Name: Lentiviral CRISPR/Cas9-Vermittelte Genombearbeitung zur Untersuchung hämatopoetischer Zellen in Krankheitsmodellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-03T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Lernen Sie die lentivirale CRISPR/Cas9-Genombearbeitung zur Untersuchung hämatopoetischer Stammzellen in Mäusen. Diese effiziente Methode ermöglicht die schnelle und kostengünstige Erstellung von Krankheitsmodellen.

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S. S. wurde von einem Postdoktorandenstipendium der American Heart Association 17POST33670076 unterstützt. K. W. wurde durch die NIH-Zuschüsse R01 HL138014, R01 HL141256 und R01 HL139819 unterstützt.

Alle Verfahren, die tierische Themen betreffen, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Virginia genehmigt.
1. Erzeugung und Reinigung von Lentiviruspartikeln
HINWEIS: Lentivirus-Partikel, die die optimierte Guide-RNA enthalten, können durch die detaillierten Protokolle von Addgene erzeugt werden: <https://media.addgene.org/cms/files/Zhang_lab_LentiCRISPR_library_protocol.pdf)>. Optimierte Methoden für High-Titer Lentivirus Vorbereitung und Lagerung werden an anderer Stelle diskutiert17,18. Kurz gesagt, Lentiviren werden durch Ko-Transfektion eines Lentivirus-Vektorplasmids, psPAX2 und pMD2.G in HEK 293T-Zellen produziert. Kulturüberstand wird bei 48 h nach der Transfektion gesammelt und durch Ultrazentrifugation konzentriert. Lentiviraltiter wird durch einen kommerziell erhältlichen qPCR-basierten Assay bestimmt. Dieses Verfahren sollte in einem Schrank der Biosicherheitsklasse II durchgeführt werden.
<ol><li>Bereiten Sie eine 1:200 Lösung von Kollagen (0.0005%) in 1x PBS.</li>
	<li>Beschichten Sie eine 6-Well-Platte mit Kollagenlösung und brüten bei 37 °C, 5%CO2 für 30 min.</li>
	<li>Samen 293T-Zellen mit einer Dichte von 1 x 106 Zellen pro Brunnen und inkubieren bei 37 °C, 5%CO2 für 2 h.</li>
	<li>Um die Mischung aus drei Transfektionsplasmiden für einen Brunnen vorzubereiten, kombinieren Sie 0,9 g Lentivirus-Vektor, 0,6 g psPAX2 und 0,3 g pMD2.G, und erreichen Dann ein Gesamtvolumen von 10 l durch Zugabe von deionisiertem Wasser. Passen Sie die Beträge entsprechend an die Anzahl der Brunnen an. Die Menge und das Verhältnis jedes Plasmids müssen möglicherweise weiter optimiert werden, um den Anforderungen der Forscher gerecht zu werden.</li>
	<li>50 l 1x PBS und 5 l des verdünnten PEI MAX (1,0 mg/ml) vorsichtig in das Plasmidgemisch geben und 15 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren (Tabelle 1).</li>
	<li>1 ml DMEM in die Mischung geben.</li>
	<li>Aspirieren Sie Medien aus der 6-Well-Platte, fügen Sie 1 ml Plasmid-Mischung hinzu und brüten bei 37 °C, 5%CO2 für 3 h.</li>
	<li>Ersetzen Sie die Medien durch 2 ml frisches DMEM und brüten Bei 37 °C, 5%CO2 für 24 h.</li>
	<li>1 ml frisches DMEM hinzufügen und bei 37 °C, 5%CO2 für weitere 24 h inkubieren (Gesamtinkubationszeit 48 h).</li>
	<li>Übertragen Sie den Kulturüberstand in ein 50 ml Rohr und zentrifugieren bei 3.000 x g für 15 min, um frei schwebende Zellen zu entfernen.</li>
	<li>Filtern Sie den Überstand durch einen 0,45-m-Filter.</li>
	<li>Das Filtrat in Polypropylenzentrifugenrohre übertragen.</li>
	<li>Ultrazentrifuge bei 4 °C und 72.100 x g bei rmax für 3 h.</li>
	<li>Den Überstand vorsichtig ansaugen und das weiße Pellet zurücklassen.</li>
	<li>Setzen Sie das Pellet mit 100 L serumfreiem hämatopoetischem Zellausdehnungsmedium ohne Belüftung aus.</li>
	<li>Bewahren Sie ein 10 L Aliquot auf, um den viralen Titer zu messen, und lagern Sie alle verbleibenden Aliquots bei -80 °C, bis dies erforderlich ist.</li>
	<li>Titrate das Virus mit einem qPCR-basierten Assay nach den Anweisungen des Herstellers mit dem 10 L viralen Aliquot.</li>
</ol>2. Isolierung und Transduktion von Linien-negativen Zellen aus Demmausknochenmark (Abbildung 1A)
HINWEIS: In der Regel werden, um genügend Zellen zu isolieren, Paare von Tibias, Oberschenkelknochen und Humeri von jeder Maus geerntet werden. Becken- und Wirbelsäulenknochen können auch als Quelle von Linien-negativen Zellen geerntet werden.
