Name: Doppel-Fluoreszenz- In situ Hybridisierung in Fresh Hirnschnitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Lernen Sie die doppelte Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung zur gleichzeitigen Detektion zweier mRNA-Transkripte in frischen Hirnschnitten mit Einzelzellauflösung. Diese nicht-radioaktive Methode ermöglicht Studien zur Genexpression in neuronalen Populationen.

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Arbeit unterstützt durch Zuschüsse der NIH / NIDCD und der Schmitt-Stiftung zur RP.

Dieses Protokoll wurde entwickelt und basiert auf Standard-radioaktive und nicht-radioaktiven in-situ-Hybridisierung Methoden, die zuvor von uns und anderen entwickelt wurde, um ein oder zwei Transkript Arten in Hirngewebe 1-7 erkennen verfeinert. Die unten beschriebenen Protokoll hat eine Gesamtlänge von 2 oder 3 Tage, je nach der Anzahl der prozeduralen Unterbrechungen durch den Endbenutzer gewählt. Alle Schritte nachfolgend beschrieben werden, um bei Raumtemperatur durchgeführt werden, mit Ausnahme der Ribosonde Hybridisierung und post-Hybridisierung wäscht. Die Lösungen und Puffer für alle Schritte in diesem Verfahren Beteiligten erforderlich finden Sie am Ende dieses Protokoll gefunden werden. 1. Tissue Vorbereitung und Schnitte <ol><li> Enthaupten und extrahieren Thema Gehirn schnell ab, und legen Sie sie in eine Kunststoff-Formenbau von ausreichender Größe. </li><li> Cover Gehirn mit Tissue-Tek Einbettmedium und schnell statt der Kunststoff-Form in einem dry-ice/alcohol Bad für schnelles Einfrieren. Gefrorenes Gewebe kann bei -80 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. </li><li> Mit einem Kryostaten, sammeln 2 oder 3 Hirnschnitten pro Folie auf Rechnung Superfrost Plus Objektträger. Die Dicke der Abschnitte sollten 10-12 um betragen. Dias können bei -80 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. </li></ol> 2. Vorbereitung der Sephadex G50 Säulen für Probe Purification "Sephadex-Säulen aus kommerziellen Quellen erworben werden kann, jedoch bieten wir Ihnen nachfolgend eine kostengünstige Alternative für die Erzeugung von Spalten, die für die Sonde Reinigung benötigt werden. <ol><li> Hydrate ausreichende Menge an Sephadex G50-Pulver mit RNase-freiem, DEPC-behandeltem Wasser (z. B. 2 g Pulver in 100 ml DEPC-behandeltem Wasser), Mix-Lösung kurz und bei Raumtemperatur lagern, um Niederschlag über Sephadex G50. </li><li> Überstand entfernen (obere Schicht des Wassers) nach Sephadex G50 Niederschlag. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang über 3 bis 5 mal. </li><li> Nach dem letzten Waschen, wieder aussetzen Sephadex G50-Lösung in TE-Puffer (1:1), und lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Legen Sie autoklaviert Glaswolle in eine sterile 1 ml-Spritze und komprimiert sie mit dem Stößel zu einer kompakten Schicht an der Unterseite machen, und dann legen Sie die Spritze in eine 15 ml Falcon-Röhrchen. </li><li> Gut mischen die Lösung von Sephadex G50 in TE. Füllen Sie die Spritze / Spalte mit dieser Lösung. </li><li> Zentrifugieren Sie die Spalte für 30 sec bei 1000 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Spalte ist fast vollständig mit Sephadex G50 Perlen gefüllt. </li><li> Apply 200 pl Säule Waschpuffer auf die Säule und zentrifugieren Sie für 2 min bei 1000 Umdrehungen pro Minute. Durchfluss verwerfen. </li><li> Apply 200 pl Säule Blocking-Puffer in die Säule und spinnen sie für 2 min bei 1000 Umdrehungen pro Minute. Wiederholen Sie diesen Schritt 4-5 mal in die Spalte Gleichgewicht zu bringen. Spalten können bei 4 ° C gelagert werden, bis zu verwenden, wenn mit Parafilm abgedichtet. </li></ol> 3. Beschriftung und Reinigung von Ribosonden Im Folgenden ausführlich die Erzeugung und