Short Hairpin RNA-vermittelter Gen-Knockdown in iHSPCs in vitro: Ein Lentivirus-basiertes shRNA-Expressionssystem zur Verabreichung in iHSPCs für den Knockdown der spezifischen Genexpression

Beginnen Sie mit einer immortalisierten hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzelle, iHSPC, Kultur in Medien, die spezifisches Steroidhormon und hämatopoetisches Zytokin enthalten und die Zellproliferation in einem undifferenzierten Zustand regulieren. Fügen Sie ein geeignetes kationisches Polymer und lentivirale Vektoren hinzu.

Rekombinante Viren tragen kodierende Sequenzen für kurze Haarnadel-RNAs, shRNAs, die auf ein spezifisches Wirtsgen und ein Antibiotikaresistenz-Markergen gerichtet sind.

Zentrifugieren Sie, um Zellen und Viren zu sedimentieren. Während der Inkubation neutralisieren kationische Polymere die zellulären Membranladungen und verstärken so die Virusbindung. Nach der Membranfusion werden virales Erbgut und Enzyme in das zelluläre Zytoplasma freigesetzt. Das virale Genom wird rückwärts transkribiert, wandert in den Zellkern und integriert sich in das Wirtsgenom.

Unter dem Einfluss eines spezifischen Promotors in dem Konstrukt wird das shRNA-Genkonstrukt, das eine Ziel-mRNA-Matching-Sequenz, ein Schleifensegment und eine weitere komplementäre Sequenz zur ersten umfasst, transkribiert, wobei shRNA mit einem Schleifensegment aus ungepaarten Nukleotiden gebildet wird. Nach der Transkription wird die shRNA in das Zytoplasma exportiert.

Eine spezifische Ribonuklease spaltet das Schleifensegment und bildet doppelsträngige RNA, siRNA. siRNA wird in den RNA-induzierten Silencing-Komplex, RISC, eingebaut und siRNA-Stränge trennen sich. Der aktivierte Komplex mit dem zurückgehaltenen Strang, der komplementär zur Ziel-mRNA ist, erkennt und bindet auf sequenzspezifische Weise an die Ziel-mRNA, wodurch die Expression negativ reguliert und die Unterdrückung des Zielgens vermittelt wird.

Inkubieren Sie die Zellen mit spezifischen Antibiotika. Die stabil transduzierten Zellen exprimieren das Antibiotikaresistenz-Gen, das ihre Selektion ermöglicht. Medien auffrischen und inkubieren, um die Proliferation stabil transduzierter Zellen zu ermöglichen.