Name: In-vivo-Mikro-Zirkulation Measurement im Skelettmuskel von Intra-vital-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Erfahren Sie eine neue Methode zur kontinuierlichen Messung der Mikrozirkulation im Skelettmuskel lebender Tiere mittels Intravitalmikroskopie. Diese Technik ermöglicht quantitative Blutflussparameter und Langzeitbeobachtungen.

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Wir bedanken uns bei JW Lichtman für seine Beratung in in vivo Beobachtung der Muskeln.

RBC Membranfärbung <ol><li> Maus roten Blutkörperchen wurden aus dem gleichen Mausstamm mit Heparinisierung korrigiert. </li><li> Maus RBC wurden mit PKH26 Farbstoff (; Rot fluoreszierende Zelle Linker Kit, Sigma, USA 551/567 nm) gefärbt. </li><li> RBC wurden in PBS gewaschen und mit 2 um Lösung des PKH26 Farbstoff für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Plasma (Hitze für 1 Stunde bei 65 ° C vorher inaktiviert) und für 1 Minute gestoppt. </li><li> Die Kirchenfenster RBC wurden 5 mal mit PBS gewaschen. </li></ol> Maus Vorbereitung <ol><li> Drei bis sechs Monate alten männlichen C57BL/10 Mäuse wurden in dieser Studie verwendet. Wir narkotisierten Mäusen durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital (50mg/kgBW). </li><li> Die Mäuse wurden dann mit einem 20-gage Polyethylen-Rohr intubiert beatmeten und erwärmt auf 37 ° C auf einem Blatt Kapton Heizer verbunden mit einem Thermoelement-Sensor und Feedback Temperaturregler System. </li><li> Die ventrale Seite des Halses wurde rasiert. Die rechten und linken M. sternocleidomastoideus Muskeln ausgesetzt waren. Die Muskeln wurden durch eine Edelstahl-Halterung unterstützt und superfundiert mit steriler Krebs-Ringer-Lösung. </li></ol> Injektion <ol><li> Stained Erythrozyten wurden bei 37 ° C, mit Krebs-Ringer verdünnt erwärmt. 50ul von Kirchenfenstern RBC (Hämatokrit 12%) wurde in der Maus aus dem Penis injiziert. </li></ol> In vivo mikroskopische Beobachtung der Skelettmuskulatur Wir folgten Jeff W. Lichtman &#39;s Methode mit der Modifikation 1: <ol><li> Die Tiere wurden auf einem Heizkissen auf einem handgefertigten Eisen Stufe eines Nikon Eclipse-800-Mikroskop gelegt. Wasser-Eintauchen Objektive wurden für die Live-epi-Fluoreszenz-Beobachtung eingesetzt. Wir beobachteten PKH26 gebeizt RBC fließt im Inneren der Gefäße unter fluoreszierendem Licht einer Quecksilber-Lampe. Wir identifizierten primären Arteriolen, sekundäre Arteriolen, Kapillaren und Venen durch ihre RBCs Fließrichtungen und Architekturen. </li><li> Eine verstärkte SIT-Kamera (Hamamatsu Photonics, C2400, Japan) und Video-Frame Grabber installiert wurden, um die low-intensity-Signal an der Echtzeit-Video-Rate (30 Bilder pro Sekunde) zu erfassen. Die Bilder wurden auf DVD als Video-Dateien aufgezeichnet. </li></ol> Muskelstimulation <ol><li> Ein elektrischer Impuls wurde mit Hilfe eines peripheren Nerven Stimulator (Innervator 252, Fisher &amp; Paykel Healthcare, New Zealand), und an Muskel-Oberfläche über eine beschichtete Edelstahl-Sonde. A minus Sonde Ende wurde am proximalen Teil des Muskels platziert und ein Plus-Ende wurde am distalen Teil des Muskels platziert. Tetanus Reize wurden mit einer Rate von 50 Hz für 5 Sekunden. Die elektrischen Impulse nicht die Ursache für direkte myofiber Schäden an der Umgebung der Kontaktfläche. </li></ol> RBC Stoffflussanalyse <ol><li> DVD-Video Bilder wurden Video Savant Bilddateien über Framegrabber-Software (Video Savant, USA) übertragen. Video Bilder wurden in eingestellten Geschwindigkeit überprüft werden, um einzelne Flecken RBC visualisieren. RBC Fluss wurde durch Zählen RBC, die durch eine gezielte primäre Arteriole pro Minute flog gemessen. </li></ol>

<ol><li>Lichtman, J. W., Magrassi, L., Purves, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+neuromuscular+junctions+over+periods+of+several+months+in+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualization of neuromuscular junctions over periods of several months in living mice.</a> J Neurosci. 7, 1215-1222 (1987).</li>
</ol>

Alle Verfahren im Zusammenhang mit Tierversuchen wurden überprüft und durch den Unterausschuss für Forschung Animal Care of Massachusetts General Hospital genehmigt.

