Name: RhoC GTPase-Aktivierungs-Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Lernen Sie den Pull-Down-Assay zur Quantifizierung aktiver RhoC GTPase in Zellen. Diese Methode liefert zuverlässige Daten zur zellulären Signaltransduktion und RhoC-Funktion.

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US-Verteidigungsministerium W81XWH-05-1 bis 0005, W81XWH-06-1 bis 0495, W81XWH-08-1 bis 0029 und W81XWH-08-1 bis 0356

1. Bereiten Sie GST-Fusionsprotein <ol><li> Glycerol Bestände JM109 kompetente Bakterien mit den ersten N-terminalen 90 Aminosäuren des rhotekin Rho-Bindungsdomäne (RBD) in die BamH1/EcoR1 pGEX3x subkloniert sind. Um eine hohe Effizienz der folgenden Schritte müssen für jedes Experiment durchgeführt werden. In unserer Erfahrung, frisch zubereitete GST-RBD ist der Schlüssel, um eine robuste und präzise GTPase-Aktivierungs-Assay. </li><li> Dann werden 50 ul (ungefähre, nicht auftauen) Glycerin Lager, um 50 ml LB amp und wachsen 37 ° C über Nacht unter Schütteln. </li><li> Verdünnen 1:10 in 500 ml LB-Amp und wachsen für 1 h. </li><li> Induce GST-Protein-Produktion mit 0,1 mM IPTG für 2 Stunden. </li><li> Verteilen Sie gleichmäßig in Zentrifugenbecher und Zentrifuge, Sorval GSA3 Rotor bei 5000 RPM 4 ° C für 20 min. </li><li> Pellet in Zentrifugationsflaschen 10 ml Lysepuffer *. * Bakterielle Lysis Buffer: 20% Saccharose, 10% Glycerin, 50 mM Tris pH 8,0, 0,2 mM Na 2 S 2 O 5, 2 mM MgCl 2, 2 mM DTT, Add frischen PMSF, Benzamid, Aprotinin und Leupeptin. </li><li> Ultraschallbad 2-3 min (abhängig von der Art des Ultraschallgeräts. Wir verwenden ein Fischer Sonic Dismembranator Model 500 auf Stufe 6 eingestellt, 50% Zyklus). </li><li> Zentrifuge, Sorvall SS34, 20 min 10.000 rpm bei 4 ° C. An dieser Stelle ein kleines Aliquot kann herausgenommen werden und wird von SDS-PAGE. Das Gel kann Coomassie gefärbt werden und eine Band sollte bei 46 kDa erkennbar. </li><li> Überstand entfernen und 1 mL 50% Glutathion-Sepharose 4B Gülle. </li><li> Inkubieren für 30 min bei 4 ° C mit Rotation. 3 x waschen mit Lysepuffer. </li><li> Resuspendieren GST-RBD/glutatione-Sepharose Perlen auf eine 50% ige Aufschlämmung (ca. 1 mL) mit GST-Fisch-Puffer **. ** GST-Fish-Puffer: 10% Glycerol, 50 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% NP-4, 2 mM MgCl 2, Add frischen PMSF, Benzamid, Aprotinin und Leupeptin </li></ol> 2. GST-Fusions-Pull-down-Assay <ol><li> Verwenden Sie 5-10 x 10 6 Zellen / Test </li><li> Wash Zellen einmal in eiskaltem PBS, halten Platten auf Eis (wir verwenden eine flache Glasschale mit Eis gefüllt) und Lyse mit 0,5 ml GST-Fisch-Puffer. </li><li> Inkubieren 5 min auf Eis, Ernte-Zellen mit Hilfe eines Gummi-Polizist oder Wohnung scrapper, Transfer zum Rohr microfuge und Zentrifuge 20.000 rpm 5 min bei 4 ° C. </li><li> Überstand in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen. Nehmen Sie 50 ul auf insgesamt Rho (dh BIP + GTP gebunden) zu bestimmen. </li><li> Fügen Sie 0,5 ml GST-RBD/glutatione-Sepharose Perlen und inkubieren Sie bei 4 ° C, über Nacht mit einer Rotation. </li><li> Wash 6x mit GST-Fisch-Puffer. </li><li> Resuspendieren Perlen in 40 ul 2x-Laemelli Probenpuffer An diesem Punkt der Konzentration der gesamten Rho-Protein Aliquot in 2,4 genommen zu bestimmen und 30 ug bereit, auf dem Gel mit dem entsprechenden Aktivierung Probe gefahren werden. </li><li> Boil-Proben bei 90 ° C für 5 min, kurz zentrifugieren und Überstand nehmen (dh Vermeidung der Perlen) zu laden und laufen auf einer 12-well 4-20% Gradient SDS-PAGE-Gel. </li><li> Run-Gel nicht höher als 150 Volt, Transfer zum Membran mit Towbin Puffer und konstanten Strom von 100 W. </li><li> Block Membran mit 5% Milch / TBST-Lösung und Sonde mit RhoC-specfic Antikörper. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse Gute Ergebnisse sollte eine einzige Bande bei etwa 22 kDa zu produzieren. Schlechte Ergebnisse produzieren mehrere Bänder oder hohen Hintergrund. Dies ist bezeichnend für Proteinabbau, unvollständige Waschen von Proben oder die Verwendung von alten GST-RBD. <img src="/files/ftp_upload/2083/2083fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Drei separate Zelllinien unterschiedlicher RhoC GTPase gezeigt auf ein niedriges Niveau der aktiven und insgesamt RhoC, ein hohes Maß an aktiver und insgesamt RhoC oder keine RhoC demonstrieren. Der Blot wurde dann abgezogen und reprobed mit einem Antikörper gegen das house keeping-Gens Aktin als Ladekontrolle für die gesamte RhoC Protein dienen. <img src="/files/ftp_upload/2083/2083fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Multiple Bands oder hohen Hintergrund ergibt sich aus Proteinabbau, unvollständige Waschen der Proben oder die Verwendung von alten GST-RBD.

