Name: Die Organotypische hippokampalen Slice-Kultur-Modell für die Prüfung neuronaler Schädigung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-28T17:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Erfahren Sie die Erstellung von organotypischen hippocampalen Schnittkulturen zur Untersuchung neuronaler Schädigung. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Zelltod in CA1, CA3 und Dentatus.

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1. Vorbereitung Bevor Sie beginnen, montieren die erforderliche chirurgische Instrumente, Präparation und Kultur Medien und 7 Tage alten Ratte oder Maus Welpen. Das Protokoll ist das gleiche für Maus und Ratte Vorbereitungen. (I) Material und Ausrüstung <ul><li> Operating Schere (gestreckte Länge 6 ", cat # RS6818, Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li> Micro Präparierschere, (Länge 4 '", cat # RS5910. Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li> Carbon Steel Dumont Pinzetten (cat # RS-5045.Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li> Geändert Glas "Transfer"-Pipetten (unten Pasteurpipette entfernt und Kanten geglättet) </li><li> Aclar Plastikfolie geschnitten 2 "in x 2" in Quadrate (Honeywell, # 812071, Pottsville, PA) </li><li> Deckel Schwämme 4 in der 3 in (Kendall, cat # 3157, Mansfield, MA) </li><li> 30 mm Millicell Membran-Einsätze (0,4 &amp;mgr; m; Millipore, Bedford, MA) </li><li> Mcllwain Tissue Chopper mit zweischneidiges Rasierklinge (McIlwain Gewebe Chopper, Vibratom Company, St. Louis, MO) </li><li> Inversen Mikroskop mit CCD-Kamera und Bildanalyse-Software </li></ul> (Ii) Dissection Medium (DM, 1 Liter bei pH 7,3) <table border="0"><tbody><tr><td> Hanks Balanced Salt </td><td> 1 Flasche (95,2 g/1L) (Sigma: H2387) </td></tr><tr><td> NHCO 3 (4,2 mM) </td><td> 350 mg </td></tr><tr><td> HEPES (10 mM) </td><td> 2,83 g </td></tr><tr><td> Glucose (33,3 mM) </td><td> 6,0 g </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin (100x) </td><td> 10 mL </td></tr><tr><td> BSA (0,3%) </td><td> 300 mg </td></tr><tr><td> MgSO 4-7H 2 O </td><td> 1,44 g </td></tr></tbody></table> (Iii) Kulturmedium (400 ml) <table border="0"><tbody><tr><td> MEM (Invitrogen 11575-032) </td><td> 200 mL </td></tr><tr><td> *** Hanks Balance-Salz (Invitrogen 24020-117) </td><td> 100 mL </td></tr><tr><td> Pferdeserum (Invitrogen 26050-070) </td><td> 100 mL </td></tr><tr><td> HEPES-Puffer (1 M; Invitrogen 15630-080) </td><td> 5 mL </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin (100x) </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td colspan="2"> *** Fügen 12,8 g Glucose in 500 ml Hank Balance-Salz, bevor Kulturmedium </td></tr></tbody></table> (Iv) Tiere 7 Tage alten Ratte oder Maus postnatal Welpen, in der Regel einen Wurf pro Experiment. 2. Am Tag der Kultur <ol><li> Alle Dissektion Werkzeuge und Aclar Film muss in 70% EtOH für 30 Minuten vor Beginn eingeweicht werden. Die Oberfläche der Dissektion Kapuze, Klinge und Gewebe Chopper muss mit Ethanol desinfiziert werden. </li><li> Bereiten Sie mehrere (3-4) 6 well-Zellkulturplatten; 1 mL Kulturmedium pro Vertiefung, und legen Sie eine Millipore Membran in jede Vertiefung. Legen Sie 6-well Platten im 37 °-Inkubator bis zu seiner Scheiben übertragen. </li><li> Bereiten Sie mehrere (4-6) 60 mm-Platten mit DM und auf Eis stellen. </li><li> Schnell mit einer Schere zu enthaupten und tauchen Sie in 70% EtOH und schnell entlarven das Gehirn mit einem saggital Einschnitt des Schädels. Entfernen Sie vorsichtig das Gehirn und Ort sofort in kaltem DM. Separate es in zwei Hemisphären und Ort jeder Hemisphäre medialen Seite nach unten auf eine Abdeckung Schwamm für 2-3 Sekunden. </li><li> Heben und Ort der Hemisphäre auf die Aclar Film Platz und auf dem Gewebe Chopper schneidet die Gehirn koronal in 350 um Abschnitte. Wenn Sie fertig sind, nehmen Sie vorsichtig die Alcar Platz mit dem geschnittenen Hemisphäre und tauchen in kalten DM. </li><li> Mit einem Binokular, scheiden sich die Hippocampus-Abschnitte. Für Ratten, sollte es 5 Sektionen Spanning rostral nach kaudal Hippocampus, und für die Maus sollte es 3-4 Abschnitte werden. </li><li> Nehmen Sie die 6-well-Platten mit Membran-Einsätze aus dem 37 ° Gewebekultur-Inkubator. Transfer-Schnitten des Hippocampus einzeln auf die Membranen mit dem Glas Transferpipette. Wenn zu viel DM auf die Membran gelöst wird, entfernen überschüssige DM mit einer Pasteurpipette. Platz fünf Schnitten des Hippocampus auf jede Membran. Mindestens 3 Wells pro Zustand, oder 15 Scheiben schneiden. </li><li> Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° in einer 5% CO befeuchteten Inkubator für 12-14 Tage vor Beginn der Toxizität zu experimentieren. Das Kulturmedium kann zweimal pro Woche gewechselt werden. </li></ol> 3. Induktion und Quantifizierung Hippocampus neuronaler Schädigung in Scheiben Kultur <ol><li> Nach 12-14 Tagen in Kultur, mit 5 ug / ml Propidiumiodid (PI) zu den Kulturmedien. Dieser Schritt ermöglicht Visualisierung und Quantifizierung der basalen Zelltod. </li><li> Am folgenden Tag, zu quantifizieren PIFluoreszenz in der CA1 Subregion (und / oder CA3 oder dentatus falls gewünscht) jedes Hippocampus Scheiben schneiden und zu erhalten bedeutet die PI-Fluoreszenz-Messungen darstellt basalen Zelltod (bezeichnet als Zeit = 0 Stunden oder T 0). Für die Bildaufnahme und Quantifizierung, verwenden wir OpenLab Software (Improvisation, UK), aber auch andere Bildaufnahme und Analyse-Software kann verwendet werden, um Fluoreszenz-Intensität zu quantifizieren. </li><li> Unmittelbar nach der Bildaufnahme von T 0 PI Fluoreszenz induziert neuronale Verletzungen, die durch Ihre Methode der Wahl (wir haben 10 uM NMDA, Sauerstoff-Glukose Entzug oder LPS für eine Stunde gebraucht, um neuronale Toxizität 2,5 induzieren). Nach der toxischen Reiz, zu ersetzen durch frisches Medium mit 5 ug / ml PI und pflegen Scheiben über Nacht. </li><li> Am Tag 3, zu quantifizieren bedeuten PI Fluoreszenz der experimentellen Bedingungen bei 24 oder T 24. </li><li> Nach diesem Bildaufnahme, sofort ändern Medium und fügen 10 uM NMDA und 5 ug / ml PI und inkubieren Scheiben über Nacht bis zur maximalen neuronalen Tod zu erreichen. </li><li> Am Tag 4, zu quantifizieren bedeuten PI Fluoreszenz von maximal neuronalen Tod, als T max definiert. Berechnen Prozent Zelltod wie folgt: (T 24 - T 0) / (T max-T 0). </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2106/2106fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. (A) Time line zur Generierung von Hippocampus und anschließende experimentelle Verletzungen und Bildaufnahme. (B) Repräsentative Bilder Schnitten des Hippocampus basal (T 0), 24 Stunden nach einer 1-stündigen Exposition gegenüber 10 uM NMDA (T 24), und nach weiteren 24 Stunden oder 10 uM NMDA bis maximal neuronaler Schädigung (T max) zu erhalten.

