Doppel-Fluoreszenz- In situ Hybridisierung in Fresh Hirnschnitten
14. August 2010
Dieses Protokoll umfasst eine nicht-radioaktive In-situ Hybridisierungsverfahren, dass die gleichzeitige Identifizierung von zwei Transkript Spezies ermöglicht, bei einer einzigen Zelle Auflösung, in dünne Schnitte von Gehirn der Wirbeltiere.
Hallo, ich bin JA, wissenschaftlicher Mitarbeiter im AL-Helfer-Labor an der Universität von Rochester. Wir zeigen Ihnen das Verfahren der hybriden Verdauung in frisch gefrorenen Gehirnschnitten, um zwei mRNA-Transkripte gleichzeitig mit Einzelzellauflösung nachzuweisen. Diese Methode kann dabei helfen, offene Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, beispielsweise im Zusammenhang mit der anatomischen, funktionellen, molekularen und neurochemischen Organisation einer neuronalen Schaltung im Gehirn.
Obwohl diese Methode Einblicke in die Genkoagulation in Neuronen des AV-Gehirns liefern kann, ist sie auch auf andere Systeme wie Nagetiere sowie eine Vielzahl neuraler Gewebe anwendbar. Um dieses Verfahren zu beginnen, hydratisieren Sie eine ausreichende Menge SDX G 50-Pulver mit RNAs durch Wasser.
Mischen Sie die Lösung kurz und lagern Sie sie bei Raumtemperatur für zwei bis fünf Minuten. Dieser Schritt trennt die SDX-Kügelchen von der in kommerziellem Sedex-Pulver enthaltenen Dextrose nach der Sedex G 50-Fällung. Entfernen Sie das Sennet und wiederholen Sie den Vorgang drei bis fünfmal; nach der letzten Wäsche resuspendieren Sie die SX G 50-Lösung im Verhältnis 1:1 (Puffer-zu-Kügelchenvolumen) in TE-Puffer und lagern Sie bei vier Grad Celsius bis zur Verwendung.
Bereiten Sie als Nächstes die Säulen vor. Geben Sie autoklaviertes Glaswolle in eine sterile Ein-Milliliter-Spritze und verdichten Sie sie mit dem Kolben, um eine kompakte Schicht am Boden zu erzeugen. Stellen Sie dann die Spritze in ein 15-Milliliter-Falcon-Gefäß.
Füllen Sie die Säulen mit Sedex G 50-Lösung durch Zentrifugation bei 1000 Umdrehungen pro Minute für 30 Sekunden unter Verwendung einer Beckman-Zentrifuge mit einem festen C 0 6 5 0-Winkelrotor. Nach der Zentrifugation waschen Sie jede Säule, indem Sie 200 Mikroliter Säulenspüfpuffer hinzufügen und zwei Minuten bei 1000 Umdrehungen pro Minute zentrifugieren.
Wie zuvor. Geben Sie abschließend 200 Mikroliter Sperrpuffer auf jede Säule und zentrifugieren Sie zwei Minuten bei 1000 Umdrehungen pro Minute. Wiederholen Sie diesen Schritt vier bis fünf Mal, um die Säule zu equilibrieren.
Bewahren Sie die vorbereiteten Säulen bei vier Grad Celsius auf, bis die RIBA-Sonde markiert und zur Reinigung bereit ist, für die hier gezeigte doppelte Fluoreszenz-in-C-zwei-Hybridisierung oder D-FISH-Prozedur. Zwei RNA-Sonden werden hergestellt, eine mit Doxigenin oder DIG versicherte und die andere mit Biotin markiert. Beginnen Sie mit der Markierung der Sonden, indem Sie die Ribo-Sonden-Markierungslösungen vorbereiten und die Markierungsreaktionen zwei Stunden lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius inkubieren. Am Ende der zweistündigen Inkubation fügen Sie je einer Markierungsreaktion ein Mikroliter 20 Mikrogramm pro Mikroliter TRNA und 39 Mikroliter Säulenblockpuffer hinzu.