<ol><li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase%2C+a+novel+transforming+oncogene+for+human+mammary+epithelial+cells+that+partially+recapitulates+the+inflammatory+breast+cancer+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype.</a> Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).</li>
<li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase+overexpression+modulates+induction+of+angiogenic+factors+in+breast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase overexpression modulates induction of angiogenic factors in breast cells.</a> Neoplasia. 2 (5), 418-425 (2000).</li>
<li>Golen, K. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversion+of+RhoC+GTPase-induced+inflammatory+breast+cancer+phenotype+by+treatment+with+a+farnesyl+transferase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Reversion of RhoC GTPase-induced inflammatory breast cancer phenotype by treatment with a farnesyl transferase inhibitor.</a> Mol Cancer Ther. 1 (8), 575-583 (2002).</li>
<li>Golen, K. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen+activated+protein+kinase+pathway+is+involved+in+RhoC+GTPase+induced+motility%2C+invasion+and+angiogenesis+in+inflammatory+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Mitogen activated protein kinase pathway is involved in RhoC GTPase induced motility, invasion and angiogenesis in inflammatory breast cancer.</a> Clin Exp Metastasis. 19 (4), 301-311 (2002).</li>
<li>Yao, H., Dashner, E. J., van Golen, C. M., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase+is+required+for+PC-3+prostate+cancer+cell+invasion+but+not+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase is required for PC-3 prostate cancer cell invasion but not motility.</a> Oncogene. 25 (16), 2285-2296 (2006).</li>
<li>Hall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+Collagen+receptor+%28alpha2beta1%29+signaling+promotes+prostate+cancer+cell+invasion+through+RhoC+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Type I Collagen receptor (alpha2beta1) signaling promotes prostate cancer cell invasion through RhoC GTPase.</a> Neoplasia. 10 (8), 797-803 (2008).</li>
<li>Sequeira, L., Dubyk, C. W., Riesenberger, T. A., Cooper, C. R., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+in+PC-3+prostate+cancer+cell+morphology%2C+invasion+and+tumor+cell+diapadesis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases in PC-3 prostate cancer cell morphology, invasion and tumor cell diapadesis.</a> Clin Exp Metastasis. 25, 569-579 (2008).</li>
<li>van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2+Induces+Prostate+Cancer+Transendothelial+Cell+Migration+via+Activation+of+the+Small+GTPase+Rac%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">CCL2 Induces Prostate Cancer Transendothelial Cell Migration via Activation of the Small GTPase Rac.</a> J Cell Biochem. 104, 1587-1597 (2008).</li>
<li>Chatterjee, M., van Golen, K. L. Int J Cancer. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Sander, E. E., ten Klooster, J. P., van Delft, S., van der Kammen, R. A., Collard, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac+downregulates+Rho+activity%3A+reciprocal+balance+between+both+GTPases+determines+cellular+morphology+and+migratory+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rac downregulates Rho activity: reciprocal balance between both GTPases determines cellular morphology and migratory behavior.</a> J Cell Biol. 147 (5), 1009-1022 (1999).</li>
</ol>