<ol><li>Isolierung von Knochenmarkzellen<ol>
<li>Euthanisieren Sie 8-10 Wochen alte männliche CRISPR/Cas9 Knock-in-Mäuse um 5% Isofluran, gefolgt von zervikalen Dislokation, dann desinfizieren sie ihre Haut mit 70% Ethanol.</li>
		<li>Mit sezierender Schere, machen Sie einen Querschnitt in der Haut direkt unter dem Brustkorb und schälen Sie die Haut in beide Richtungen, um die Beine und Arme auszusetzen.</li>
		<li>Trennen Sie vorsichtig die unteren Gliedmaßen vom Hüftknochen, indem Sie das Hüftgelenk verziehen. Schneiden Sie entlang des Oberschenkelknochenkopfes, um den Oberschenkelknochen vollständig aus der Hüfte zu entfernen. Dislozieren Sie das Knie und schneiden Sie am Gelenk, um den Oberschenkelknochen und die Tibia zu trennen, während die Knochenepiphyse intakt bleibt. Dislozieren Sie das Sprunggelenk und schälen Sie den Fuß und zusätzlichen Muskel.</li>
		<li>Mit einer Schere über die Schulter schneiden, um die oberen Gliedmaßen zu lösen. Dislozieren Sie die Schulter, dann am Ellenbogengelenk schneiden, um den Humerusknochen zu ernten.</li>
		<li>Verwenden Sie Zellulose-Faser-Tücher, um Muskeln vorsichtig von den Oberschenkelknochen, Tibias und Humeri zu entfernen. Ergreifen Sie zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen, um sicherzustellen, dass die Knochen während dieses Prozesses nicht brechen.</li>
		<li>Legen Sie die isolierten Knochen in ein 50 ml konisches Rohr mit RPMI und legen Sie sie auf Eis. HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten in einem Schrank der Biosicherheitsklasse II durchgeführt werden.</li>
		<li>Übertragen Sie die Knochen in eine sterile, 100 mm Kulturschale.</li>
		<li>Greifen Sie den Knochen mit stumpfer Zange, und mit sezierender Schere, sorgfältig schneiden beide Epiphysen. HINWEIS: Ein unzureichendes Schneiden führt zu einer unvollständigen Bündigung des Knochenmarks, während übermäßig aggressives Schneiden zu Zellverlust führt.</li>
		<li>Füllen Sie eine 10 ml Spritze mit eiskaltem RPMI und spülen Sie mit einer 22 G Nadel das Knochenmark aus dem Schaft in eine neue 100-mm-Kulturschale. HINWEIS: Knochen werden weiß und durchscheinend, wenn die Knochenwelle gut gespült wurde. Wenn nicht, schneiden Sie die Knochenenden erneut und spülen Sie sie erneut.</li>
		<li>Nachdem das Knochenmark gesammelt wurde, machen Sie eine einzellige Suspension, indem Sie das Knochenmark mehrmals durch eine 10 ml Spritze mit einer 18 G Nadel passieren. Wiederholen Sie 10x, um eine einzellige Suspension zu gewährleisten.</li>
		<li>Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70-m-Zellsieb in ein 50 ml konisches Rohr.</li>
		<li>Zentrifuge bei 310 x g für 10 min bei 4 °C.</li>
		<li>Saugen Sie den Überstand an und setzen Sie die Zellpellets in einem geeigneten Volumen optimierten Trennpuffers für den folgenden Zelltrennungsprozess wieder aus.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolierung und Lentivirus-Transduktion von Linien-negativen Zellen HINWEIS: Maus-Linie-negative Zellen werden aus dem Knochenmark von Cas9 transgene Mäuse3 oderanderen Stämmen von Mäusen isoliert, mit einem Lineage-Depletion-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Typischerweise machen Linien-negative Zellen 2%-5% der ganzen Knochenmarkzellen aus, und die Reinheit ist in der Regel größer als 90% nach der Isolierung. Die isolierten Linien-negativen Zellen werden in serumfreiem hämatopoetischem Zellexpansionsmedium kultiviert, ergänzt mit 20 ng/ml rekombinantem murineminem tPO und 50 ng/mL rekombinantem murinen SCF, dann mit dem Lentivirus-Vektor für 16 h bei einer Vielzahl von Infektion (MOI) = 100.<ol>
<li>Um Liniennegative Zellen zu isolieren, verwenden Sie das Futterzellen-Erschöpfungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
		<li>Nach der Isolierung setzen Sie die Linien-negativen Zellen in 1 ml serumfreiem hämatopoetischen Zellausdehnungsmedium wieder aus.</li>