Bereiten Sie dann die EDEX G 50-Säulen für die Probenaufreinigung vor, indem Sie 50 Mikroliter Blockpuffer zu jeder Säule hinzufügen und drei Minuten lang bei 2000 Umdrehungen pro Minute zentrifugieren. Wiederholen Sie diesen Schritt zwei bis drei Mal, um die Säulen zu equilibrieren. Wenn die Säulen bereit sind, setzen Sie ein neues EEND-Orph-Röhrchen unter die Säule.
Tragen Sie die Probelösung auf die Sedex G 50-Säule auf und zentrifugieren Sie drei Minuten bei 2000 Umdrehungen pro Minute. Um die gereinigten 50 Mikroliter Ribo-Probelösung zu erhalten, bewerten Sie die Qualität und Ausbeute der markierten und gereinigten Ribo-Probe. Sammeln Sie zwei oder drei Gehirnschnitte auf Charge Super Frost Plus Objektträgern, bevor Sie mit der Hybridisierung unter Verwendung eines Kryostaten fortfahren.
Die Dicke des Schnitts sollte 10 bis 12 Mikrometer betragen. Die Objektträger können bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Inkubieren Sie die Schnitte fünf Minuten lang in kalter, frisch hergestellter 3 % Paraformaldehydlösung.
Anschließend spülen Sie die Schnitte zweimal kurz in PBS. Danach dehydrieren Sie die Schnitte durch eine standardmäßige Alkoholreihe mit 70, 95 und 100 % Ethanol, jeweils zwei Minuten in jeder Lösung. Nach der Dehydrierung der Schnitte inkubieren Sie diese 10 Minuten in frisch zubereiteter Azetylierungslösung.
Anschließend spülen Sie die Schnitte dreimal in zweifach SSPE und dehydrieren Sie die Schnitte nach der erneuten Azetylierung erneut durch die standardmäßige Alkoholreihe, wie gerade gezeigt. Beginnen Sie nun die Hybridisierung mit der Ribo-Sonde. Geben Sie eine ausreichende Menge der Hybridisierungslösung auf das Gewebe, bedecken Sie die Objektträger mit Deckgläsern und stellen Sie die Objektträger in einen metallenen Objektträgerhalter.
Den Halter über Nacht in ein Mineralölbad bei 65 Grad Celsius eintauchen. Am folgenden Tag den Objektträgerhalter vorsichtig aus dem Mineralölbad nehmen und kurz mit Chloroform spülen, um überschüssiges Öl von den Objektträgern zu entfernen.
Legen Sie die Objektträger zur Entfernung der Deckgläser fünf bis zehn Minuten lang in eine 2×-SSPE-Lösung. Nach dem Entfernen der Deckgläser überführen Sie die Objektträger in eine frische 2×-SSPE-Lösung und belassen sie dort eine Stunde bei Raumtemperatur. Zu Beginn dieses Inkubationsschritts erwärmen Sie eine Lösung aus 2× SSPE plus 50 % Formamid auf die gleiche Temperatur wie während der Hybridisierung. Führen Sie diesen Schritt am Ende der einstündigen Inkubation durch.
Überführen Sie die Objektträger in die vorgewärmte zweifache SSPE-Maide-Lösung und inkubieren Sie sie 1,5 Stunden lang. Zu Beginn dieses Inkubationsschritts erwärmen Sie eine Lösung mit 0,1-facher SSPE-Konzentration auf dieselbe Temperatur wie im Hybridisierungsschritt. Beenden Sie die Nachhybridisierungswaschungen, indem Sie die Objektträger in die VORGEGEWARME 0,1-fache SSPE-Lösung überführen und 30 Minuten lang inkubieren.
Wiederholen Sie diesen Waschschritt einmal. Die Gehirnschnitte sind nun bereit für die Detektion und Visualisierung der hybridisierten Ribo-Probes. Geben Sie 0,3 % Wasserstoffperoxid zum TNT-Puffer und inkubieren Sie die Objektträger 10 Minuten lang in dieser Lösung. Anschließend waschen Sie die Objektträger dreimal je 10 Minuten mit TNT-Puffer unter Verwendung eines Deco-Stifts.
Zeichnen Sie einen Brunnen um den Bereich mit den Gehirnschnitten. Geben Sie 150 Mikroliter TNB-Puffer auf jeden Objektträger und inkubieren Sie die Schnitte 30 Minuten in dieser Lösung. Achten Sie darauf, dass die Schnitte während dieses Schritts nicht austrocknen.