Reinigung eines einzelnen Ribosonde. Für dFISH, wird die Vorbereitung der einzelnen Sonde beinhalten die gleiche Methode, außer dass einer der Sonden mit Digoxigenin (DIG)-markierten UTP, während die anderen werden mit Biotin-markierten UTP markiert. <ol><li> Bereiten Sie eine konzentrierte (&gt; 150 ng / ul) und gereinigtes linearisierten cDNA-Lösung von Interesse, um entweder (Kontrolle) oder antisense Ribosonden generieren. </li><li> In einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, fügen 0,5-1 pg gereinigte cDNA-Template, 2 ul 5X Sondenmarkierung Puffer, 1 ul 10x DIG (oder Biotin)-Labeling Mix, 0,5 ul RNasin und 1 ul der entsprechenden RNA-Polymerase und bringt die endgültige Volumen der Lösung auf 10 ul mit RNase-freiem (DEPC-behandelt) Wasser. </li><li> Inkubieren Sie die Lösung in einem Wasserbad bei 37 ° C für 2 Stunden. </li><li> Add 1 ul tRNA (Lager 20 ug / ul) und 39 ul der Spalte Blocking-Puffer in der Lösung. </li><li> Bereiten Sie die Sephadex G50-Säule für die Sonde Reinigung. Zu diesem Zweck werden 50 ul Blocking-Puffer in die Säule und drehen Sie es für 10 sec bei 1000 Umdrehungen pro Minute. Wiederholen Sie diesen Schritt 2-3 mal auf die Säule (also die vollen 50 ul auf die Säule sind nach Zyklus der Zentrifugation gewonnen) ausgleichen. </li><li> Übernehmen Sie die Sonde Lösung der Sephadex G50-Säule, Position ein neues Mikrozentrifugenröhrchen am unteren Rand der Säule, und drehen Sie es für 3 min bei 1000 rpm, um das gereinigte 50 ul Ribosonde Lösung zu erhalten. </li><li> Beurteilen Sie die Qualität und Ausbeute der markierten Ribosonde entweder mit einem Standard-Formaldehyd-Agarose-RNA-Gel oder ein Spektralphotometer. </li></ol> 4. Post-Fixierung, Acetylierung und Hybridisierung <ol><li> Entfernen Sie Ausschnitte aus dem -80 ° C Gefrierschrank und ermöglichen eine Raumtemperatur ins Gleichgewicht. Anschließend inkubieren Abschnitte in einem kalten, frisch zubereitete 3% Paraformaldehyd-Lösung für 5 min. </li><li> Kurz spülen Abschnitte in phosphate Kochsalzlösung (PBS) zweimal. </li><li> Entwässern Schnitte durch ein Standard-Alkohol-Reihe (70, 95 und 100%; je 2 min), und lassen Sie sie an der Luft trocknen. </li><li> Inkubieren Abschnitte in einer Acetylierung Lösung für 10 min. </li><li> Spülen Sie den Abschnitten 3 mal in 2X SSPE. </li><li> Entwässern Abschnitte noch einmal durch die Standard-Alkohol-Reihe oben beschrieben, und es ihnen an der Luft trocknen. </li><li> Bereiten Sie ein angemessenes Volumen der Hybridisierungslösung und fügen Sie beide Ribosonden die Lösung (Sonde Konzentration: 1 ng / ul für jede Sonde). Das Gesamtvolumen der Hybridisierungslösung wird auf der Grundlage der Anzahl der Abschnitte, um hybridisiert (16 ul Hybridisierungslösung pro Abschnitt) bestimmt. </li><li> Bewerben ausreichendes Volumen der Hybridisierungslösung, um Gewebe und Deckglas gleitet sicher, dass keine Luftblasen Overlay das Gewebe. </li><li> Die Objektträger in einem Metall Diahalter. Tauchen Halter in ein Mineral Ölbad bei 65 ° C über Nacht eingestellt. Stellen Sie sicher, dass Deckgläser sind nach oben gerichtet (dh der lateralen Seite des Diahalter sollten in Kontakt mit dem Boden des Mineralöl-Container werden). </li></ol> 5. Post-Hybridisierung Wäscht <ol><li> Am folgenden Tag, entfernen Sie vorsichtig den Diahalter aus der Mineralöl-Bad und kurz ausspülen in Chloroform, um überschüssiges Öl von den Folien zu entfernen. </li><li> Die Objektträger in einem 2X SSPE-Lösung für 5-10 min. Deckgläser sollten von Dias, während in Lösung zu lösen. </li><li> Die Objektträger in eine neue 2X SSPE-Lösung, und halten Sie sie für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Transfer-Abschnitte in einer Lösung mit 2X SSPE plus 50% Formamid. Die Temperatur