Live Cell Reaktion auf mechanische Stimulation von Integrated Optical und Atomic Force Microscopy Studium

Die Untersuchung der Echtzeit-Zellreaktion auf mechanische Stimulation wird erreicht, indem zunächst Zellen gezüchtet werden, die GFP-Fusionsproteine 24 Stunden lang auf Glasbodenschalen exprimieren. Der zweite Schritt besteht darin, die Spitze A FM mit biotinyliertem Fibronektin zu beschichten. Dann wird die funktionalisierte a FM-Spitze in Kontakt mit der Zelloberfläche gebracht, um eine starke fokale Adhäsion um die A FM-Spitze zu ermöglichen, die eine direkte Manipulation des Aktzytoskeletts durch eine Matrix-Integrin-Aktin-Bindung zwischen der Fibronektin-beschichteten Spitze und der Zelle ermöglicht.

Der letzte Schritt besteht darin, die lebende Zelle durch kontrollierte Aufwärtsbewegung der A FM-Spitze mechanisch zu stimulieren, so dass die vertikale Kraft an der Kontaktstelle der Zelle aufgebracht wird, ohne die starke fokale Adhäsion zu unterbrechen. Letztendlich zeigen die Ergebnisse, dass Zellen auf die mechanische Stimulation reagieren, indem sie ihre Bindung an das Substrat verstärken und eine Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts induzieren, wie mit optischer Echtzeit-Fluoreszenzbildgebung aufgezeichnet wurde. Hallo, ich bin Andrea Trake, Assistenzprofessorin in der Abteilung für Systembiologie und Translationale Medizin am Texas a and m Health Science Center.

Hallo, ich bin Sum Lim. Ich bin Postdoktorand in der Abteilung für Systembiologie und Translationale Medizin am Texas a and m Health Science Center. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Untersuchung des adaptiven zellulären Umbaus durch mechanische Stimulation.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um den Umbau des Zytoskeletts in Echtzeit in lebenden vaskulären glatten Muskelzellen zu untersuchen. Also lasst uns loslegen. Für diese Studien wird ein inverses Olympus IX 81 Mikroskop mit Totalreflexionsfluoreszenz oder Rasenaufsatz in Kombination mit einem CSU 22 Yokogawa Scankopf verwendet.

Auf dem inversen optischen Mikroskop ist ein Bioskop SZ Rasterkraftmikroskop montiert. Das gesamte System ist auf einem optischen Tisch in Forschungsqualität montiert und wurde bereits ausführlich beschrieben. Dieses integrierte Mikroskop verwendet zwei quant EM elektronenmultiplizierende ladungsgekoppelte Geräte oder E-M-C-C-D-Kameras.

Einer ist für die Rasenbildgebung und der andere für die konfokale Bildgebung. Die konfokale Baugruppe, die aus dem externen Filterrad des Spinning-Disc-Scanners und einer E-M-C-C-D-Kamera besteht, ist auf einer Aluminium-Grundplatte montiert, die auf einem Silikonpad platziert ist, das für die Schwingungsdämpfung erforderlich ist. Die gesamte konfokale Baugruppe ist durch einen Flansch mit einem Gewindekragen mit dem Mikroskop verbunden.

So kann die Baugruppe bei der Rasterkraftmikroskopie oder einer FM-Messung vom Mikroskop entkoppelt werden, um Vibrationen durch den Spinning-Disc-Scanner zu vermeiden. Ein Argon-Krypton-Laser wird als Anregungsquelle sowohl für den Rasen- als auch für den konfokalen Bildgebungsmodus verwendet. Der Laser kann an eine der beiden optischen Fasern gekoppelt werden, die den Laser an den Rasenaufsatz oder den konfokalen Abtastkopf abgeben

Zweitens: Computer steuern das System. Eine verwendet eine Diabuch-Software, die die optische Bildgebung steuert, und die andere Nano-Scope-Software, die das A FM 24 Stunden vor dem mechanischen Stimulationsexperiment steuert und lebende Zellen, die GFP-Konstrukte exprimieren, die gegen bestimmte Proteine gerichtet sind, in einer Zellkulturschale mit Glasboden platziert. Ersetzen Sie am Tag des Experiments das Zellkulturmedium durch phenolrotfreies Medium.

Da ein FM-Experiment sehr geräuschempfindlich ist, vermeiden Sie es, während des Experiments zu sprechen oder den optischen Tisch oder das Mikroskop zu berühren, um das Rauschen zu minimieren. Entkoppeln Sie bei den a FM-Messungen die konfokale Spinning-Scheibe vom Mikroskop. Das Experiment beginnt mit der Montage der Zellkulturschale auf einem FM-Tisch mit einem magnetischen Kragen, um die Schale am magnetischen Mikroskoptisch zu befestigen.

Der V-förmige Ausleger der A FM-Sonde ist mit der biotinylierten Glasperle mit zwei Mikrometern ausgestattet. Der Ausleger ist mit dem Mikroskop gut zu erkennen. Ganz am Ende des Auslegers wird die Raupe verklebt, und dort sollte die Beschichtungslösung tropfenweise aufgetragen werden.