Wichtige techinical Punkte sind wie folgt: (1) Wartung der physiologische Zustand des Tieres (Lüftung, pH-Wert der Lösung perfusative, Körpertemperatur), (2) Injektionsvolumen des gefärbten RBC, und (3) Bedingungen für die Beobachtung (optimale Linse Auswahl-, Fluoreszenz-Intensität). Mögliche zukünftige Anwendungen sind wie folgt: (a) Kombination mit pharmacophysiological und / oder molekularbiologische Eingriffe, (b) langfristige Beobachtung der arterio / arteriolo-Sklerose und Gefäßneubildung.

<table><tbody><tr><td>PKH26-Farbstoff </td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>551/567 nm; rot fluoreszierendes Zellmarkierungskit</td></tr><tr><td>C57BL/10-Mäuse </td><td>Tier</td><td></td><td></td><td>Männliche Tiere im Alter von drei bis sechs Monaten</td></tr><tr><td>Pentobarbital </td><td></td><td></td><td></td><td>Anästhetikum, 50 mg/kg KG, i.p.</td></tr></tbody></table>

in-vivo-mikro-zirkulation measurement im skelettmuskel von intra-vital-mikroskopie

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

HINTERGRUND: regulatorische Faktoren und detaillierte Physiologie der In-vivo-Mikrozirkulation geblieben nicht in vollem Umfang nach vielen verschiedenen Modalitäten der Bildgebung erfunden geklärt. Während viele makroskopischer Parameter des Blutflusses Strömungsgeschwindigkeit, Änderungen in der Geschwindigkeit des Blutflusses und der roten Blutkörperchen (RBC) spiegeln Fluss nicht halten lineare Beziehung in die mikroskopischen Beobachtungen. Es gibt Berichte über Diskrepanz zwischen RBC Geschwindigkeit und RBC flux, flux RBC und Plasma-Volumenstrom und der räumlichen und zeitlichen Heterogenität der Durchflussregelung in den peripheren Geweben in mikroskopischen Beobachtungen, eine wissenschaftliche Grundlage für die Anforderung von detaillierteren Studien in der Mikrozirkulation der Verordnung über Intravitalmikroskopie. Methoden: Wir modifizierten Jeff Lichtman Methode der in vivo mikroskopische Beobachtung der Maus Kopfnicker Muskeln. Mäuse sind betäubt, belüftet, und injiziert mit PKH26L-fluoreszenzmarkierten Erythrozyten zur mikroskopischen Beobachtung. ERGEBNIS &amp; FAZIT: Fluoreszenz-markierte Erythrozyten werden erkannt und auch durch eine breite-Mikroskop aus. Muskelkontraktion durch elektrische Stimulation induzierte Zunahme RBC Flusses hervorgerufen. Quantifizierung von anderen Parametern, einschließlich RBC Geschwindigkeit und Kapillardichte möglich waren. Mäuse gut vertragen die Operation, Injektion von gefärbten roten Blutkörperchen, mikroskopische Beobachtung und elektrischer Stimulation. Kein Muskel-oder Blutgefäß beschädigt wurde beobachtet, was darauf hindeutet, dass unsere Methode relativ weniger invasive und geeignet für Langzeit-Beobachtungen ist.

Eine neue vielseitige Methode zur Beobachtung der Mikrozirkulation wird vorgestellt. Es gilt als geeignet für eine langfristige Beobachtung und für die Kombination mit pharmacophysiological oder molekularbiologische Eingriffe.

In-vivo-Mikro-Zirkulation Measurement im Skelettmuskel von Intra-vital-Mikroskopie

HINTERGRUND: Die regulatorischen Faktoren und die detaillierte Physiologie der In-vivo-Mikrozirkulation sind trotz zahlreicher verschiedener Modalitäten von ... nicht vollständig geklärt geblieben.