Der wichtigste Schritt des Verfahrens ist die Erzeugung von frischen GST-RBD. Andernfalls Aufmerksamkeit, um diesen Schritt zu zahlen ist Hauptgrund für das Scheitern. Alle Schritte, von der Generation der GST-RBD (1,2), die Inkubation über Nacht mit dem Zelllysat (2,5), sollte an einem einzigen Tag durchgeführt werden. Ein weiterer entscheidender Schritt ist, um sicherzustellen, dass es genügend Zellen zu den Zelllysaten zu produzieren. Dies ist von besonderer Bedeutung, wenn man RhoC GTPase, die anwesend zu sein in ge...

<table><tbody><tr><td>Glutathion-Sepharose-4B-Kügelchen</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0756-01</td><td></td></tr><tr><td>Kriterium-4-20 %-Tris-HCl-Gele</td><td>Bio-Rad</td><td>345-0032</td><td></td></tr></tbody></table>

rhoc gtpase-aktivierungs-assay

RhoC GTPase Activation Assay

RhoC GTPase hat 91% Homologie zu RhoA GTPase. Aufgrund der Prävalenz in den Zellen haben viele Reagenzien und Techniken für RhoA GTPase entwickelt worden. Allerdings ist RhoC GTPase in metastasierenden Krebszellen auf relativ niedrigem Niveau exprimiert. Deshalb haben einige RhoC-spezifische Reagenzien entwickelt worden. Wir haben eine Rho-Aktivierungs-Assay angepasst RhoC GTPase zu erkennen. Diese Technik nutzt eine GST-Rho-bindende Domäne Fusionsprotein herausziehen aktive RhoC GTPase. Darüber hinaus können wir insgesamt Protein zu Beginn des Tests Ernte auf ein Niveau von insgesamt (GTP und GDP gebunden) RhoC GTPase zu bestimmen. Dies ermöglicht die Bestimmung des aktiven und totale RhoC GTPase in der Zelle. Mehrere kommerzielle Versionen von diesem Verfahren wurden jedoch entwickelt, sind die kommerziellen Kits für RhoA GTPase optimiert und in der Regel nicht gut für RhoC GTPase. Teile des Tests wurden ebenso wie die Entwicklung eines RhoC-spezifischen Antikörper modifiziert.

Dieses Protokoll verwendet einen Pull-Down-Assay auf das Niveau der aktiven RhoC GTPase innerhalb der Zellen zu bestimmen.

RhoC GTPase-Aktivierungs-Assay

RhoC-GTPase weist eine Homologie von 91 % zur RhoA-GTPase auf. Aufgrund der weiten Verbreitung von RhoA-GTPase in Zellen wurden zahlreiche Reagenzien und Techniken für RhoA-GTPase entwickelt. ...

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Das hier vorgestellte Verfahren beschreibt ein Assay zur spezifischen Aktivierung von RhoA GDP / GTP (GEFs) in kultivierten Zellen unter Verwendung eines mutierten RhoA GST-Fusionsprotein, das eine hohe Affinität für aktiviert GEFs hat folgen. GEFs aus Zelllysaten durch Western-Blotting und quantifiziert durch Densitometrie erkannt ausgefällt.

Affinity Niederschlag von Active Rho-GEFs Mit Hilfe eines GST-markiertes Mutant Rho-Protein (GST-RhoA (G17A)) aus epithelialen Zelllysate

Dieses Video zeigt einen Wettbewerbsassay zur Untersuchung von GTPase-bindenden Proteinpartnern. Unter Verwendung von nukleotidgebundenem GTPase-Protein, das auf magnetischen Beads immobilisiert ist, kann die kompetitive Bindung zwischen zwei interagierenden Proteinpartnern für dieselbe Bindungsstelle auf der GTPase untersucht werden, um die Bindungsaffinitäten der Proteinpartner zu beurteilen.

Wettbewerbsbindungsassay zur Untersuchung konkurrierender GTPase-bindender Proteinpartner

Die hier beschriebene Fluoreszenz-basierten Calciummobilisierungsassay ist ein Medium-Durchsatz Rückwärts pharmakologischen Screening-System für die Identifizierung von funktionell aktivierenden Liganden (n) der Orphan-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs).