<ol><li>Stoppin, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37 (2), 173-173 (1991).</li>
<li>McCullough, L., Wu, L., Haughey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+Function+of+the+PGE2+EP2+Receptor+in+Cerebral+Ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective Function of the PGE2 EP2 Receptor in Cerebral Ischemia.</a> J Neurosci. 24 (1), 257-257 (2004).</li>
<li>Czapiga, M., Colton, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+microglia+in+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Function of microglia in organotypic slice cultures.</a> J Neurosci Res. 56, 644-644 (1999).</li>
<li>Newell, D. W., Barth, A., Papermaster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+and+non-glutamate+receptor+mediated+toxicity+caused+by+oxygen+and+glucose+deprivation+in+organotypic+hippocampal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate and non-glutamate receptor mediated toxicity caused by oxygen and glucose deprivation in organotypic hippocampal cultures.</a> J Neurosci. 15, 7702-7702 (1995).</li>
<li>Wu, L., Wang, Q., Liang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+Effects+of+prostaglandin+recetor+signaling+on+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+letter%22%5BJournal%5D)">Divergent Effects of prostaglandin recetor signaling on neuronal survival.</a> Neuroscience letter. 421, 253-253 (2007).</li>
<li>Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R., R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+in+vitro%3A+Analysis+of+morphology+and+adhesion+molecule+expression+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells in vitro: Analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Glia. 18, 319-319 (1996).</li>
</ol>