Anschließend 150 Mikroliter TT-NB-Lösung, die mit Peroxidase konjugiertes anti-DIG-Antikörper enthält, auftragen und die Objektträger zwei Stunden lang in einer feuchten Kammer lagern. Am Ende der zweistündigen Inkubation die Schnitte dreimal für jeweils 10 Minuten mit TNT-Puffer waschen. Jeweils 150 Mikroliter der mit Alexa 594 konjugierten T IDE-Arbeitslösung auf jeden Objektträger auftragen und die Objektträger eine Stunde lang in einer feuchten Kammer lagern.
Nach einer Stunde die Schnitte dreimal für jeweils 10 Minuten in TNT-Puffer waschen. Jedes Mal die Schnitte 10 bis 30 Minuten in einer 0,3 %igen Wasserstoffperoxidlösung in TNT-Puffer inkubieren. Die Inkubationszeit in der Wasserstoffperoxidlösung hängt von der mRNA-Abundanz ab und sollte vor dem D-FISH-Verfahren getestet werden.
Anschließend die Schnitte dreimal für jeweils 10 Minuten in TNT-Puffer wässern. Pro Objektträger 150 Mikroliter TMB-Puffer auftragen und die Objektträger 30 Minuten in einer feuchten Kammer inkubieren. Überschüssige TMB-Lösung durch Neigen der Objektträger entfernen.
Fügen Sie 150 Mikroliter TMB-Lösung mit peroxidasekonjugiertem Anin-Antikörper hinzu und lagern Sie die Objektträger zwei Stunden lang in einer feuchten Kammer. Anschließend waschen Sie die Schnitte dreimal für jeweils 10 Minuten in TNT-Puffer. Geben Sie jedes Mal 150 Mikroliter einer Alexa-488-konjugierten Milben-Arbeitslösung auf die Objektträger und inkubieren Sie die Schnitte eine Stunde lang.
Anschließend die Schnitte dreimal für jeweils 10 Minuten in TNT-Puffer waschen. Da nun beide Ribo-Sonden durch Antikörper markiert sind, die Schnitte für zwei Minuten in 150 Mikrolitern Wirtslösung inkubieren. Danach die Schnitte dreimal für jeweils fünf Minuten in TNT-Puffer waschen, ein fluoreszenzkompatibles Eindeckmedium wie Vector Shield oder Prolonged Antifa auf die Schnitte geben, mit einem Deckglas abdecken und unter dem Fluoreszenzmikroskop untersuchen.
Diese repräsentativen Fotomikrografien stammen aus einem D-Fisch-Experiment mit Gehirnschnitten von Zebrafinken, speziell aus der NCM-Region, dem Singvogel-Analogon des auditorischen Kortex von Säugetieren. Die Gehirnschnitte wurden mit zwei Sonden hybridisiert: einer biotinylierten Ribo-Sonde, die gegen Parvalbumin gerichtet ist – ein Marker für eine Untergruppe hemmender Neuronen – und einer DIG-markierten Ribo-Sonde, die gegen das aktivitätsabhängige Gen Zinc gerichtet ist, ein zuverlässiger Marker für durch Gesang aktivierte Neuronen. Eine Überlagerung der beiden Bilder zeigt eine Population hemmender Neuronen, die durch akustische Erfahrung aktiviert werden.
Pfeilspitzen zeigen Zellen, die ausschließlich mit der Ribo-Sonde für par markiert sind. Albumin-Pfeile zeigen Zellen, die ausschließlich mit der RIBA-Sonde für Zink markiert sind. Vertreterneurone, die beide Transkripte von Interesse koexprimieren, sind mit einem Sternchen gekennzeichnet. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, den Arbeitsplatz sauber zu halten und lösungsmittelfreie Lösungen, Kunststoffe und Glasgeräte zu verwenden.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man gleichzeitig zwei MA-Arten mit Einzelzellauflösung in frisch gefrorenen Gehirnschnitten nachweisen kann, um die Gen-Koregulation im Gehirn von Wirbeltieren zu untersuchen. Vielen Dank für das Anschauen des Videos. Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
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Übersicht
Dieses Protokoll beinhaltet ein nicht-radioaktives Verfahren der in-situ-Hybridisierung, das die gleichzeitige Identifizierung von zwei Transkript-Spezies mit einzellulärer Auflösung in dünnen Schnitten des Wirbeltiergehirns ermöglicht. Diese Methode kann helfen, Fragen zur anatomischen, funktionellen, molekularen und neurochemischen Organisation von Gehirnschaltkreisen zu beantworten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Genexpressionsanalyse
- In-situ-Hybridisierungstechniken
Hintergrund
- Diese Methode ermöglicht den Nachweis mehrerer Transkripte in einem einzigen Experiment.
