Targeting von Deep Brain Strukturen mit Mikroinjektionen für die Lieferung von Drogen, virale Vektoren oder Zelltransplantaten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, hochpräzise Mikroinjektionen in tiefliegende Hirnstrukturen vorzunehmen, um Medikamente, virale Vektoren oder Zelltransplantate zuzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst Glaskapillarnadeln mit einem 50-Mikrometer-Lumen hergestellt werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Nadel zu 50 % mit Mineralöl durch Kapillarwirkung zu füllen und den Kolben am breitesten Ende des Röhrchens einzuführen.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Nadel mit der Substanz oder Zellsuspension, die injiziert werden soll, zu befüllen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Einführung der Nadelspitze und die Injektion der Substanz mit sehr geringer Flussrate in eine tiefliegende Hirnstruktur. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine sehr präzise Zielgerichtetheit von Substanzen im Gehirn durch Mikroinjektionen mit einem Glas-Kapillarrohr zeigen.

Hallo, ich bin Oscar Gonzalez aus dem Labor für Neurowissenschaften der Fakultät für Psychologie an der Universität von Colima, Mexiko. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Durchführung von Mikroinjektionen mit einer Glas-Kapillare, um Wirkstoffe in das Gehirn einer Maus zu verabreichen. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um adulte neuronale Stammzellen zu untersuchen.

Beginnen wir also. Die Verwendung von Glas-Kapillarnadeln mit einem Lumen von 50 Mikrometern für Mikroinjektionen ins Gehirn reduziert das Hirngewebedes erheblich, minimiert die passive Diffusion von Wirkstoffen und ermöglicht eine präzise Zielgenauigkeit im Gehirn von Nagetieren. Bevor Mikroinjektionen durchgeführt werden können, müssen die Glasnadeln hergestellt werden.

Platzieren Sie zunächst das Kapillarglasrohr in einer hochwiderständigen Elektrode eines Mikropipettenzuggeräts. Schalten Sie danach die Elektrode des Mikropipettenzuggeräts ein. Um den mittleren Bereich des Glasrohrs lokal aufzuweichen, dehnen Sie das Glasrohr entlang seiner Längsachse um einen Anfangsabstand von drei bis fünf Millimetern, was ausreicht, um eine Verringerung des Durchmessers des Glasrohrs in dem lokal begrenzten Bereich zu bewirken.

Strecken Sie die Glasröhre weiter, bis sie bricht. Wiederholen Sie diese Schritte, um zwei identische Einzelkanalnadeln herzustellen. Legen Sie nun die Glasnadeln in eine Mikroschmiede.

Ein Winkel von 30 Grad reicht aus, um die Spitze abzuschärfen. Legen Sie die Nadeln schließlich unter das Mikroskop und prüfen Sie, ob beide den korrekten Innendurchmesser aufweisen. Für die meisten hydrophilen Wirkstoffe ist ein Innendurchmesser von 30 bis 50 Mikrometer bei den hergestellten Nadeln ideal.

Sehen wir uns an, wie man sie für Mikroinjektionen verwendet. Füllen Sie zunächst die hergestellte Nadel an ihrem breitesten Ende mit Mineralöl. Lassen Sie das Mineralöl durch Kapillarwirkung eindringen, bis es etwa 50 % der Länge des Kapillarrohrs erreicht hat.

Tragen Sie Hochvakuumfett am breitesten Ende der Nadel auf und führen Sie den Kolben hindurch. Drücken Sie vorsichtig das Mineralöl, bis ein kleiner Tropfen aus der Spitze der Glasnadel austritt. Befestigen Sie nun die Nadel in der Halterung des Mikroinjektors und beginnen Sie mit der Vorbereitung des Tieres für die Injektion.

Legen Sie zunächst eine Heizplatte an den stereotaktischen Tierhalter, um die Körpertemperatur des Tieres auf 37 Grad Celsius zu halten. Rasieren Sie den Kopf der anästhesierten Maus und bringen Sie sie anschließend in das stereotaktische Gerät ein, wobei Sie sie sicher befestigen. Verwenden Sie Ohrstifte und einen Zahnhalter und führen Sie mit einem chirurgischen Skalpell einen Hautschnitt von den Ohren bis zur Lambda-Schädelnaht durch.

Polieren Sie den Schädel mit einem Wattestäbchen, um ihn zu trocknen, und ziehen Sie die Haut aus dem Operationsfeld heraus. Verwenden Sie anschließend die Spitze der Glasnadel, um auf den Scheitelpunkt der bgma-Naht zu zeigen, und legen Sie dort die anfängliche Injektionsposition fest. Legen Sie nun den Punkt am Schädel fest, der gebohrt werden soll, indem Sie die X- und Y-Achse des stereotaktischen Geräts über den Schädel bewegen.

Bohren Sie mit einem Forschungsmikrobohrer vorsichtig Löcher an den ausgewählten Koordinaten und verwenden Sie dabei feine Pinzetten. Entfernen Sie vorsichtig die tiefste Knochenlage und durchtrennen Sie die Dura-mater. Sie werden sehen, wie etwas zerebrospinale Flüssigkeit austritt.

Um zu überprüfen, ob die Nadel durch die gebohrten Löcher passt, senken Sie die Glasnadel langsam mithilfe der Z-Achse des stereotaktischen Geräts ab. Pipettieren Sie nun einen Mikroliter des zu injizierenden Wirkstoffs und geben Sie ihn auf ein kleines Stück Parfum. Legen Sie das Parfum auf den Schädel.

Saugen Sie die Substanz auf, indem Sie das Mikroinjektorrad drehen, während Sie durch das Mikroskop überprüfen, ob die Flüssigkeit in die Glasnadel aufsteigt. Entfernen Sie die Parafolie und setzen Sie die Null-Koordinate zurück. Bewegen Sie nun die Nadel zu den ausgewählten Koordinaten und senken Sie den Halter ab, bis die Spitze der Glasnadel sanft die Gehirnoberfläche berührt, und stellen Sie die Z-Koordinate auf null ein.

Führen Sie die Glasnadel in das Gehirnparenchym in der gewünschten Tiefe ein. Injizieren Sie das Medikament langsam mit einer Rate von etwa einem Nanoliter pro Sekunde. Sobald das gewünschte Volumen injiziert ist, lassen Sie das Medikament zwei Minuten lang in das Parenchym diffundieren und ziehen Sie die Nadel anschließend gleichmäßig und langsam zurück.

Verkleben Sie schließlich die chirurgische Wunde und nehmen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Gerät. Stellen Sie das Tier in einen vorgewärmten Käfig zur Erholung von der Anästhesie. Nun zeigen wir einige Ergebnisse der Mikroinjektion.

Lysophosphatidylcholin oder Lyin wurde in das Corpus callosum injiziert, wodurch eine Demyelinisierung der weißen Faserverbindungen hervorgerufen wird, um die durch die Glasnadel verursachten Hirnverletzungen zu minimieren. Es wurden lediglich 20 µL Lyin injiziert. Die Demyelinisierung zeigt sich durch das Fehlen der Expression des myelinenbasischen Proteins in den Bahnen der weißen Substanz; eine sehr präzise Injektion wird erreicht, und eine sehr dünne Nadelbahn minimiert die Hirnschädigung.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Glasspritzen herstellt, um Mikroinjektionen in tiefliegende Hirnstrukturen durchzuführen. Bei dieser Prozedur ist es wichtig, daran zu denken, dass sämtliche Geräte und Materialien bereitliegen müssen, um sie im Operationssaal verwenden zu können. Das war's.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.