Es gibt zwei wichtige Punkte zu folgen, um reproduzierbare und konsistente Ergebnisse zu gewährleisten, wenn die Replikation Experimente. Zunächst ist es wichtig, den Schnitten des Hippocampus Alter für 12-14 Tage vor Experimentieren lassen. Mit slice Isolation, gibt es einen signifikanten Mikroglia Antwort, und Mikroglia noch einige Zeit aktiviert, mit einer Rückkehr zu einer ruhenden verzweigten Zustand auftretenden Tag 10 in vitro 3,6. Zweitens bedeuten PI Fluoreszenzintensität ist proportional zu...

die organotypische hippokampalen slice-kultur-modell für die prüfung neuronaler schädigung

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypischen hippocampalen Slice-Kultur ist eine in vitro-Methode, um Mechanismen der neuronalen Verletzungen, in denen die grundlegende Architektur und die Zusammensetzung des Hippocampus relativ 1 ist erhalten zu untersuchen. Die organotypischen Kultur-System ermöglicht die Untersuchung der neuronalen, Astrozyten und Mikroglia-Effekte, sondern als Ex-vivo-Vorbereitung, befasst sich nicht mit Auswirkungen der Durchblutung, oder Rekrutierung von peripheren Entzündungszellen. Zu diesem Zweck ist diese Kultur-Methode häufig verwendet, um excitotoxic und hypoxischen Verletzung pyramidalen Neuronen des Hippocampus zu untersuchen, sondern wurde auch verwendet, um die entzündliche Reaktion zu untersuchen. Hier beschreiben wir die Methoden zur Erzeugung von hippocampalen Slice-Kulturen aus postnatalen Nagetier Gehirn, Verwaltung toxische Reize zu neuronaler Schädigung hervorrufen, und Untersuchung und Quantifizierung des Hippocampus neuronalen Tod.

Die organoptypic Hippocampus Stück Kultur-Modell ist ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell verwendet, um neuronale Verletzungen in eine Vielzahl von Paradigmen zu untersuchen. In diesem Artikel beschreiben wir die Methoden zur Erzeugung von Slice Kulturen und Quantifizierung neuronaler Schädigung.

Die Organotypische hippokampalen Slice-Kultur-Modell für die Prüfung neuronaler Schädigung

Die organotypische Hippocampus-Schnittkultur ist eine In-vitro-Methode zur Untersuchung von Mechanismen neuronaler Schädigungen, bei der die grundlegende Architektur und Zusammensetzung von ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, organotypische hippokampale Schnittkulturen herzustellen, die zur Modellierung neuronaler Schädigungen in Reaktion auf eine Vielzahl von Stimuli verwendet werden können, einschließlich NMDA, exzitotoxischer Sauerstoff- und Glukoseentzug oder entzündliche Stimuli wie Lipopolysaccharid oder Amyloid-Beta-Peptid. Dies wird erreicht, indem zunächst das postnatale Gehirn isoliert und jedes Hemisphäre in koronare Schnitte zerlegt wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die hippokampalen Regionen zu isolieren und sie auf Membraninserts in Sechs-Loch-Platten zu kultivieren. Nach der Kultivierung der Schnitte werden diese mit Propidiumiodid gefärbt und das Ausmaß des spontanen neuronalen Zelltods berechnet.Schließlich werden die Schnitte mit einem neurotoxischen Agenten behandelt und erneut gefärbt, um die Toxizitätsreaktion auf die Behandlung zu messen. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die den Prozentsatz des neuronalen Zelltods in den Regionen CA1, CA3 und Gyrus dentatus des Hippocampus unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zeigen, basierend auf der Quantifizierung der Propidiumiodid-Fluoreszenz

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JoVE Journal

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Neurowissenschaften

Wir beschreiben eine Methode zur organotypischen Schnitten des Hippocampus, die leicht auf andere Hirnregionen angepasst werden vorbereiten können. Hirnschnitten sind auf porösen Membranen und Kulturmedien ist erlaubt, um eine Schnittstelle bilden gelegt. Diese Methode schont die grobe Architektur des Hippocampus für bis zu 2 Wochen in Kultur.

