Name: Atmosphärische Molecular Imaging von biologischen Geweben und Biofilme durch LAESI Massenspektrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Erfahren Sie die LAESI-Massenspektrometrie zur molekularen Bildgebung von biologischen Geweben und Biofilmen unter atmosphärischem Druck ohne Probenaufbereitung. Diese Methode ermöglicht direkte Analysen im nativen Zustand.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren sind dankbar für die finanzielle Unterstützung dieser Arbeit durch die US National Science Foundation unter Grant No 0719232, durch das US Department of Energy (DEFG02-01ER15129) und durch Protea Biosciences, Inc. (Morgantown, WV). Die Autoren möchten auch Jessica A. Stolee für ihre Hilfe danken während der Videoaufnahmen des Protokolls.

Das folgende Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte der Laserablation Elektrospray-Ionisation (LAESI) Experiment und liefert repräsentative Beispiele für Seiten-und dreidimensionale (3D) Bildgebung für Tier-und Pflanzenarten Gewebeproben. Weitere experimentelle und technische Details können auch anderweitig beschaffen. 1-6 1. Tissue Vorbereitung und Montage <ol><li> Wenn Schneiden erforderlich ist, verwenden Sie einen cryomicrotome Abschnitt des Gewebes in 10-100 um dicke Scheiben bei -10 bis -20 ° C, sofern nicht anders für einen bestimmten Gewebetyp empfohlen. </li><li> Berg Schnitte auf einer ebenen Fläche (zB chemisch vorgereinigt Glasträger) direkt und ohne chemische Modifikatoren. Für geschnittene Gewebe, Tauwetter-mount Sektionen und sichern Sie den Probenhalter ein Peltier-Kühlung der Bühne sofort nach Tauwetter-Montage, um das Gewebe zu jeder Zeit während der Analyse eingefroren halten. Dieser Schritt ist notwendig zur Minimierung / Vermeidung molekularen Migration im Abschnitt. </li><li> Wenn nötig, verwenden Sie einen Kühlkörper mit einem Low-Power-Ventilator, um die Wärmeabfuhr aus dem Peltier-Bühne zu erleichtern, halten das Gewebe eingefroren ausgestattet. </li><li> In einer feuchten Umgebung über einen längeren Zeitraum (1-2 Stunden), für die Kondensation von Wasser oder Eis auf der Gewebeoberfläche zu inspizieren. Kondensation von Wasser auf das Gewebe nachteilig wirkt sich auf die Abbildungsleistung in LAESI Experimente. 1 </li><li> Wenn nötig, verwenden Sie ein Zimmer Entfeuchter oder setzen Sie die abgekühlte Probe in einer Klimakammer mit einem inerten Gas (zB trockenem Stickstoff) gefüllt, um Kondenswasserbildung zu vermeiden. 1 </li></ol> 2. Optimierung der LAESI Ion Source Die LAESI Ionenquelle besteht aus einer mittleren Infrarot-Laser, eine Reihe von optischen Elementen für die leichtgängige Lenkung und Fokussierung sowie zusätzliche Probenhalter, Kühlkomponenten, Übersetzung Stufen und ein Lösungsmittel Delivery-System. Abbildung 1 zeigt die typische Anordnung dieser Elemente in Bezug auf den Eingang des atmosphärischen Ionenquelle eines Massenspektrometers. <ol><li> Wie in Abbildung 1, Position der Probe 15-20 mm unterhalb der Öffnung des Massenspektrometers Probenahme Kegel (d OR-FP) dargestellt. </li><li> Betrieb eines mid-IR-Laser bei 2,94 um Wellenlänge und 10 Hz Wiederholrate. Dämpfen die Laserleistung bis ~ 100 uJ / Pulsenergie. </li><li> Verwenden Sie eine Kombination von Gold Spiegel und eine fokussierende Linse transparent bei der Laserwellenlänge (zB eine plankonvexe CaF 2 oder ZnSe-Linse) zu koppeln des Laserpulses Energie in der Probe bei senkrechtem Einfall (siehe rechts Einfallswinkel in Bezug auf Probenoberfläche in Abbildung 1). </li><li> Positionieren Sie den mittleren Infrarotbereich Strahlachse 5-8 mm vor der Öffnung des Massenspektrometers Probenahme Kegel. </li><li> Passen Sie die Fokussierlinse Position und die Pulsenergie des Laserstrahls auf Gewebeentnahme im Brennfleck zu erreichen. Die Abmessungen des abgetragenen Volumen bestimmt die Pixelgröße (oder Voxel in dreidimensionale Bildgebung) Größe für die