- Sie kann auf verschiedene neuronale Gewebe angewendet werden, einschließlich solcher von Nagetieren.
- Das Verständnis der Genexpression in Neuronen ist entscheidend für die Neurowissenschaftsforschung.
- Die Technik liefert Einblicke in die molekulare Organisation von Hirnschaltkreisen.
Zweck der Studie
- Nachweis von zwei mRNA-Transkripten gleichzeitig in Gehirnschnitten.
- Untersuchung der Genregulation in spezifischen neuronalen Populationen.
- Verbesserung des Verständnisses der funktionellen Organisation des Gehirns.
Verwendete Methoden
- Nicht-radiologisches In-situ-Hybridisierungsverfahren.
- Herstellung von frisch gefrorenen Gehirnschnitten.
- Gleichzeitige Hybridverdauung von Transkripten.
- Sichtbarmachung von Transkripten mit Einzelzellauflösung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Identifizierung von zwei Transkriptvarianten in Gehirnschnitten.
- Nachweis der Anwendbarkeit der Methode auf verschiedene neuronale Gewebe.
- Aufschluss über die Genexpressionsmuster in Neuronen gewonnen.
- Beitrag zum Verständnis der molekularen Grundlagen der Gehirnfunktion.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll eignet sich zur Untersuchung der Genexpression im Gehirn.
- Es kann in verschiedenen Forschungskontexten der Neurowissenschaften angewendet werden.
- Diese Methode verbessert die Möglichkeit, komplexe neuronale Schaltkreise zu untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese dFISH-Methode ermöglicht den simultanen Nachweis von zwei mRNA-Transkripten mit Einzelzellauflösung in frisch gefrorenen Hirnschnitten und unterstützt die mechanistische Entwicklungsrisikominderung bei der Target-Validierung, indem sie Muster der Gen-Koregulation in definierten neuronalen Populationen aufzeigt. Der Ansatz liefert eine Vorhersagesicherheit für nachgeschaltete Assays, indem er räumliche und funktionelle Beziehungen zwischen Transkripten in sensorischen Schaltkreisen etabliert und damit hypothesengetriebene Screening-Strategien informiert. Die Anpassungsfähigkeit über Wirbeltierarten und nicht-neuronale Gewebe hinweg erhöht die translationale Kontinuität und die Wiederverwendbarkeit der Plattform in Entdeckungsworkflows.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem die Ko-Expression von Markergenen (z. B. Paralbumin und Zink) in inhibitorischen Neuronen visualisiert wird, die durch sensorische Erfahrungen aktiviert wurden.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die biologische Risikominimierung durch direkte Beobachtung räumlicher Transkript-Beziehungen in frisch eingefrorenem Gewebe und verringert damit die Abhängigkeit von indirekten Schlussfolgerungen.
- Strategischer Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem Einzelzell-Auflösungsdaten zur neurochemischen und aktivitätsabhängigen Genexpression in krankheitsrelevanten Schaltkreisen bereitgestellt werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Arbeitsabläufe vor, indem die Spezifität der Sonde und die Hybridisierungseffizienz in Gehirnschnitten bestätigt werden.
- Operationaler Wert: Trägt zur Standardisierung und Reproduzierbarkeit des Assays bei, indem optimierte Schritte zur Markierung, Reinigung der Sonde und Hybridisierung unter Verwendung von Sedex G 50-Säulen und kontrollierten Pufferbedingungen angewandt werden.