Um die FM-Sonde für das Experiment vorzubereiten, montieren Sie zuerst die Spitze in den Glashalter und setzen Sie dann den Glashalter auf die Tischhalterung, um die Spitze zu beschichten. Waschen Sie die Spitze, indem Sie vorsichtig 10 Mikroliter Docos phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder DPBS ganz am Ende der Spitze abtropfen lassen, und verwenden Sie dann ein Kim-Tuch, um die Spitze zu trocknen. Wiederholen Sie diesen Vorgang fünfmal nach dem Waschen mit DPBS bei einem Milligramm pro Milliliter.

Avid in Lösung. Tropfen über die Spitze. Lassen Sie die Spitze nach der Avadon-Beschichtung fünf Minuten lang inkubieren.

Waschen Sie die Spitze noch fünfmal mit DPBS. Dann vernetzen Sie biotinyliertes Fibronektin mit dem Avadon, indem Sie eine Lösung von einem Milligramm pro Milliliter hinzufügen. Tropfen Sie es auf die Spitze und inkubieren Sie es fünf Minuten lang.

Zum Schluss waschen Sie die Spitze noch einmal fünfmal mit DPBS, wobei der letzte Tropfen auf der Spitze bleibt. Sobald die Spitze vorbereitet wurde, montieren Sie sie auf den FM-Scanner. Platzieren Sie nach der Montage der FM-Spitze eine schützende Silikonschürze um die Halterung.

Richten Sie dann das Mikroskop für die Videobetrachtung ein. Richten Sie als Nächstes die FM-Spitze in der Mitte des Sichtfelds aus. Stellen Sie den optischen Hebel ein, indem Sie den Laserstrahl ganz am Ende des Auslegers platzieren.

Tauschen Sie dann das Objektiv gegen das richtige Objektiv mit hoher Vergrößerung für die Einzelzellbildgebung aus. Bringen Sie dann die Zelle, die mechanisch stimuliert werden soll, in das Sichtfeld und wählen Sie eine Stelle, an der die A FM Spitze auf der Zelloberfläche landen soll. Senken Sie schließlich die FM-Spitze ab, bis sie auf dieser bestimmten Zelle aufsetzt.

Nachdem Sie die Spitze mit der Zelle in Kontakt gebracht haben, warten Sie etwa 20 Minuten. Dies ermöglicht die Bildung einer starken fokalen Adhäsion an einem FM-Kontaktpunkt auf der Zelloberfläche. Nach der Wartezeit kann mit dem mechanischen Stimulationsverfahren begonnen werden, um das mechanische Stimulationsexperiment vorzubereiten.

Wechseln Sie von der Videokamera zur E-M-C-C-D-Kamera, um die Fluoreszenzzellen für die Bildgebung betrachten zu können. Nehmen Sie dann ein erstes Bild der ruhenden Zelle auf. Verwenden Sie eine rotierende Scheibe und Stimmmikroskopie, um den Akt im Zytoskelett im gesamten Zellkörper sichtbar zu machen.

Umgekehrt verwenden Sie Rasen, um fokale Adhäsionen zu visualisieren und die Zelle zu stimulieren. Verwenden Sie den Ausleger, um alle drei bis fünf Minuten eine kontrollierte Aufwärtsbewegung in diskreten Schritten auszuführen. Bei der Erfassung der A-FM-Daten ist es wichtig, dass der Bediener die Spannung der Z-Piso-Position ständig überwacht, um das richtige Timing für den vertikalen Pol zu bestimmen.

Parallel zu einer FM-Datenerfassung können Sie nach jedem vertikalen Zug mit der Diabuch-Software ein konfokales oder Rasenbild der Zelle aufnehmen. Ziehen Sie schließlich die FM-Spitze nach Abschluss des Stimulationsexperiments aus der Zelle zurück. Eine vaskuläre glatte Muskelzelle, die mit Aktin, MRFP und vcul transfiziert wird.

GFP wurde mit Hilfe eines FM an der apikalen Zelloberfläche abgebildet. Dieselbe Zelle wurde mit Hilfe von Torf an der basalen Zelloberfläche abgebildet. Hier überlappen sich die beiden Bilder.

Ein Bild derselben Zelle wurde auch mit einer konfokalen Spinning-Scheibe im gesamten Zellkörper aufgenommen und wird als maximale Projektion eines 3D-Stapels dargestellt. Es werden gute Überlappungen zwischen den konfokalen Bildern der A FM und der rotierenden Scheibe gezeigt. Ihre vaskuläre glatte Muskelzelle, die mit Aktin MRFP transfiziert wurde, wurde mechanisch mit dem A FM stimuliert und durch konfokale Spinning-Disc-Mikroskopie abgebildet.

Die Fehler deuten auf wirkende Fasern hin, die nach einer FM-Stimulation eine bemerkenswerte Umstrukturierung zeigen. Einige wirkende Fasern polymerisieren, während andere durch die mechanische Stimulation depolymerisieren, andere wirkende Fasern bündeln sich. Aufgrund der Umstrukturierung des Aktes haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie Sie mit EFM eine Lebensverkaufskultur mechanisch stimulieren und gleichzeitig die CY-Neuanordnung mit optischen Bildgebungsverfahren aufzeichnen können.

Bei dieser Prozedur ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass das FM-Experiment extrem verrauscht und empfindlich ist. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück mit Ihren Aussagen.