Imaging-Anwendung. </li><li> Position einer Nanospray Emitter im Einklang mit dem Einlass Achse des Massenspektrometers und eine Öffnung-Emitter-Spitze Abstand von ca. 10 mm (siehe Abbildung 1). </li><li> Für die Elektrospray, bereiten 50% Methanol-Lösung mit 0,1% Essigsäure oder 0,1% Ammoniumacetat Additiv für positive oder negative Ionen-Modus bzw.. Abhängig von der Probe, andere organische Lösungsmittel, wie Acetonitril, Isopropanol, etc., kann Methanol in Konzentrationen geeignet für die analytische Aufgabe zu ersetzen. Die Stabilität der Elektrospray ist Voraussetzung für erfolgreiche Bildgebung. Je nach Lösungsmittel Auswahl, benötigen Sie den Durchfluss und die Spritzen Spannung angepasst werden, um stabile Spray zu erreichen. </li><li> Für reaktive LAESI 6 in Imaging-Anwendungen kann der Elektrospray-Lösung enthalten Reaktanten. </li><li> Verwenden Sie eine Spritzenpumpe, die Elektrospray-Lösung durch die Elektrospray Emitter liefern bei einer Flussrate von ~ 300 Nl / min. </li><li> Wenn das Massenspektrometer Öffnung bei einer niedrigen Spannung (&lt;500 V gegen Erde gemessen) gehalten wird, erzeugen Elektrospray durch Anlegen einer Hochspannung direkt an die Elektrospray-Strahler (zB 3000 V) oder durch eine metallene Verbindung. Andernfalls Boden direkt die Elektrospray Emitter oder durch Metall-Gewerkschaft, die Elektrospray etablieren. </li><li> Betreiben Sie die Elektrospray-Quelle in Kegel-jet Spritzen-Modus für die effizienteste Ionenerzeugung durch LAESI. Für die Wirkung der Betriebsgrößen auf den Spritzen-Modi und ihre Wirkung auf die Massenspektren, siehe Diskussionen anderswo. 5,7,8 </li><li> Vorsichtig die relativen Abstände der LAESI Setup für LAESI Ionen-Ausbeute zu optimieren und dabei den Laserstrahl, der Emitter und die Öffnung Achsen in der gleichen Ebene. Hier finden Sie detaillierte Anweisungen an anderer Stelle. 5 </li><li> Mit einem optischen Mikroskop, bestimmen die lateralen Abmessungen der Ablation Krater auf der Probe. </li><li> Für die dreidimensionale Bildgebung LAESI Experimente durchführen Ablation mit einzelnen Impulsen und bestimmen die Tiefe eines Voxels mit, zum Beispiel die Z-Stapel-Modus in der optischen Mikroskopie. 3 </li></ol> 3. Molecular Imaging and Data Analysis In der Imaging-Experiment wird die Gewebeprobe in der Brennebene des Lasers in X-und Y-Richtung mit Schritt Größen größer als oder gleich die Abmessungen der Ablation Stelle bewegt. Die räumliche Auflösung ist durch die Fokussierung des einfallenden Laserstrahls begrenzt. <ol><li> Wählen Sie den Bereich von Interesse auf der Probenoberfläche und erhalten die (X, Y) Koordinaten des entsprechenden Grenzen. </li><li> Wählen Sie einen gridding Algorithmus (zB adaptive Gitter, ausgewählte Region Bildgebung, rechteckigen Raster, spiralförmig, Z Scannen, etc.), mit der die Probenoberfläche mit ausgewählten Zeitpunkt an jedem Pixelverweilzeiten über den Bereich abgebildet werden, um Raster. </li><li> Verwenden Sie ein Drei-Achsen-Übersetzung Bühne und Software, die in der Lage Rasterung der Probe entsprechend dem vorgegebenen Raster. </li><li> Berechnen Sie die gesamte Zeit für die Bildgebung erforderlich. </li><li> Deaktivieren Sie die Datenerfassung Frist des Massenspektrometers. Wenn dies nicht möglich ist, setzen Sie die Datenerfassung Frist auf den berechneten Belichtungszeit Wert. </li><li> Starten Sie den mittleren Infrarot-Laserquelle mit einer Wiederholrate richtige, um eine ausreichende Signal-Rausch-Verhältnis im Massenspektrum erzeugen innerhalb der Verweilzeit an jedem Pixel eine LAESI seitlichen Imaging Experiment durchzuführen. Für 3D-molekulare Bildgebung, verwenden Sie ein Spektrum Akquisition höher als die Laserquelle Repetitionsrate erfolgreich Masse-Analyse der Ionen innerhalb eines einzelnen Laserpulses erzeugt. Warten Sie auf die START-Signal an die Ablation Sequenz einzuleiten. </li><li> Schalten Sie den