dieser Lösung sollte mit der Temperatur in der Nacht Hybridisierung Verfahren verwendet. Halten Sie Folien in dieser Lösung für 1,5 Stunden. </li><li> Transfer-Abschnitte, um eine 0,1 × SSPE-Lösung auf die gleiche Temperatur der Hybridisierung vorgewärmt. Inkubieren Abschnitte in dieser Lösung für 30 min. Wiederholen Sie diesen Schritt für weitere 30 min. </li></ol> 6. Erkennung und Visualisierung von Ribosonden <ol><li> Transfer-Folien TNT-Puffer, dem 0,3% Wasserstoffperoxid wurde hinzugefügt, für 10 min. </li><li> Wash Abschnitte in TNT-Puffer, 3-mal (10 Min.). </li><li> Mit einem DAKO Pen zeichnen ein gut in die Umgebung mit den Hirnschnitten. Wichtig ist, ist Vorsicht geboten, um sicherzustellen, dass Teile nicht trocken werden. </li><li> Apply 150 ul TNB-Puffer zu jedem Dia, und inkubieren Abschnitte in dieser Lösung für 30 min in einer feuchten Kammer. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges TNB Lösung durch Kippen Dias. </li><li> Apply 150 ul TNB Lösung mit Peroxidase-konjugierten anti-DIG-Antikörper, und speichern Sie gleitet in einer feuchten Kammer für 2 Stunden. Antikörper-Konzentration sollte individuell für jedes Transkript von Interesse vor der Durchführung dFISH bestimmt werden. </li><li> Wash Abschnitte in TNT-Puffer, 3-mal, jeweils 10 Minuten. </li><li> Apply 150 ul Alexa 594-konjugierten Tyramid funktionierende Lösung zu jeder Folie, und speichern sie in einer feuchten Kammer für 1 Stunde. Diese Lösung muss nach den Anweisungen des Herstellers zubereitet werden. </li><li> Wash Abschnitte in TNT-Puffer, 3-mal, jeweils 10 Minuten. </li><li> 30 min - inkubieren Abschnitte in TNT-Puffer, dem 0,3% Wasserstoffperoxid für 10 aufgenommen worden. </li><li> Wash Abschnitte in TNT-Puffer, 3-mal, jeweils 10 Minuten. </li><li> Apply 150 ul TNB-Puffer pro Objektträger, und bewahren Sie sie in einer feuchten Kammer für 30 min. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges TNB Lösung durch Kippen Dias. </li><li> Add 150 ul TNB Lösung mit Peroxidase-konjugierten anti-Biotin-Antikörper, und speichern Sie gleitet in einer feuchten Kammer für 2 Stunden. </li><li> Wash Abschnitte in TNT-Puffer, 3-mal, jeweils 10 Minuten. </li><li> Apply 150 pl einer Alexa 488-konjugierten Tyramid funktionierende Lösung, um die Folien und inkubieren Abschnitte für 1 Stunde. Diese Lösung sollte nach den Empfehlungen des Herstellers vorbereitet werden. </li><li> Wash Abschnitte in TNT-Puffer, 3-mal, jeweils 10 Minuten. </li><li> Add 150 ul Hoechst-Lösung (1:1000 in TNT-Puffer) zu den Abschnitten und halten sie in der feuchten Kammer für 2 min. </li><li> Waschen Sie die Abschnitte in TNT-Puffer, 3-mal, jeweils 5 min. </li><li> Deckglas Abschnitte mit einem Fluoreszenz-kompatible Mounting Medium (zB Vectashield oder verlängern Antifade). </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2102/2102fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Wir zeigen hier Vertreter dFISH Ergebnisse in der Zebrafinken Gehirn erhalten. Gezeigt werden Aufnahmen aus dem caudomedial nidopallium (NCM), der Singvogel Analogon des auditorischen Kortex von Säugetieren erhalten. Gehirn-Schnitte wurden mit einem biotinylierten Ribosonde gegen Parvalbumin (A), ein Marker für eine Subpopulation der hemmenden Neuronen gerichtet hybridisiert und einer DIG-markierten RiboSonde gegen die Aktivitäts-abhängigen Gen Zenk (B), ein zuverlässiger Marker für Song-driven Neuronen gerichtet. C) Überlagerung von (A) und (B) zeigt eine Bevölkerung von hemmenden Neuronen, die durch Hörerlebnis aktiviert werden. Pfeile und Pfeilspitzen zeigen Zellen ausschließlich mit jeder der beiden Ribosonden beschriftet und Sternchen zeigen repräsentative Neuronen co-exprimierenden beide Transkripte von Interesse. Balken = 25 um.