		<li>Säen Sie die Zellen in eine 6-Well-Platte mit einer Dichte von 1,5 x 106 Zellen/ml (5 x 105 Lineage-negative Zellen/Maus).)</li>
		<li>Fügen Sie rekombinante murine TPO und SCF in Brunnen bei Endkonzentrationen von 20 ng/ml bzw. 50 ng/ml hinzu.</li>
		<li>Vorinkubationszellen bei 37 °C in 5%CO2 für 2 h.</li>
		<li>Lentivirus bei MOI = 100, 4 g/ml Polybren und Penicillin/Streptomycin in die Brunnen geben und bei 37 °C, 5%CO2 für 16-20 h(Abbildung 1B)brüten.</li>
		<li>Sammeln Sie am nächsten Tag die lentivirus-transduzierten Zellen in ein 15 ml kegelförmiges Rohr und Zentrifuge bei 300 g für 10 min.</li>
		<li>Sorgsam den Überstand ansaugen und das Pellet in 200 L RPMI pro Maus wieder aufsetzen. Bewahren Sie die Zellen bei RT bis zur Transplantation in Mäuse auf (Abschnitt 3).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Transplantation von transduzierten Zellen in tödlich bestrahlte Mäuse
<ol><li>Legen Sie die Empfängermäuse am Tag der Knochenmarktransplantation in einen Acht-Scheiben-Kuchenkäfig und setzen Sie sie zwei Dosen Ganzkörperbestrahlung aus (550 Rad/Dosis, Gesamtdosis = 1100 Rad), wobei zwischen jeder Bestrahlungssitzung etwa 4 h liegen.</li>
	<li>Nach der zweiten Bestrahlungssitzung projizieren Sie transduzierte Liniennegative Zellen über den retroorbitalen Venenplexus (insgesamt 200 l) mit einer Insulinspritze in jede anästhesierte Empfängermaus (Abbildung 1C).</li>
	<li>Nach der Bestrahlung sollten Mäuse in sterilisierten Käfigen untergebracht und mit einer weichen Ernährung und Trinkwasser versorgt werden, das mit Antibiotika für 14 d ergänzt wird.</li>
	<li>Nach 3-4 Wochen nach der Knochenmarktransplantation analysieren Sie peripheres Blut, um die Transplantation von transducierten Spenderzellen zu überprüfen (Abschnitt 4).</li>
</ol>4. Bewertung der Chimäre des peripheren Blutes
<ol><li>Anästhesisieren Sie Mäuse mit 5% Isofluran und erhalten Sie eine Blutprobe aus einer retro-orbitalen Vene mit Kapillarröhren, und sammeln Sie sie in K2EDTA-Röhren (das Volumen in einem Kapillarrohr ist ausreichend für den folgenden Test).</li>
	<li>20 L Blut aus den K2EDTA-Röhrchen in die 5 ml runden Polystyrol-Reagenzgläser übertragen und auf Eis legen.</li>
	<li>Fügen Sie 1,5 ml RBC-Lysepuffer hinzu, um rote Blutkörperchen zu lyse. 5 min auf Eis inkubieren.</li>
	<li>Um den Lysepuffer zu neutralisieren, waschen Sie Proben mit FACS-Puffer (1,5 ml/Probe).</li>
	<li>Zentrifuge bei 609 x g beir max für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen mit einem Cocktail von monoklonalen Antikörpern (verdünnt in 100 L FACS Puffer/Probe) bei RT für 20 min im Dunkeln. Eine vollständige Liste der Antikörper finden Sie im Abschnitt Materialien oben.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen einmal mit FACS-Puffer (2 ml/Probe). Zentrifuge bei 609 x g beir max (1.800 U/min) für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand vollständig.</li>
	<li>Fixieren Sie die Zellen mit paraformaldehydhaltigem Fixationspuffer (100 l/Tube) für 10 min bei 4 °C.</li>
	<li>Einmal Zellen mit FACS-Puffer (3 ml/Probe) waschen. Zentrifuge bei 609 x g beir max (1.800 U/min) für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand vollständig.</li>
	<li>Setzen Sie das Pellet in 400 L FACS-Puffer aus.</li>
	<li>Halten Sie die Proben bei 4 °C bis zur Analyse durch Durchflusszytometrie.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Der Vorteil dieses Protokolls ist die Schaffung von Tiermodellen, die spezifische Mutationen in hämatopoetischen Zellen in einer schnellen und äußerst kostengünstigen Weise im Vergleich zu herkömmlichen transgenen Ansätzen der Maus beherbergen. Es wurde festgestellt, dass diese Methode die Erzeugung von Mäusen mit hämatopoetischen Zellgenmanipulationen innerhalb eines Monats ermöglicht. Es gibt mehrere wichtige Schritte in diesem Protokoll, die einer weiteren Prüfung bedürfen.