Elektrospray-Quelle. Stellen Sie sicher, dass es genug für die volle Zeit für die Bildgebung erforderlich. </li><li> Gleichzeitig START den Erwerb von Massenspektren, die mid-IR Laserablation, und die Abtastung der Oberfläche. </li><li> Wenn die Bildgebung laufen beendet hat, stoppen Sie die Abtastung der Oberfläche, die mid-IR Lasern, und die Datenerfassung. </li><li> Deaktivieren Sie die Laserquelle. </li><li> Schalten Sie die Hochspannung. </li><li> Schalten Sie die Spritzenpumpe. </li><li> Set dem Massenspektrometer zu STANDBY-Modus. </li><li> Schalten Sie das Peltier-Kühlung Elektronik. </li><li> Close Inertgasstrom, wenn verwendet. </li><li> Verwenden Sie eine Software, um die absoluten Koordinaten der Pixel in lateraler Bildgebung oder die Voxel in 3D-Analyse mit den entsprechenden Spektren korrelieren. </li><li> Zeichnen Sie die Ionenintensität Signal für einen ausgewählten m / z-Wert gegen den absoluten Koordinaten der Analyse auf Seiten-und 3D-molekularen Bilder zu erhalten. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 2 zeigt repräsentative Ergebnisse für einige wichtige Gewebetypen und bildgebenden Verfahren. Panel A zeigt ein Fall für ein tierisches Gewebe Abschnitt, der während des Experiments, um eine Dehydratation zu verhindern eingefroren wurde. 1 Darüber hinaus wird die Probe in einem trockenen Stickstoff-Umgebung befand auf Umgebungstemperatur Wasserdampf kondensiert auf der Probenoberfläche zu vermeiden. Eine 100-Mikrometer dicke Frontalschnitt vom Gehirn einer Ratte (Rattus norvegicus) wurde seitlich mit LAESI abgebildet. Die anatomischen Regionen des Gehirns (siehe optische Bild in Panel A) zeigen eine gute Korrelation mit der molekularen Bild für den PC Plasmalogene erhalten (O-33: 3) und / oder PE (O-36: 3) mit m / z 728,559. Panel B zeigt die 3D-Bildgebung LAESI einer Zebra-Anlage (Aphelandra squarrosa) Blattgewebe. Da hinterlässt einen natürlichen Abwehrmechanismus gegen Austrocknung besitzen, könnte die Probe in die Umgebung abgefragt werden. 3 Die erhaltenen molekularen 3D-Bilder zeigten eine Vielzahl von Verteilungsmuster für primäre und sekundäre Pflanzenstoffe. Unter anderem wurde acacetin mit m / z 285,076 bei höheren Ionen zählt in den gelben Bereich des zweiten und dritten Schicht von oben mit einer homogenen Verteilung in den anderen erkannt. Diese Verteilung stimmte mit dem Muster der Buntheit in das optische Bild zu sehen. <img src="/files/ftp_upload/2097/2097fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Schematische Darstellung des LAESI System (ES, Elektrospray Emitterspitze, oder Öffnung des Massenspektrometers Probenahme Kegel; FL, fokussierende Linse; FP, Brennpunkt, P, Peltier-Kühlung Bühne, HS, Kühlkörper). Ein Teil der Partikel während der mid-IR-Ablation (rote Punkte) verschmilzt mit der Elektrospray zu geladenen Tröpfchen mit Molekülen und Ionen der Probe (grüne Punkte) ausgesät Ertrag ausgewiesen. Die Ionen von diesen Tröpfchen freigesetzt werden analysiert und aufgenommen von dem Massenspektrometer. <img src="/files/ftp_upload/2097/2097fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse für Quer-und 3D-IMAGI. ng mit LAESI Massenspektrometrie (A) Das obere Feld zeigt das optische Bild vom Gehirn einer Ratte (Rattus norvegicus) Frontalschnitt und die molekulare Bild für den PC Plasmalogene erhalten (O-33: 3) und / oder PE (O-36 : 3) mit m / z 728,559. Der weiße Maßstab entspricht 1 mm. Adaptiert mit Erlaubnis von (Referenz 1). Copyright 2010 American Chemical Society. (B) Die untere Abbildung zeigt die 3D-Bildgebung eines Blattes aus einem bunten Zebra-Anlage (Aphelandra squarrosa). Acacetin mit m / z 285,076 wurde bei höheren Ionen zählt in den gelben Bereich des zweiten und dritten Schicht von oben mit einer homogenen Verteilung in den anderen erkannt. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von (Referenz 3). Copyright 2009 American Chemical Society.

