion ist nachgewiesen. Ebenfalls demonstriert werden die Aufzählung von Bakterien, die Urinzytologie und die In-situ-Blasenfixierung und -verarbeitung für die Rasterelektronenmikroskopie.

Rezidivierende Escherichia coli Harnwegsinfektion, ausgelöst durch Gardnerella vaginalis Blasenexposition bei Mäusen

Dieses Manuskript beschreibt die intravesikale Verabreichung  von uropathogenen Bakterien mit einem Lux-Operon zur Induktion einer Harnwegsinfektion bei Mäusen und die anschließende longitudinale In-vivo-Analyse der Bakterienbelastung mittels Biolumineszenzbildgebung.

Longitudinale Nachsorge von Harnwegsinfektionen und deren Behandlung bei Mäusen mittels Biolumineszenz-Bildgebung

Lernen Sie die transurethrale Induktion von Harnwegsinfektionen bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht die präzise Inokulation bakterieller Stämme und die quantitative Analyse von Infektionen in vivo.

Transurethrale Induktion von Maus Harnwegsinfekt

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