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Viele Studien in Hämatologie und Immunologie basieren auf der Verfügbarkeit von genetisch veränderten Mäusen, einschließlich konventioneller und bedingter transgener/knock-out-Mäuse, die hämatopoetische systemspezifische Cre-Treiber wie Mx1-Cre, Vav-Cre und andere verwenden. 1,2,3,4,5. Diese Strategien erfordern die Etablierung neuer Mausstämme, die zeitaufwändig und finanziell belastend sein können. Während revolutionäre Fortschritte in der Genom-Editing-Technologie die Erzeugung neuer Mausstämme in nur 3-4 Monaten mit dem entsprechenden technischen Know-how ermöglicht haben6,7,8,9 , viel mehr Zeit ist erforderlich, um die Mauskolonie zu verstärken, bevor Experimente durchgeführt werden. Darüber hinaus sind diese Verfahren kostspielig. Beispielsweise listet Jackson Laboratory den aktuellen Preis für Dieerzeugungsdienste für Knock-out-Mäuse auf 16.845 US-Dollar pro Stamm (Stand Dezember 2018) auf. Daher sind Methoden, die wirtschaftlicher und effizienter sind als herkömmliche murintransgene Ansätze, vorteilhafter.
Die clusterierte, regelmäßig interspacete kurze palindromische Wiederholungen/CRISPR-assoziierte Protein-9-Technologie (CRISPR/Cas9) hat zur Entwicklung neuer Werkzeuge für eine schnelle und effiziente RNA-basierte, sequenzspezifische Genombearbeitung geführt. Ursprünglich als bakterieller adaptiver Immunmechanismus zur Zerstörung der eindringenden Pathogen-DNA entdeckt, wurde das CRISPR/Cas9-System als Werkzeug zur Steigerung der Wirksamkeit der Genombearbeitung in eukaryotischen Zellen und Tiermodellen eingesetzt. Eine Reihe von Ansätzen wurden verwendet, um CRISPR/Cas9-Maschinen in hämatopoetische Stammzellen zu übertragen (d. h. Elektroporation, Nukleofektion, Lipofektion, virale Abgabe und andere).
Hier wird ein Lentivirus-System eingesetzt, um Zellen zu transduzieren, da es in der Lage ist, Cas9-exezierende murine hämatopoetische Stammzellen effektiv zu infizieren und das Führungs-RNA-Expressionskonstrukt, Promotoren, regulatorische Sequenzen und Gene, die kodieren, zusammenzupacken. fluoreszierende Reporterproteine (z. B. GFP, RFP). Mit dieser Methode wurde eine Ex-vivo-Genbearbeitung von hämatopoetischen Stammzellen der Maus erreicht, gefolgt von einer erfolgreichen Rekonstitution des Knochenmarks bei tödlich bestrahlten Mäusen10. Der für diese Studie verwendete Lentivirus-Vektor drückt die Cas9- und GFP-Reportergene aus dem gemeinsamen Kern-EF1a-Promotor mit einer internen ribosomalen Einstiegsstelle vor dem Reportergen aus. Die Rna-Führungssequenz wird von einem separaten U6-Promotor exprimiert. Dieses System wird dann verwendet, um Insertions- und Deletionsmutationen in den Kandidaten-Klonhämatopoese-Treibergen Tet2 und Dnmt3a10zu erzeugen. Die Transduktionseffizienz bei dieser Methode ist jedoch relativ gering (ca. 5%-10%) aufgrund der großen Größe des Vektoreinsatzes (13 Kbp), die die Transduktionseffizienz und die Virentiter während der Produktion reduziert.