<ol><li>Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Imaging+of+Small+Metabolites+and+Lipids+in+Rat+Brain+Tissues+at+Atmospheric-Pressure+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Imaging of Small Metabolites and Lipids in Rat Brain Tissues at Atmospheric-Pressure by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 82, 982-988 (2010).</li>
<li>Nemes, P., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+electrospray+ionization+for+atmospheric-pressure%2C+in+vivo%2C+and+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure, in vivo, and imaging mass spectrometry.</a> Anal Chem. 79, 8098-8106 (2007).</li>
<li>Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+metabolites+in+tissues+under+ambient+conditions+by+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of metabolites in tissues under ambient conditions by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 81, 6668-6675 (2009).</li>
<li>Nemes, P., Barton, A. A., Li, Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient+molecular+imaging+and+depth+profiling+of+live+tissue+by+infrared+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ambient molecular imaging and depth profiling of live tissue by infrared laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 80, 4575-4582 (2008).</li>
<li>Nemes, P., Vertes, A. Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure molecular imaging mass spectrometry. Mass Spectrometry Imaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNemes%2C+P+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Nemes, S. S., Rubakhin, J. V. , Springer. Volume 656 (2010).</li>
<li>Shrestha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+analysis+of+lipids+and+small+metabolites+in+mouse+brain+tissue+by+AP+IR-MALDI+and+reactive+LAESI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Direct analysis of lipids and small metabolites in mouse brain tissue by AP IR-MALDI and reactive LAESI mass spectrometry.</a> Analyst. 135, 751-758 (2010).</li>
<li>Nemes, P., Marginean, I., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spraying+mode+effect+on+droplet+formation+and+ion+chemistry+in+electrosprays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Spraying mode effect on droplet formation and ion chemistry in electrosprays.</a> Anal Chem. 79, 3105-3116 (2007).</li>
<li>Nemes, P., Goyal, S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+and+noncovalent+complexation+changes+in+proteins+during+electrospray+ionization%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Conformational and noncovalent complexation changes in proteins during electrospray ionization.</a> Anal Chem. 80, 387-395 (2008).</li>
<li>Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+by+Mid-IR+laser+ablation+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+A-Mater+Sci+Process%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging by Mid-IR laser ablation mass spectrometry.</a> Appl Phys A-Mater Sci Process. 93, 885-891 (2008).</li>
<li>Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+metabolic+profiling+of+single+cells+by+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">In situ metabolic profiling of single cells by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 81, 8265-8271 (2009).</li>
<li>Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ambient mass spectrometry.</a> Science. 311, 1566-1570 (2006).</li>
</ol>