Charakterisierung von G-Protein gekoppelten Rezeptoren durch eine Fluoreszenz-basierte Calciummobilisierungsassay

Dieses Protokoll vergleicht die relativen Affinitäten von Bindungspartnern für GTPasen der Rho-Familie, einschließlich Rac1. In vivo konkurrieren Rac1-bindende Proteine um eine einzige Bindungsgrenzfläche, deren Konformation durch ein gebundenes Nukleotid bestimmt wird. Das Nukleotid ist aufgrund der hohen Hydrolyserate sowohl wichtig als auch experimentell schwer zu kontrollieren.

Vergleicht man die Affinität der GTPase-bindende Proteine ​​mit Competition-Assays

Guanosintriphosphat (GTP) -Bindung ist eine der frühesten Ereignisse in der G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) -Aktivierung. Dieses Protokoll beschreibt die pharmakologisch charakterisierende spezifische GPCR-Ligand-Wechselwirkungen durch die Überwachung der Bindung des radioaktiv markierten GTP-Analogs [ 35 S] Guanosin-5'-O- (3-thio) triphosphats ([ 35 S] GTPγS) in Antwort auf einen Liganden von Interesse.

Messung der G-Protein-gekoppelten Rezeptorsignalisierung über radioaktiv markierte GTP-Bindung

Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die Prenylation und Guanosin-5'-Triphosphat (GTP) untersuchen-Laden von Rho GTPase. Dieses Protokoll besteht aus zwei detaillierte Methoden, nämlich Membran Fraktionierung und ein GTPase verbundene Immunosorbentprobe assay. Das Protokoll kann verwendet werden, zur Messung der Prenylation und GTP Laden von verschiedenen anderen kleinen GTPasen.

Erkennung von kleine GTPase Prenylation und GTP binden mit Membran Fraktionierung und GTPase verbundene Immunosorbentprobe Assay

Dieser Bericht beschreibt das Screening verschiedener Reinigungsmittel zur Herstellung des visuellen GPCR, Rhodopsins und seines Komplexes mit Mini-Go. Gezeigt werden biochemische Methoden, die die Qualität des Komplexes in verschiedenen Stadien während der Reinigung charakterisieren. Dieses Protokoll kann für ihre zukünftigen Strukturstudien auf andere Membranproteinkomplexe verallgemeinert werden.

Strategisches Screening und Charakterisierung des Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex für eine erfolgreiche Kristallisation

In dieser Arbeit wird ein intrazellulärer Hochdurchsatz-Calciumfluoreszenz-Assay für 384-Well-Platten beschrieben, um kleine Molekülbibliotheken auf rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) zu screenen. Das Ziel, der Kinin-Rezeptor aus der Rinderpestzecke Rhipicephalus microplus, wird in CHO-K1-Zellen exprimiert. Dieser Assay identifiziert Agonisten und Antagonisten unter Verwendung der gleichen Zellen in einem "Dual-Addition"-Assay.

Ein "Dual-Addition"-Calciumfluoreszenz-Assay für das Hochdurchsatz-Screening von rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren

Wir haben einen Split-Luciferase-Reassemblierungs-Assay etabliert, um die Kontakte zwischen endoplasmatischem Retikulum und Mitochondrien in lebenden Zellen zu überwachen. Mit diesem Assay beschreiben wir ein Protokoll zur quantitativen Messung des Ausmaßes dieser Interorganellenkopplungen in HEK293T Zellen unter den Bedingungen einer chemischen Behandlung.

Split-Luciferase-Reassemblierungs-Assay zur Messung von Kontakten zwischen endoplasmatischem Retikulum und Mitochondrien in lebenden Zellen

Die Studie demonstriert einen quantitativen PCR-basierten Assay für die Aktivierung des primären Zilien-vermittelten Sonic Hedgehog (SHH)-Signalwegs unter Verwendung eines SHH-Agonisten in einem zellulären Modell der Ziliogenese.

Quantitativer PCR-basierter Assay zur Messung des Sonic Hedgehog-Signalwegs im zellulären Modell der Ziliogenese

Lernen Sie den Pull-Down-Assay zur Quantifizierung aktiver RhoC GTPase in Zellen. Diese Methode liefert zuverlässige Daten zur zellulären Signaltransduktion und RhoC-Funktion.

RhoC GTPase-Aktivierungs-Assay

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