In anderen Studien wurde gezeigt, dass eine größere virale RNA-Größe sowohl die Virusproduktion als auch die Transduktionseffizienz negativ beeinflusst. Beispielsweise wird eine Erhöhung der Insert-Größe um 1 kb gemeldet, um die Virusproduktion um 50 % zu verringern, und die Transduktionseffizienz wird bei hämatopoetischen Stammzellen der Maus auf mehr als 50 % sinken11. Daher ist es vorteilhaft, die Größe des viralen Einsatzes so weit wie möglich zu reduzieren, um die Effizienz des Systems zu verbessern.
Dieses Manko kann durch den Einsatz von Transgenmäusen von Cas9 überwunden werden, bei denen das Cas9-Protein entweder konstitutiv oder induzierbar exprimiert wird12. Die konstitutiven CRISPR/Cas9-Knock-in-Mäuse drücken Cas9 Endonuklease und EGFP aus dem CAG-Promotor am Rosa26-Ort auf allgegenwärtige Weise aus. So kann ein Konstrukt mit sgRNA unter der Kontrolle des U6-Promoters und des RFP-Reportergens unter der Kontrolle des EF1a-Kernpromotors mit dem Lentivirus-Vektor geliefert werden, um eine Genombearbeitung zu erreichen. Mit diesem System wurden die Gene hämatopoetischer Stammzellen erfolgreich bearbeitet, was eine Transduktionseffizienz von 90 % zeigt. Somit bietet dieses Protokoll eine schnelle und effektive Methode, um Mäuse zu erstellen, bei denen gezielte Genmutationen in das hämatopoetische System eingeführt werden. Während unser Labor diese Art von Technologie hauptsächlich verwendet, um die Rolle der klonalen Hämatopoese in Herz-Kreislauf-Erkrankungen13,14,15zu untersuchen, ist es auch auf Studien hämatologischer bösartig16. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auf die Analyse erweitert werden, wie DNA-Mutationen in HSPC andere Krankheits- oder Entwicklungsprozesse im hämatopoetischen System beeinflussen.
Um ein robustes Lentivirus-Vektorsystem zu etablieren, sind hohe Tikern-Virenbestände und optimierte Bedingungen für die Transduktion und Transplantation hämatopoetischer Zellen erforderlich. Im Protokoll werden Anweisungen zur Herstellung eines Hochtiter-Virusbestands in Abschnitt 1, zur Optimierung der Kulturbedingungen von murinen hämatopoetischen Stammzellen in Abschnitt 2, Methoden zur Knochenmarktransplantation in Abschnitt 3 und zur Bewertung der Engraftment in Abschnitt 4.

<table><tbody><tr><td>RPMI Medium 1640 (1X)</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td>Medium</td></tr><tr><td>Sulfamethoxazol und Trimethoprim Injektion</td><td>TEVA</td><td>0703-9526-01</td><td></td></tr><tr><td>1/2 cc LO-DOSE INSULINSPRITZE</td><td>EXELINT</td><td>26028</td><td>allgemeine Versorgung</td></tr><tr><td>293T Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216--</td><td>Zelllinie</td></tr><tr><td>APC-Anti-Maus Ly6C (Klon AL-21)</td><td>BD Biosciences</td><td>560599</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>APC-Cy7-Anti-Maus CD45R (RA3-6B2)</td><td>BD Biosciences</td><td>552094</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>BD Luer-Lok Einwegspritzen, 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td>allgemeiner Vorrat</td></tr><tr><td>BD Microtainer Blutentnahmeröhrchen, K2EDTA hinzugefügt</td><td>BD Bioscience</td><td>365974</td><td>allgemeiner Vorrat</td></tr><tr><td>BD Precisionglide Nadel, 18 G</td><td>BD</td><td>305195</td><td>allgemeiner Vorrat</td></tr><tr><td>BD Precisionglide Nadel, 22 G&nbsp;</td><td>BD</td><td>305155</td><td>allgemeiner Vorrat</td></tr><tr><td>BV510-Anti-Maus CD8a (Klon 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100752</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>BV711-Anti-Maus CD3e (Klon 145-2C11)</td><td>Biolegend</td><td>100349</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>Kollagen aus Kalbsleder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9007-34-5</td><td>allgemeiner Nachschub</td></tr><tr><td>Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 Well&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS3471</td><td>allgemeine Versorgung</td></tr><tr><td>CRISPR/Cas9 knock-in Mäuse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>028555</td><td>Maus</td></tr><tr><td>DietGel 76A</td><td>Clear H2O</td><td>70-01-5022</td><td>allgemeine Versorgung</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium (DMEM) - hoher Glukosegehalt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6429</td><td>Medium</td></tr><tr><td>eBioscience 1X RBC Lysepuffer</td><td>Thermo fisher Scientific</td><td>00-4333-57</td><td>Lösung</td></tr><tr><td>Falcon 100 mm TC-behandelte Zellkulturschale</td><td>Life Sciences</td><td>353003</td><td>allgemeiner</td></tr><tr><td>Nachschub Falcon 5 mL Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden</td><td>Life Sciences</td><td>352054</td><td>allgemeiner Vorrat</td></tr><tr><td>Falcon 50 mL konisch Zentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>352098</td><td>allgemeine</td></tr><tr><td>Versorgung Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-behandelte Multiwell-Zellkulturplatte &nbsp;</td><td>Life Science</td><td>353046</td><td>Allgemeinbedarf</td></tr><tr><td>Fisherbrand Mikrohämatokrit-Kapillarröhrchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-362566</td><td>Allgemeinbedarf</td></tr><tr><td>Fisherbrand sterile Zellsiebe, 70 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td>allgemeine Versorgung</td></tr><tr><td>FITC-Anti-Maus CD4 (Klon RM4-5)</td><td>Invitrogen</td><td>11-0042-85</td><td></td>Antikörper-Fixierungspuffer</tr><tr><td></td><td>BD Bioscience</td><td>554655</td><td>Solution</td></tr><tr><td>Guide-it Compete sgRNA Screening Systems</td><td>Clontech</td><td>632636</td><td>Kit</td></tr><tr><td>Isothesie (Isofluran) Lösung</td><td>Henry Schein</td><td>29404</td><td>Lösung</td></tr><tr><td>Lenti-X qRT-PCR Titrationskit&nbsp;</td><td>Takara</td><td>631235</td><td>Kit</td></tr><tr><td>Lineage Cell Depletion Kit, Maus</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-858</td><td>Kit</td></tr><tr><td>Millex-HV Spritzenfiltereinheit, 0,45 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLHV004SL</td><td>allgemeine Versorgung</td></tr><tr><td>PBS pH7,4 (1X)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Lösung</td></tr><tr><td>PE-Cy7-Anti-Maus CD115 (Klon AFS98)</td><td>eBioscience</td><td>25-1152-82</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>PEI MAX</td><td>Polysciences</td><td>24765-1</td><td>Lösung</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Gemisch</td><td>Lonza</td><td>17-602F</td><td>Lösung</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5-Anti-Maus Ly6G (Klon 1A8)</td><td>BD Biosciences</td><td>560602</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>57823</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>pMG2D</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>Polybren Infektions-/Transfektionsreagenz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td>Lösung</td></tr><tr><td>Polypropylen Zentrifugenröhrchen</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>326823</td><td>allgemeine Versorgung</td></tr><tr><td>psPAX2&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>RadDisk &ndash; Nagetier-Bestrahlungsscheibe</td><td>Braintree Scientific</td><td>IRD-P M</td><td>allgemeine Versorgung</td></tr><tr><td>Rekombinante Maus SCF</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td>Lösung</td></tr><tr><td>Rekombinante Maus TPO&nbsp;</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>315-14</td><td>Solution</td></tr><tr><td>StemSpan SFEM</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>09600</td><td>Solution</td></tr><tr><td>TOPO TA Klonierungskit für die Sequenzierung mit One Shot TOP10 Chemisch kompetente E.coli</td><td>Thermo fisher Scientific</td><td>K457501</td><td>Kit</td></tr><tr><td>Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td><td>BioLegend</td><td>423102</td><td>Lösung&nbsp;</td></tr></tbody></table>

lentiviral crispr/cas9-vermittelte genombearbeitung zur untersuchung hämatopoetischer zellen in krankheitsmodellen

Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

Die Manipulation von Genen in hämatopoetischen Stammzellen mit konventionellen Transgeneseansätzen kann zeitaufwändig, teuer und herausfordernd sein. Durch fortschritte In der Genom-Editing-Technologie und lentivirusvermittelten Transgen-Bereitstellungssystemen wird hier eine effiziente und wirtschaftliche Methode beschrieben, die Mäuse etabliert, bei denen Gene speziell in hämatopoetischen Stammzellen manipuliert werden. Lentiviren werden verwendet, um Cas9-extierende Linien-negative Knochenmarkzellen mit einer Guide-RNA (gRNA) zu transduzieren, die auf bestimmte Gene und ein rotes Fluoreszenz-Reporter-Gen (RFP) abzielt, dann werden diese Zellen in tödlich bestrahlte C57BL/6-Mäuse transplantiert. Mäuse, die mit Lentivirus transplantiert werden, die nicht zielgerichtete gRNA exdrücken, werden als Kontrollen verwendet. Die Transplantation von transduzierten hämatopoetischen Stammzellen wird durch zytometrische Durchflussanalyse von RFP-positiven Leukozyten peripheren Blutes bewertet. Mit dieser Methode können 90 % Transduktion von myeloischen Zellen und 70 % der Lymphzellen nach 4 Wochen nach der Transplantation erreicht werden. Genomische DNA wird aus RFP-positiven Blutzellen isoliert, und Teile der Ziel-Site-DNA werden durch PCR verstärkt, um die Genombearbeitung zu validieren. Dieses Protokoll bietet eine hochdurchsatzhohe Auswertung von hämatopoese-regulatorischen Genen und kann auf eine Vielzahl von Mauskrankheitsmodellen mit hämatopoetischer Zellbeteiligung erweitert werden.