Unterschiedliche Gewebetypen weisen unterschiedliche Wassergehalt und Zugfestigkeit, die wiederum die Ablation Eigenschaften der Proben beeinflussen können. 9 Um diese Effekte abzumildern, ist es erwünscht, dass die Laserfluenz, Probenhandling und Analyse-Protokolle überarbeitet beim Wechsel zwischen sein wichtigen Gewebetypen. Für einzelne Zelle oder eine höhere Auflösung Untersuchungen, die Mitte der Infrarot-Licht lässt sich in einem geschärften Glasfaser statt einer fokussierenden Linse gekoppelt werden. 10 Mit der Positionierung der Faserspitze in der Nähe der ausgewählten Zellen in einem Gewebe, kann LAESI Analyse durchgeführt werden Ein-Zell-Ebene. Als Label-free-Ionenquelle für Ambient-Massenspektrometrie, hat 11 LAESI großes Potenzial für die Untersuchung der biochemischen Prozesse im Gewebe gezeigt. Mit dem zusätzlichen Nutzen einer direkten Analyse, Quer-und 3D-Bildgebung ist LAESI ein aufstrebendes bioanalytische Werkzeug für die Profilierung als auch Imaging-Anwendungen.

<table><tbody><tr><td>Massenspektrometer</td><td>Waters</td><td>Q-TOF Premier</td><td></td></tr><tr><td>Mittel-IR-Laser</td><td>Opotek Inc. (Carlsbad, CA)</td><td>Vibrant IR</td><td></td></tr></tbody></table>

atmosphärische molecular imaging von biologischen geweben und biofilme durch laesi massenspektrometrie

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Ambient-Ionisation-Methoden in der Massenspektrometrie können analytische Untersuchungen direkt auf ein Gewebe oder Biofilm unter nativ-ähnlichen experimentellen Bedingungen durchgeführt werden. Laser-Ablation Elektrospray-Ionisation (LAESI) ist eine solche Entwicklung und ist besonders für die Untersuchung von Wasser enthaltenden Proben gut geeignet. LAESI nutzt eine Mitte-Infrarot-Laserstrahl (2,94 um Wellenlänge), um die Wassermoleküle der Probe anzuregen. Wenn die Ablation Einfluss Schwellenwert überschritten wird, wird das Probenmaterial in Form von Feinstaub ausgestoßen und diese Geschosse reisen, um zehn Millimeter über der Probenoberfläche. In LAESI, ist dies Ablation plume von hoch geladenen Tröpfchen abgefangen zu einem Bruchteil der ausgestoßenen Probenmaterial zu erfassen und konvertieren seine chemischen Bestandteile in Ionen in der Gasphase. Ein Massenspektrometer mit einer Atmosphärendruck-Ionenquelle Schnittstelle ausgestattet wird eingesetzt, um zu analysieren und erfassen die Zusammensetzung der freigesetzten Ionen, die aus dem Bereich untersucht (Pixel) der Probe. Eine systematische Befragung über ein Array von Pixeln, öffnet sich ein Weg für die molekulare Bildgebung in der Mikrosondenanalyse Modus. Ein einzigartiger Aspekt LAESI bildgebenden Massenspektrometrie ist Tiefenprofilierung, die in Kombination mit seitlichen Bildgebung ermöglicht dreidimensionale (3D) die molekulare Bildgebung. Mit aktuellen Quer-und Tiefenauflösung von ca. 100 mu m und ~ 40 um, bzw. hilft LAESI bildgebenden Massenspektrometrie, die molekulare Struktur von biologischen Geweben zu erkunden. In diesem Aufsatz haben wir die wichtigsten Elemente einer LAESI und Leitlinien für eine erfolgreiche Imaging Experiment.

Laser-Ablation Elektrospray-Ionisation (LAESI) ist eines Atmosphärendruck-Ionenquelle für die Massenspektrometrie. Im Imaging-Modus, ein mittleres Infrarot-Laser-Sonden die Verteilung der Moleküle über einen Gewebeschnitt oder einen Biofilm. Diese Technik stellt einen neuen Ansatz für die unterschiedlichsten bioanalytische Untersuchungen unter nativen experimentellen Bedingungen durchgeführt.

Atmosphärische Molecular Imaging von biologischen Geweben und Biofilme durch LAESI Massenspektrometrie

Ambient-Ionisationsmethoden in der Massenspektrometrie ermöglichen analytische Untersuchungen direkt an einem Gewebe oder Biofilm unter naturnahen...