<ol><li>Jin, L., Lloyd, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Lab+Anal%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: methods and applications.</a> J Clin Lab Anal. 11, 2-9 (1997).</li>
<li>Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization.</a> Clin Lab Med. 10, 215-236 (1990).</li>
<li>Komminoth, P., Werner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+and+signal+amplification%3A+approaches+to+increase+the+sensitivity+of+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22+Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Target and signal amplification: approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization.</a> Histochem Cell Biol. 108, 325-3233 (1997).</li>
<li>Kessler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+digoxigenin%3Aanti-digoxigenin+%28DIG%29+technology--a+survey+on+the+concept+and+realization+of+a+novel+bioanalytical+indicator+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Probes%22%5BJournal%5D)">The digoxigenin:anti-digoxigenin (DIG) technology--a survey on the concept and realization of a novel bioanalytical indicator system.</a> Mol Cell Probes. 5, 161-205 (1991).</li>
<li>Panoskaltsis-Mortari, A., Bucy, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+with+digoxigenin-labeled+RNA+probes%3A+facts+and+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization with digoxigenin-labeled RNA probes: facts and artifacts.</a> Biotechniques. 18, 300-307 (1995).</li>
<li>Qian, X., Lloyd, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+signal+amplification+methods+for+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Recent developments in signal amplification methods for in situ hybridization.</a> Diagn Mol Pathol. 12, 1-13 (2003).</li>
<li>Mello, C. V., Jarvis, E. D., Denisenko, N., Rivas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+song-regulated+genes+in+the+brain+of+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of song-regulated genes in the brain of songbirds.</a> Methods Mol Biol. 85, 205-217 (1997).</li>
<li>Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+participate+in+the+brain%27s+response+to+birdsong+auditory+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons participate in the brain's response to birdsong auditory stimulation.</a> Eur J Neurosci. 20, 1318-1330 (2004).</li>
<li>Velho, T. A., Pinaud, R., Rodrigues, P. V., Mello, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-induction+of+activity-dependent+genes+in+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Co-induction of activity-dependent genes in songbirds.</a> Eur J Neurosci. 22, 1667-1678 (2005).</li>
<li>Tremere, L. A., Jeong, J. K., Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol+shapes+auditory+processing+in+the+adult+brain+by+regulating+inhibitory+transmission+and+plasticity-associated+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Estradiol shapes auditory processing in the adult brain by regulating inhibitory transmission and plasticity-associated gene expression.</a> J Neurosci. 29, 5949-5963 (2009).</li>
<li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li>
<li>Pinaud, R., Jeong, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplex+fluorescence+in+situ+hybridization+in+the+study+of+gene+co-regulation+in+the+vertebrate+brain.+Methods+Mol+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Duplex fluorescence in situ hybridization in the study of gene co-regulation in the vertebrate brain. Methods Mol Biol.</a> 611, 115-129 (2010).</li>
</ol>