- Strategischer Wert: Unterstreicht die Eignung für Hochdurchsatz-Screenings und die Wiederverwendbarkeit der Plattform, indem die Anwendbarkeit an Mäusen, Ratten, Singvögeln gezeigt wird und eine erwartete Erweiterung auf andere Wirbeltierarten sowie nicht-neurale Gewebe abgeleitet werden kann.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erläutert die Krankheitsrelevanz durch die Untersuchung der anatomischen Organisation und neurochemischen Eigenschaften zentraler sensorischer Schaltkreise und verbindet die koordinierte Genregulation mit funktionellen Ergebnissen.
- Operativer Wert: Beschreibt den kontinuierlichen Übergang von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem eine Längsschnittanalyse der Auswirkungen sensorischer Erfahrungen auf die Genexpression im gleichen Gewebetyp ermöglicht wird.
- Strategischer Wert: Konzentriert sich auf den prädiktiven Entwicklungsrisikoverminderungswert, indem mechanistische Einblicke vermittelt werden, wie sensorische Reize transkriptionelle Programme in definierten neuronalen Subtypen verändern.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Entdeckung bis zur Wirkstoffkandidaten-Identifizierung und unterstützt die Hypothesenprüfung sowie die Aufklärung von Wegen bei neurobiologischen Zielstrukturen vor der Verbindungsscreening-Phase.
- Entdeckungsbiologie: Erläutert, wie die Methode die Hypothesenprüfung unterstützt, indem sie ko-regulierte Transkripte (z. B. aktivitätsabhängiges Zink und Markermolekül des hemmenden Neurons Parvalbumin) als Reaktion auf sensorische Erfahrungen nachweist.
- Screening: Beschreibt die Bereitschaft des Assays anhand reproduzierbarer Schritte zur Sondenreinigung und -hybridisierung, die quantitative fluoreszierende Signale mit Einzelzellauflösung liefern.
- Analytik: Betont Messgrößen wie Fluoreszenzsignalintensität und Muster der räumlichen Überlappung (z. B. mit Sternchen markierte co-exprimierende Zellen), die einen Vergleich zwischen experimentellen Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Methode mit der präklinischen Kontinuität, indem ihre Anwendbarkeit in frisch gefrorenen Gehirnschnitten mehrerer Arten gezeigt wird und somit die Validierung der Zielstrukturnbindung über Arten hinweg unterstützt wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt die Methode als wiederverwendbare Fähigkeit dar und nicht als Einmaltechnik, da sie an verschiedene neuronale und nicht-neuronale Gewebe angepasst werden kann und ein standardisierter, säulenbasierter Workflow zur Sondenreinigung genutzt wird.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit, Zielvalidierung und Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeiten bei Gen-Koregulationsstudien.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit durch säulengestützte Probenaufreinigung und definierte Hybridisierungs- und Waschpuffer.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen, Kapitalwirksamkeit und geringeres biologisches Risiko in späteren Phasen durch frühzeitige Bestätigung von Ziel-Koexpressionsmustern im Entdeckungsprozess.
- Portfolio-Implikation: Risikoadjustierte Priorisierungs- und Weiterentwicklungsentscheidungen basierend auf räumlich aufgelösten Transkriptdaten in krankheitsrelevanten Hirnschaltkreisen.
Durchführungsüberlegungen
- Notwendige wissenschaftliche Fachkenntnisse in molekularer Histologie, Sondenmarkierung und Fluoreszenzmikroskopie.
- Erforderliche Instrumentierung und analytische Infrastruktur, einschließlich Kryostat, Zentrifuge, Mineralölbad und Fluoreszenzmikroskop mit geeigneten Filterkombinationen.
- Anforderungen an die Standardisierung zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen hinsichtlich der Sondenvorbereitung, Hybridisierungsbedingungen und Signalnachweis-Schwellenwerte.
- Überlegungen zur Anpassung an verschiedene Modellsysteme, einschließlich Anpassungen der Gewebedicke, Permeabilisierung und Hybridisierungszeit je nach Spezies und Zielmolekülhäufigkeit.
- Praktische Einschränkungen, die durch die Quellen belegt sind: Die Inkubationszeit mit Wasserstoffperoxid muss vor der DISH-Analyse empirisch basierend auf der mRNA-Häufigkeit getestet werden, um eine Über- oder Unterdetektion zu vermeiden.