Um ein faules Massenspektrometrie-Bildgebungs-Experiment an einem biologischen Gewebe oder Biofilm durchzuführen, wird der faule Aufbau für einen robusten Betrieb vorbereitet. Als nächster Schritt wird die Probe in eine Probenhalterung eingesetzt und die für die untersuchte Probe erforderlichen experimentellen Bedingungen werden identifiziert. Anschließend wird das laterale faule molekulare Bildgebungs-Experiment gestartet und die benötigten Daten werden verwendet, um räumliche Molekülverteilungen zu erhalten.Die Ergebnisse zeigen die molekulare Architektur biologischer Gewebe und Biofilme. Ich bin Dr. Peter Nemes vom Vertus-Forschungslabor an der George Washington University. Der Hauptvorteil der Lazy-Technik gegenüber anderen Methoden, einschließlich konfokaler, optischer und massenspektrometrischer Bildgebungsverfahren wie MALDI und SIMS, besteht darin, dass die Probennahme direkt am Gewebe unter atmosphärischen Bedingungen durchgeführt werden kann und keine Probenvorbereitung erforderlich ist.Befestigen Sie die gewünschten Gewebeschnitte direkt auf einer flachen Oberfläche, beispielsweise einem chemisch vorgereinigten Objektträger ohne chemische Zusätze. Sichern Sie die Probe unmittelbar nach dem Aufbringen gegebenenfalls an einer Peltier-Kühlstufe; verwenden Sie einen Wärmeleiter mit einem Gebläse geringer Leistung, um die Wärmeabfuhr von der Peltier-Stufe zu unterstützen. Wenn anschließend über einen längeren Zeitraum von etwa einer bis zwei Stunden in einer feuchten Umgebung gearbeitet wird, überprüfen Sie die Gewebeoberfläche auf Kondensation von Wasser oder Eis.Die Kondensation von Wasser auf dem Gewebe beeinträchtigt die Bildqualität in LAZY-Experimenten nachteilig. Verwenden Sie gegebenenfalls einen Raumluftentfeuchter oder stellen Sie die betreffende Probe in eine Umgebungskammer, die mit einem Inertgas wie trockenem Stickstoffgas gefüllt ist, um Kondensation zu verhindern. Nach der Optimierung der Bedingungen zur Aufrechterhaltung der Probe folgt die Optimierung der verwendeten Ionenquelle; die Laserablation, Elektrospray-Ionisation oder die LAZY-Eisenquelle besteht aus einem mittelinfraroten Laser, abgekürzt als mid-IR, und einer Reihe optischer Elemente zur Lenkung und Fokussierung des Lichts.Die Vorrichtung umfasst außerdem zusätzliche Probenhalter, Kühlkomponenten, Translationsstufen und ein Elektrosprüh-System. Ein Teil der Partikel, die während der mittleren IR-Ablation ausgestoßen werden, verbindet sich mit dem Elektrospray und erzeugt geladene Tröpfchen, die mit Molekülen und Ionen der Probe besiedelt sind. Die aus diesen Tröpfchen freigesetzten Ionen werden vom Massenspektrometer analysiert und aufgezeichnet, dessen Öffnung hier gezeigt ist.Die träge Einrichtung wird vor Beginn des Experiments konfiguriert. Es sind genaue Anpassungen der experimentellen Parameter erforderlich, um die Probe entsprechend anzupassen und die Ionenquelle zu optimieren. Positionieren Sie die Probe zunächst 15 bis 20 Millimeter unterhalb der Öffnung des Probeneingangskonus des Massenspektrometers.Betreiben Sie den mittleren IR-Laser bei einer Wellenlänge von 2,94 Mikrometer und einer Wiederholrate von 10 Hertz. Dämpfen Sie die Laserleistung auf etwa 100 Mikrojoule pro Pulsenergie ab. Koppeln Sie die Laserlichtenergie mithilfe einer Kombination aus Goldspiegeln und einer fokussierenden Linse, die für die Laserwellenlänge transparent ist, in die Probe ein.Positionieren Sie bei normaler Einstrahlung die Mittelinfrarot-B-Achse fünf bis acht Millimeter vor der Öffnung des Probeneingangskonus des Massenspektrometers. Stellen Sie die Position der Fokussierlinse und die Laserimpulsenergie so ein, dass eine Gewebeentfernung im Fokus auf die gewünschte Tiefe erfolgt. Die Abmessungen des ablatierten Volumens.Bestimmen Sie die Pixelgröße für die Bildgebungsanwendung. Positionieren Sie einen Nanospray-Emittor entlang der Einlassachse des Massenspektrometers und in einem Abstand von etwa 10 Millimetern zwischen Öffnung und Emitterspitze. Für den Elektrospray bereiten Sie eine 50%ige Methanollösung mit 0,1% Essigsäure für den positiven Ionenmodus oder 0,1% Ammoniumacetat vor.Für den Negativ-Ionen-Modus. Die Stabilität des Elektrosprays ist entscheidend für eine erfolgreiche Bildgebung. Abhängig von der gewählten Lösungsmittels müssen die Flussrate und die Sprühspannung angepasst werden, um einen stabilen Spray zu erzielen.Für reaktive, träge und bildgebende Anwendungen kann die Elektrosprüh-Lösung Reaktanten enthalten. Verwenden Sie eine Spritzenpumpe, um die Elektrosprüh-Lösung über