Wir haben dieses Protokoll verwendet, um zu untersuchen, wie Gehirn der Wirbeltiere neurochemisch und funktional organisiert ist, und um festzustellen, wie verhaltensgestörte relevanten sensorischen Reizen Auswirkungen der genomischen Maschinerie der Nervenzellen im erwachsenen Gehirn 8-10. Wir haben erfolgreich diese Methode in Hirngewebe von Mäusen, Ratten und Singvögel, aber erwarten, dass dieses Protokoll wird einfach an Hirnschnitten aus einem Array von Wirbeltierarten und, vielleicht, nicht-neuralen Gew...

Lösungen <ol><li> Column Waschpuffer: 10 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,05 mM EDTA, 50 ug / ul tRNA, 0,1% SDS in 50 ml DEPC-behandeltem Wasser. </li><li> Column Blockierungspuffer: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA in 50 ml DEPC-behandeltem Wasser. </li><li> TNT-Puffer: 60 ml von 1 M Tris-HCl, 18 ml 5 M NaCl und 1,8 ml Triton X-100 in 600 ml DEPC-behandeltem Wasser. </li><li> TNB Puffer: 100 mM Tris-HCl, 8,3 ug / ul BSA, 0,15 M NaCl und 3% Triton X-100 in DEPC-behandeltem Wasser. </li><li> TE-Puffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 plus 1 mM EDTA, pH 7,5. </li><li> Acetylierung Lösung: 2,7 ml Triethanolamin plus 0,5 ml Acetanhydrid in 200 ml DEPC-behandeltem Wasser. </li><li> Hybridisierungslösung: 50% Formamid, 2X SSPE, 2 ug / ul tRNA, 1 ug / ul BSA und 1 ug / ul poly A in DEPC-behandeltem Wasser. Es braucht 16 l pro Abschnitt. </li></ol>

doppel-fluoreszenz- in situ hybridisierung in fresh hirnschnitten

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Hier beschreiben wir eine modifizierte Version des Doppel-Fluoreszenz-<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung (dFISH)-Methode für Nachweis von zwei mRNAs von Interesse in Frischplasma Hirnschnitten optimiert. Unsere Gruppe hat erfolgreich dieser Ansatz verwendet, um Gen-Co-Regulierung zu studieren. Genauer gesagt, haben wir diese dFISH Methode verwendet, um die anatomische Organisation, neurochemischen Eigenschaften und die Auswirkungen der sinnlichen Erfahrung in zentralen sensorischen Schaltungen zu erkunden, um einzelne Zelle Auflösung. Dieses Protokoll wurde im Hirngewebe von Mäusen, Ratten und Singvögel validiert wird aber erwartet, dass sie leicht an andere Wirbeltierarten, sowie zu einer Reihe von nicht-neuronalen Gewebe. In diesem Film stellen wir eine detaillierte Demonstration der wichtigsten Schritte dieses Verfahrens.

Dieses Protokoll umfasst eine nicht-radioaktive<em&gt; In-situ</em&gt; Hybridisierungsverfahren, dass die gleichzeitige Identifizierung von zwei Transkript Spezies ermöglicht, bei einer einzigen Zelle Auflösung, in dünne Schnitte von Gehirn der Wirbeltiere.