Mit dem oben beschriebenen Protokoll wurden ca. 0,8-1,0 x 108 Knochenmarkzellen pro Maus erhalten. Die Anzahl der Linien-negativen Zellen, die wir erhalten, beträgt ungefähr 3 x 106 Zellen pro Maus. Typischerweise beträgt die Ausbeute von Knochenmark-Linien-negativen Zellen 4%-5% der Gesamtknochenmark-Kernzellen.
Der Chimäre der transduzierten Zellen (RFP-positiv) wird durch die Durchflusszytometrie des per...

Beschrieben werden Protokolle für die hocheffiziente Genombearbeitung von murinen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) durch das CRISPR/Cas9-System zur schnellen Entwicklung von Mausmodellsystemen mit hämatopoetischen systemspezifischen Genmodifikationen.

Lentiviral CRISPR/Cas9-Vermittelte Genombearbeitung zur Untersuchung hämatopoetischer Zellen in Krankheitsmodellen

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...

Wir haben eine effiziente und wirtschaftliche Methode entwickelt, um Mäuse mit Genmanipulation speziell in hämatopoetischen Stammzellen zu etablieren, wobei genome Editing-Technologie und lentivirusvermittelte Transgen-Bereitstellungssysteme verwendet werden. Der Vorteil dieses Protokolls besteht darin, dass wir tierexperimentelle Modelle mit spezifischen Mutationen in hämatopoetischen Zellen im Vergleich zu herkömmlichen transgenen Mausansätzen erstellen können. Demonstriert wird das Verfahren von Ying Wang, einer Forscherin aus meinem Labor.Um Lentivirus-Partikel zu erzeugen, beginnen Sie mit der Codierung einer sechs Brunnenplatte mit Kollagenlösung und inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 30 Minuten. Dann samen 293T Zellen auf die Platte und inkubieren sie für weitere zwei Stunden. In der Zwischenzeit bereiten Sie die Mischung aus drei Transfektionsplasmiden vor, indem Sie 0,9 Mikrogramm Lentivirusvektor, 0,6 Mikrogramm psPAX2 und 0,3 Mikrogramm pMD2 kombinieren.G und deionisiert auf 10 Mikroliter pro Brunnen. Dann 50 Mikroliter 1X PBS und fünf Mikroliter verdünntes PEI MAX vorsichtig in die Plasmidmischung geben und die Mischung bei Raumtemperatur 15 Minuten inkubieren. Fügen Sie nach der Inkubation einen Milliliter DMEM hinzu.Die Medien aus der sechs Brunnenplatte ansaugen und jedem Brunnen einen Milliliter Plasmidmischung hinzufügen. Inkubieren Sie die Platte für weitere drei Stunden. Ersetzen Sie das Medium durch frisches DMEM und brüten Sie 24 Stunden.Fügen Sie einen Milliliter frisches DMEM hinzu und brüten Sie weitere 24 Stunden. Nach einer Gesamtinkubation von 48 Stunden den Überstand in ein 50-Milliliter-Rohr geben und bei 3000-fachem G für 15 Minuten zentrifugieren, um frei schwebende Zellen zu entfernen. Filtern Sie den Überstand durch einen 0,45-Mikrometer-Filter und ultrazentrifugieren Sie ihn drei Stunden lang.Den Überstand vorsichtig ansaugen und das weiße Pellet zurücklassen. Das Pellet mit 100 Mikroliters serumfreiem hämatopoetischem Zellausdehnungsmedium ohne Belüftung wieder aufhängen. Halten Sie einen 10 Mikroliter Aliquot, um den viralen Titer zu messen und speichern Sie den Rest der Suspension bei minus 80 Grad Celsius, bis sie einsatzbereit ist.Nach der Isolierung der Knochen, legen Sie sie in eine 50 Milliliter konische Röhre mit RPMI und legen Sie die Röhre auf Eis. In einem Bio-Sicherheitsschrank die Knochen in eine sterile 100-Millimeter-Kulturschale geben. Dann greifen Sie einen Knochen mit stumpfer Zange, und verwenden Sie Sezierschere, um vorsichtig beide Epiphysen zu schneiden.Füllen Sie eine 10-Milliliter-Spritze mit eiskaltem RPMI und spülen Sie das Knochenmark mit einer 22-Meter-Nadel aus dem Schaft in eine neue 100-Millimeter-Kulturschale. Nachdem das Knochenmark gesammelt wurde, machen Sie eine Einzelzellsuspension, indem Sie das Knochenmark durch eine 10 Milliliter Spritze mit einer 18-Meter-Nadel passieren. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein 50 Milliliter konisches Rohr.Dann zentrifugieren Sie das Rohr nach den Manuskriptrichtungen und aspirieren Sie den Überstand. Setzen Sie die Zellpellets in einem geeigneten Volumen optimierten Trennpuffers wieder auf. Um negative Linienzellen zu isolieren, verwenden Sie ein Abstammungszell-Erschöpfungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.Setzen Sie die isolierten Liniennegativen Zellen in serumfreiem hämatopoetischem Zellausdehnungsmedium wieder auf. Die Zellen bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für zwei Stunden vorinkubieren. Dann fügen Sie Lentivirus nach den ManuskriptRichtungen und lassen Sie die Zellen im Inkubator für weitere 16 bis 20 Stunden.Am nächsten Tag sammeln Sie die lentivirus-transduzierten Zellen in einem 15 Milliliter konischen Rohr und zentrifugieren Sie sie bei 300 mal G für 10 Minuten. Gemäß den NHA-Richtlinien ist es wichtig, Lentivirus-Vektoren auf Reece-Gruppe-Ebene zwei zu behandeln. Es müssen Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, die auf den Vorschriften der Fazilität basieren.Den Überstand vorsichtig ansaugen und das Pellet in 200 Mikroliter N.R.M. pro Maus wieder aufhängen. Halten Sie die Zellen bei Raumtemperatur bis zur Transplantation in Mäuse. Nach der zweiten Bestrahlungssitzung wird jede anästhesierte Maus mit einer Insulinspritze retro-orbital transduziert abgrenzende negative Zellen injiziert.Drei bis vier Wochen nach der Knochenmarktransplantation erhalten Sie Blutproben aus der retroorbitalen Vene mit Kapillarröhren. 20 Mikroliter Blut in rund-bodenende Polystyrol-Reagenzgläser geben und auf Eis legen. Nach der RBC-Lyse die Zellen mit einem Cocktail monoklonaler Antikörper im Dunkeln 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Nach der Inkubation die Zellen waschen, fixieren und zentrifugieren und das Zellpellet in 400 Mikroliter FACS-Puffer wieder aufhängen. Halten Sie die Proben bei vier Grad Celsius bis zur Analyse durch Durchflusszytometrie. Der Erfolg der Liniennegativzelltransduktion kann mit der zytometrischen Durchflussdetektion von RFP bewertet werden.Es wurde gezeigt, dass nach sieben Tagen In-vitro-Kultur durchschnittlich 75,7% der Zellen transduziert werden. Die Durchflusszytometrie wurde auch zur Analyse des peripheren Blutes der Maus nach der Rekonstitution mit transduzierten und nicht transducierten hämatopoetischen Stammzellen verwendet. Durchschnittlich 94,8% der Neutrophilen, 93,5% der Monozyten und 82,7% der B-Zellen exprimieren RFP.Genomische DNA aus den RFP-positiven Blutzellen wurde PCR verstärkt und zur Sequenzanalyse subkloniert. Verschiedene Mutationen werden erkannt und 69% der Klone zeigen a-frame- oder vorzeitige Stop-Mutationen. Um mit diesem Verfahren erfolgreich zu sein, sind die Vorbereitung eines hohen Antivirenbestands und optimierte Bedingungen für die Transduktion und Transplantation hämatopoetischer Zellen erforderlich.Wir haben diese Technik angewendet, um das Gesetz über Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu studieren. Aber es ist auch nützlich, hämatologische Malignität zu studieren. Diese Methode ermöglicht es uns, die Funktionen neuer Arten von Genen im hämatopoetischen System hocheffizient und hocheffizient zu untersuchen.Wir sammeln dies über die Verfügbarkeit von transgenen Mäusen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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Mit CRISPR/Cas9 gen untersuchen die Onkogene Aktivität des mutierten Calreticulin in Cytokine abhängigen hämatopoetischen Zellen bearbeiten

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