den Elektrosprüh-Emittor mit einer Flussrate von etwa 300 Nanolitern pro Minute zuzuführen. Wenn die Öffnung des Massenspektrometers auf einer niedrigen Spannung gehalten wird, beispielsweise unterhalb von etwa 500 Volt bezogen auf Masse, erzeugen Sie den Elektrospray, indem Sie eine Hochspannung, beispielsweise 3000 Volt, direkt an den Elektrosprüh-Emittor oder über eine Metallverbindung anlegen.Betreiben Sie die Elektrospray-Quelle im Konus-Jet-Sprühmodus, um eine möglichst effiziente Ionenbildung zu erreichen. Passen Sie vorsichtig die relativen Abstände des Trägheits-Setups an, um die Ionenausbeute zu optimieren, wobei Laserstrahl, Emitter und Öffnungsachse mit einem optischen Mikroskop in derselben Ebene gehalten werden. Bestimmen Sie die lateralen Abmessungen des Ablationskraters auf der Probe für dreidimensionale Trägheits-Bildgebungsversuche. Führen Sie die Ablation mit einzelnen Impulsen durch und ermitteln Sie die Tiefe eines Voxel beispielsweise mithilfe des Z-Stack-Modus in der optischen Mikroskopie.Nachdem nun die Bedingungen für die Probenaufbringung und die Ionisationsquelle optimiert sind, fahren Sie mit der molekularen Bildgebung im Bildgebungsversuch fort. Die Gewebeprobe wird in der Fokusebene des Lasers in x- und y-Richtung mit Schrittweiten bewegt, die größer oder gleich den Dimensionen des Ablationsflecks sind. Die räumliche Auflösung ist durch die Fokussierung des einfallenden Laserstrahls begrenzt.Wählen Sie einen interessierenden Bereich auf der Probenoberfläche aus und ermitteln Sie die XY-Koordinaten der entsprechenden Begrenzungen. Wählen Sie einen Rasterungsalgorithmus, mit dem die Probenoberfläche mit einer festgelegten Verweilzeit pro Pixel über den abzubildenden Bereich gescannt wird. Verwenden Sie eine dreidimensionale Translationsstufe (XS) und Software, die in der Lage ist, die Probe gemäß dem vorbestimmten Raster zu bewegen.Berechnen Sie anschließend die gesamte für die Bildgebung erforderliche Zeit. Starten Sie die mittelinfrarote Laserquelle mit einer Wiederholrate, die ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis für die ausgewählten Ionen im Massenspektrum innerhalb der Verweilzeit an jedem Pixel erzeugt. Um ein träges laterales Bildgebungs-Experiment durchzuführen, schalten Sie die Elektrosprayquelle ein.Stellen Sie sicher, dass ausreichend Lösung für die gesamte zur Bildgebung erforderliche Zeit vorhanden ist. Starten Sie nun gleichzeitig die Erfassung der Massenspektren, die mittlere IR-Laserablation und das Abtasten der Oberfläche und sammeln Sie die Daten. Sobald der Bildgebungsablauf abgeschlossen ist, beenden Sie das Abtasten der Oberfläche, den mittleren IR-Laser und die Datenerfassung.Deaktivieren Sie die Laserquelle, schalten Sie die Hochspannung aus, schalten Sie die Spritzenpumpe ab und stellen Sie das Massenspektrometer in den Standby-Modus. Schalten Sie außerdem die Peltier-Kühlungselektronik aus und schließen Sie den Inertgasfluss. Falls verwendet.Abschließend wird das Ionensignal einer ausgewählten m/z-Größe in Abhängigkeit von den absoluten Analysekoordinaten aufgetragen, um laterale oder 3D-molekulare Bilder zu erhalten. Dies sind repräsentative Bilder einer lateralen Lazy-Bildgebung eines 100 µm dicken koronaren Schnitts eines Rattenhirns. Der Schnitt wurde während des Experiments eingefroren und in einer trockenen Stickstoffatmosphäre aufbewahrt.Die anatomischen Regionen des Gehirns zeigen eine gute Korrelation mit dem für zwei Plasmodien bei m/z 2 78 0,59 erhaltenen molekularen Bild. Dies ist ein molekulares Bildgebungs-Experiment in 3D an Gewebe von Zebrapflanzenblättern, das in der Umgebungsatmosphäre unter anderem an primären und sekundären Metaboliten durchgeführt wurde. ASCE mit m/z 2 85 0,076 wurde in den gelben Sektoren der zweiten und dritten Schicht von oben mit höheren Ionenanzahlen und einer homogenen Verteilung nachgewiesen.Bei den anderen stimmte diese Verteilung mit dem Muster der Variation im optischen Bild überein. H nach seiner Entwicklung. Die träge Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der analytischen und B-Chemie den Weg, um die molekulare Zusammensetzung und räumliche Organisation von Geweben und Biofilmen mit beachtlichem Wassergehalt zu untersuchen.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem mittleren Infrarotlaser und einer elektrischen Sprühquelle äußerst gefährlich sein kann. Befolgen Sie stets die standardmäßigen Lasersicherheitsprotokolle und verwenden Sie während dieses Verfahrens eine geeignete Abschirmung für alle elektrischen Verbindungen.