Doppel-Fluoreszenz- In situ Hybridisierung in Fresh Hirnschnitten

Hier beschreiben wir eine modifizierte Version einer doppelten Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsmethode (dFISH), die für den Nachweis von zwei interessierenden mRNAs in frischem ...

Hallo, ich bin JA, wissenschaftlicher Mitarbeiter im AL-Helfer-Labor an der Universität von Rochester. Wir zeigen Ihnen das Verfahren der hybriden Verdauung in frisch gefrorenen Gehirnschnitten, um zwei mRNA-Transkripte gleichzeitig mit Einzelzellauflösung nachzuweisen. Diese Methode kann dabei helfen, offene Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, beispielsweise im Zusammenhang mit der anatomischen, funktionellen, molekularen und neurochemischen Organisation einer neuronalen Schaltung im Gehirn.Obwohl diese Methode Einblicke in die Genkoagulation in Neuronen des AV-Gehirns liefern kann, ist sie auch auf andere Systeme wie Nagetiere sowie eine Vielzahl neuraler Gewebe anwendbar. Um dieses Verfahren zu beginnen, hydratisieren Sie eine ausreichende Menge SDX G 50-Pulver mit RNAs durch Wasser.Mischen Sie die Lösung kurz und lagern Sie sie bei Raumtemperatur für zwei bis fünf Minuten. Dieser Schritt trennt die SDX-Kügelchen von der in kommerziellem Sedex-Pulver enthaltenen Dextrose nach der Sedex G 50-Fällung. Entfernen Sie das Sennet und wiederholen Sie den Vorgang drei bis fünfmal; nach der letzten Wäsche resuspendieren Sie die SX G 50-Lösung im Verhältnis 1:1 (Puff

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Hier beschreiben wir eine schnelle und einfache Methode, um Bild fluoreszenzmarkierten Zellen in semi-dicken Hirnschnitten. Durch die Fixierung, Schneiden und optisch Clearing Hirngewebe beschreiben wir, wie Standard-epifluoreszenten oder konfokale Bildgebung verwendet werden, um einzelne Zellen und neuronalen Netzwerken im intakten Nervengewebe zu visualisieren.

Eine schnelle Annäherung an High-Resolution Fluoreszenz-Imaging in Semi-Thick Hirnschnitten

Quelle: Jolly, S., et.al. Kombination von Doppelfluoreszenz-In-situ-Hybridisierung mit Immunmarkierung zum Nachweis der Expression von drei Genen in Hirnschnitten von Mäusen. J. Vis. Exp. (2016). Dieses Video zeigt die Verwendung von Doppelfluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, um die Expression von zwei RNA-Zielen in Hirnschnitten von Mäusen sichtbar zu machen. Das Protokoll umfasst den sequentiellen Nachweis von RNA mit Sonden, die mit Fluoresceinisothiocyanat und Digoxigenin markiert sind,...

 Durchführung einer Doppelfluoreszenz-In-situ-Hybridisierung zum Nachweis der Genexpression in Gehirnschnitten von Mäusen

Quelle: Baleriola, J., et. al., Nachweis axonal lokalisierter mRNAs in Hirnschnitten mittels hochauflösender In-situ-Hybridisierung.  J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video zeigt den Nachweis von mRNA in cholinergen Axonen in fixierten Maus-Hippocampus-Schnitten mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung und Antikörperfärbung. Die Fluoreszenzmikroskopie zeigt die räumliche Lokalisierung von sondenmarkierten mRNAs und Cholinacetyltransferase in cholinergen Neuronen.

Immunfärbung von Neuronen in Hirnschnitten von Mäusen nach Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung

RNA in situ Hybridisierung (ISH) ermöglicht die Visualisierung von RNAs in Zellen und Geweben. Hier zeigen wir, wie die Kombination von RNAscope ISH mit immunhistochemischer oder histologischer Farbstoffe erfolgreich eingesetzt werden kann, um mRNAs, die an Axonen lokalisiert sind, in Schnitten des Gehirns von Mäusen und Menschen zu detektieren.