Hallo, mein Name ist Aki, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter an der Harvard Medical School, Massachusetts General Hospital. In dieser Videozeitschrift stelle ich eine neue Methode des In-vivo-Mikroskops vor. Mit dieser Technik können wir quantitativen Blutfluss in mikroskopischen Sekreten messen.Der Zweck unseres Experiments besteht darin, ein System für die kontinuierliche Messung der in-vivo-Mikrosekretion einzurichten. Wir haben dieses Projekt entwickelt, um den Blutfluss auf Kapillarebene und im vorderen Bereich von Muskeln eines lebenden Tieres unter dem Mikroskop sichtbar zu machen. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden der in-vivo-Ionenmessung, wie beispielsweise der Blutultraschalluntersuchung oder der Sauerstoffspannungsmessung, ermöglicht unsere Methode die Messung mehrerer Parameter des Blutflusses, nämlich des roten Blutkörperchen-Flusses oder der Erythrozyten-Geschwindigkeit sowie des Plasmaflusses. Die Erfassung dieser Parameter wird mikrozirkulatorische Veränderungen detaillierter aufdecken.Dann wird unsere Methode angewendet, um Durchblutungsänderungen als Reaktion auf physiologische Stimulation in lebendem Muskelgewebe nachzuweisen. Unsere Methode ist einfacher und weniger invasiv als die konventionelle In-vivo-Mikroskopie, wodurch die Muskeln direkt zugänglich sind und wir elektrische physiologische Stimulationen an Mausmuskeln anwenden sowie die detaillierte Antwort der Durchblutung auf Muskelkontraktion beschreiben können. Eine Vollnarkose wurde durch Natriumpentobarbital induziert.Das Haar am Hals wurde mit Enthaarungscreme entfernt. Führen Sie einen endotrachealen Tubus ein. Schließen Sie den mechanischen Beatmungsgerät am Hals an.Hautexposition des Brustbeins und des Musculus sternocleidomastoideus. Der Muskelblock des Musculus sternocleidomastoideus wurde auf Temperatur gebracht. Steuerungspad, Gewinnung von Blut von einer Maus, Waschen der roten Blutkörperchen mit PBS und Inkubation mit PKH 26. Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, die Färbung mit hitzeinaktiviertem Plasma stoppen und die roten Blutkörperchen mit PBS waschen.Die angefärbten roten Blutkörperchen wurden intravenös in eine andere Maus derselben Stammeslinie injiziert, verbinden Sie die Proben mit dem Elektropuls-Generator, platzieren Sie die Proben auf dem Muskel, stellen Sie sie auf den Mikroskoptisch. Beobachten und dokumentieren Sie die Bilder unter dem fluoreszierenden Licht am Mikroskop. Beobachtung: Die normale physiologische Kontraktion wurde durch den Puls-Generator ausgelöst.Die folgenden Punkte sind mehrere wichtige technische Aspekte in diesem Experiment, um konsistente Daten zu erhalten. Zunächst wurde, um den normalen physiologischen Zustand des Tieres aufrechtzuerhalten, die Maus an einen mechanischen Beatmungsapparat angeschlossen, wobei ein Atemzugvolumen von 60 µL und eine Atemfrequenz von 60 Atemzügen pro Minute eingestellt wurden, um die Blutgasparameter unter konsistenten physiologischen Bedingungen zu halten. Die Körpertemperatur des Tieres wurde mittels einer Heizplatte kontrolliert und bei 37 °C gehalten. Als Zweites zählten wir zur Quantifizierung des Blutflusses angefärbte rote Blutkörperchen, die durch die Kapillare nach Injektion liefen.Das Volumen der gefärbten Erythrozyten war konstant, sodass das Verhältnis von gefärbten zu ungefärbten Erythrozyten zwischen 0,1 und 0,5 % liegen sollte. Bei dieser Injektionsmethode wurde eine optimale Trennung der Erythrozyten erreicht, wenn die Gesamtanzahl der Erythrozyten berechnet wurde, basierend auf der tatsächlichen Zählung und dem Verhältnis der gefärbten zu den nicht mit ST gefärbten Population. Für die in-vivo-Beobachtung unter dem Mikroskop war eine optimale Objektivauswahl entscheidend. Ein geeignetes Objektiv wurde anhand seiner Eignung für die Wassereintauchung und der Arbeitsdistanz ausgewählt.Außerdem verringern wir die Intensität des Fluoreszenzlichts durch Kombination von Neutraldichtefiltern, um unerwartete Lichteffekte auf das Muskelgewebe zu vermeiden. In weiteren Anwendungen planen wir, diese Methode zu erweitern, um die Reaktion der Mikrozirkulation auf verschiedene pharmakologische und molekularbiologische Interventionen zu untersuchen. Wir werden in der Lage sein, zu messen, wie sich sowohl Dilatatoren als auch Gefäßkonstriktoren auf den Durchfluss auf der Ebene der Kapillaren und Arteriolen auswirken, da die Tiere den Eingriff gut vertragen und nach dem Experiment überleben. Danach können wir langfristig wiederholt Untersuchungen am selben Tier durchführen.Zum Beispiel ist es möglich, subtile Veränderungen der Arteriosklerose oder Angiogenese auf der mikrosekretorischen Ebene in den einzelnen Gefäßen derselben Maus zu verfolgen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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