atmospheric-pressure-molecular-imaging-biological-tissues-biofilms

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Einzel-Zell-Analyse wird durch Massenspektrometrie an pflanzlichen und tierischen Zellen bei Atmosphärendruck durch eine geschärfte Glasfaser, um die Zellen für die Laserablation Elektrospray-Ionisation (LAESI) Massenspektrometrie Probe durchgeführt.

Direkte Analyse von Einzelzellen durch Massenspektrometrie bei Atmosphärendruck

Sekundäre Elektrospray Massenspektrometrie (SESI-MS) ermöglicht die Detektion von flüchtigen organischen Verbindungen (VOC), ohne dass für jede Vorbehandlung der Probe. Dieses Protokoll enthält Anweisungen für die schnelle (innerhalb von Minuten) Charakterisierung von bakteriellen VOCs mit SESI-MS.

Charakterisierung Bakterielle Flüchtige mit Secondary Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie (SESI-MS)

Desorption Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (DESI-MS) ist eine Methode, mit der Umgebungsluft Proben, einschließlich biologischen Geweben, mit minimaler Probenvorbereitung abgebildet werden kann. Durch Rastern der Probe unterhalb der Ionisationselektrode, bietet dieses Spray-basierte Technik ausreichender räumlicher Auflösung auf molekularen Eigenschaften von Interesse in Gewebeschnitten zu erkennen.

Imaging von biologischem Gewebe durch Desorption Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie

Laser-Emissionsspektroskopie an dünnen Organ-und Tumorgewebe durchgeführt erfolgreich erkannt natürlichen Elemente und künstlich injiziert Gadolinium (Gd), von Gd-Nanopartikel auf der Basis ausgestellt. Bilder von chemischen Elementen erreicht eine Auflösung von 100 um und quantitative Unter mM Empfindlichkeit. Die Kompatibilität der Einrichtung mit optischen Standardmikroskop hebt das Potential, um mehrere Bilder von einer gleichen biologischen Gewebes bereitzustellen.

Laserinduzierte Plasmaspektroskopie: ein neuer Ansatz für die Nanopartikel-Mapping und Quantifizierung in Organgewebe

Hier präsentieren wir Protokolle zur Durchführung sowohl der Umgebungsmassenspektrometrie-Bildgebung (MSI) von Geweben als auch der In-situ-Live-Einzelzell-MS (SCMS)-Analyse mit der Einzelsonde, einem miniaturisierten multifunktionalen Gerät für die MS-Analyse.

Anwendungen der Einzel-Sonde: Mass Spectrometry Imaging und Einzelzellanalyse unter Umgebungsbedingungen

Eine massenspektrometrische Bildgebungsquelle (MSI), die bei Atmosphärendruck betrieben wird, wurde durch Kopplung von Laserdesorption im mittleren Infrarot und Elektrospray-Nachionisation entwickelt. Als energieabsorbierende Matrix wurde eine exogene Eismatrix verwendet, um die resonante Desorption von gewebebezogenem Material zu erleichtern. Dieses Manuskript enthält ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Durchführung der IR-MALDESI MSI bei einer Ganzkörper-Neugeborenenmaus.

Ganzkörper-Massenspektrometrie Imaging durch Infrarot-Matrix-assistierte Laser-Desorptions-Elektrospray-Ionisations (IR-MALDESI)

Ein Protokoll zur Charakterisierung der chemischen Zusammensetzung der Ausatmungsluft in Echtzeit mithilfe von sekundären Nanoelectrospray Ionisation gekoppelt an hochauflösende Massenspektrometrie nachgewiesen wird.

Echtzeit-Atem-Analyse mithilfe von sekundären Nanoelectrospray Ionisation mit hochauflösenden Massenspektrometrie gekoppelt

Dieses Protokoll beschreibt eine reproduzierbare und zuverlässige Methode für die Sublimation-basierte Erstellung von Formalin fixiert Gewebe für bildgebende Massenspektrometrie bestimmt.

Optimale Vorbereitung von Formalin fixiert Proben für Peptid-Matrix basierten Assisted Laser Desorption/Ionisierung Massenspektrometrie Imaging-Workflows

Ein neuartiges Verfahren der Probenvorbereitung wurde entwickelt, um Platz für Zell- und Coculture um niedermolekulare Exchange über bildgebende Massenspektrometrie zu erkennen.

Erfassung von niedermolekularer Kommunikation zwischen Gewebe und Zellen mit Hilfe von Imaging-Massenspektrometrie

Das Ziel dieses Protokolls ist es, detaillierte Anleitungen zur Probenvorbereitung bei der Planung von Experimenten mit MALDI MSI zur Maximierung des metabolischen und molekularen Nachweises in biologischen Proben bereitzustellen.

Probenvorbereitung für metabolisches Profiling mittels MALDI-Massenspektrometrie-Bildgebung

Erfahren Sie die LAESI-Massenspektrometrie zur molekularen Bildgebung von biologischen Geweben und Biofilmen unter atmosphärischem Druck ohne Probenaufbereitung. Diese Methode ermöglicht direkte Analysen im nativen Zustand.

Atmosphärische Molecular Imaging von biologischen Geweben und Biofilme durch LAESI Massenspektrometrie

Weitere Videos entdecken