Nachweis von Axonally lokalisierten mRNAs in Gehirnschnitten mittels hochauflösender<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridization

Dieses Protokoll beschreibt im Detail, wie verschiedene Regionen im Zentralnervensystem C57BL/6 mittels in utero-Elektroporation spezifisch transfiziert werden. In diesem Protokoll sind detaillierte Anweisungen für Transfektionen von Regionen enthalten, die sich zum Kortex, Hippocampus, Thalamus, Hypothalamus, Nucleus lateralis septum lateralis und Striatum entwickeln.

Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus, Lateral Septal Nucleus- und Striatum spezifische<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation in der C57BL / 6-Maus,

Die Lokalisierung der Genexpression auf bestimmte Zelltypen kann aufgrund des Mangels an spezifischen Antikörpern eine Herausforderung darstellen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur gleichzeitigen dreifachen Detektion der Genexpression durch Kombination von Doppelfluoreszenz-RNA-in-situ-Hybridisierung mit Immunfärbung.

Die Kombination von Doppel-Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Die Hybridisierung mit Immunmarkierung für Nachweis der Expression von drei Gene in Mäusehirnschnitten

Die Free-Floating-Technik ermöglicht es Forschern, histologisch basierte Färbungen einschließlich Immunhistochemie an festen Gewebeschnitten durchzuführen, um biologische Strukturen, Zelltypen sowie Proteinexpression und -lokalisation sichtbar zu machen. Dies ist eine effiziente und zuverlässige histochemische Technik, die für die Untersuchung einer Vielzahl von Geweben wie Gehirn, Herz und Leber nützlich sein kann.

Histologische Färbungen mit frei schwebenden Gewebeschnitten

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Kombination von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und Fluoreszenz-Immunhistochemie (IHC) sowohl in frisch gefrorenen als auch in fixierten Maus-Hirnschnitten, mit dem Ziel, Multilabel-FISH und Fluoreszenz-IHC-Signal zu erreichen. IHC zielte auf zytoplasmatische und membrangebundene Proteine ab.

Kombination von Multiplex-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung mit fluoreszierender Immunhistochemie an frischen, gefrorenen oder fixierten Mäusehirnschnitten

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll für die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie nach der Einbettung von Epon unter Verwendung eines fluoreszierenden Proteins namens mScarlet. Diese Methode kann die Fluoreszenz und die Ultrastruktur gleichzeitig aufrechterhalten. Diese Technik ist für eine Vielzahl biologischer Anwendungen geeignet.

Epon Post Embedding Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie

Expansion-Assisted Itercence In Situ Hybridization (EASI-FISH) ist eine robuste Technik, die Expansionsmikroskopie mit Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) kombiniert, um die Expression mehrerer Gene in dickem Gewebe nachzuweisen. Dieses Protokoll beschreibt die jüngsten Fortschritte in der Methode und ihre Anpassung an die Markierung des intakten Drosophila-Zentralnervensystems.

Multiplex-Detektion der Genexpression im intakten Drosophila-Gehirn mittels expansionsunterstützter iterativer Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung

Diese Studie stellt ein vereinfachtes Protokoll für die Gewebeaufbereitung vor, das Enthauptung, Fixierung, Kryosektion, Fluoreszenzfärbung, Immunfärbung und Bildgebung umfasst und auf konfokale und Multiphotonen-Bildgebung erweitert werden kann. Die Methode behält eine Wirksamkeit bei, die mit komplexen Dissektionen vergleichbar ist, ohne dass fortgeschrittene motorische Fähigkeiten erforderlich sind. Die quantitative Bildanalyse bietet ein umfangreiches Untersuchungspotenzial.

Direkte Kryosektion von Drosophila-Köpfen zur verbesserten Fluoreszenzfärbung und Immunfärbung des Gehirns

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