Organotypischen hippokampalen Slice-Kulturen

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Herstellung von organotypischen Hippocampus-Schnittkulturen aus dem Gehirn eines Rattenwelpen. Es beschreibt die Schritte bei der Dissektion des Hippocampus, das Schneiden und die Kulturbedingungen, die erforderlich sind, um die Lebensfähigkeit und das Wachstum der Zellen in den Hippocampus-Schnitten zu fördern und letztendlich organotypische Schnittkulturen zu erzeugen.

Präparation von organotypischen Schnittkulturen aus dem Hippocampus eines Rattenwelpen

Die organotypischen Hirnschnitt Co-Kultur mit Karzinomzellen ermöglicht die Visualisierung morphologische Veränderungen durch Fluoreszenz sowie Hellfeld-(Video)-Mikroskopie während des Prozesses der Karzinomzellinvasion von Hirngewebe. Dieses Modellsystem ermöglicht auch für die Zellaustausch und die Wiederauffüllung Ansätze und bietet eine Vielzahl von Manipulationen und Analysen.

Co-Kultur-System mit einer Scheibe Organotypische Gehirn-und 3D-Sphäroid von Karzinomzellen

Wir haben eine Hirnschnittmodell, das verwendet werden kann, um die molekularen Mechanismen der Exzitotoxizität-vermittelten-Hirn-Verletzungen beteiligt untersuchen entwickelt. Diese Technik erzeugt lebensfähigen reifen Hirngewebe und reduziert die für Experimente erforderlichen Tiernummern, unter Beibehaltung der neuronalen, zellulären Interaktionen und postsynaptischen Fächer teilweise intakt.

Exzitotoxische Stimulation der Hirn Microslices als<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Stroke

Eine Technik zur Untersuchung von NG2-Zellen und Oligodendrozyten unter Verwendung eines Schnittkultursystems des Vorderhirns und des Kleinhirns wird beschrieben.  Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Dynamik der Proliferation und Differenzierung von Zellen innerhalb der Oligodendrozytenlinie, bei der die extrazelluläre Umgebung leicht manipuliert werden kann, während die Zytoarchitektur des Gewebes erhalten bleibt.

Organotypischen Kulturen zu Oligodendrozyten Dynamik und Myelinisierung Studieren

Ein Protokoll für entorhino-Hippocampus organotypischen Kulturen, die Wiedergabe von vielen Aspekten der ischämischen Hirnschädigung ermöglicht, wird vorgestellt. Durch das Studium der Veränderungen der Leitungsbahnen in Zusätzlich zu den Veränderungen in den Nervenzellen ist dieses Protokoll ein vielseitiges Werkzeug, um plastische Veränderungen im Nervengewebe nach Verletzungen zu studieren.

Die Analyse der neurovaskuläre Remodeling in Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen

Hier beschreiben wir eine Technik zur Untersuchung Hippocampus postnatale Neurogenese mit dem organotypischen Kulturtechnik. Dieses Verfahren ermöglicht die in vitro Manipulation von Neurogenese und ermöglicht die direkte Anwendung von pharmakologischen Wirkstoffen an die kultivierten Hippocampus.

Organotypischen Kulturen für Studien der postnatale Neurogenese

Organotypischen hippocampal Slice Kulturen (OHSC) sind eine in-vitro- Modell, die die in-Vivo -Situation sehr gut simuliert. Hier beschreiben wir eine Vibratome-basierte verbessert schneiden-Protokoll, um qualitativ hochwertige Scheiben für den Einsatz bei der Beurteilung der neuroprotektive Potenzial der neuartigen Substanzen oder das biologische Verhalten der Tumorzellen zu erhalten.

Organotypischen Hippocampal Slice Kulturen als Modell zur Studie Neuroprotektion und Invasivität der Tumorzellen

Ein Protokoll zur Vorbereitung frei schwebender Scheibenkulturen aus dem erwachsenen menschlichen Gehirn wird vorgestellt. Das Protokoll ist eine Variation der weit verbreiteten Slice-Kultur-Methode mit Membraneinsätzen. Es ist einfach, kostengünstig und wird für die Durchführung von kurzfristigen Assays empfohlen, die darauf abzielen, Mechanismen der Neurodegeneration hinter altersbedingten Hirnerkrankungen zu entwirren.

Kurzfristig frei schwebende Scheibenkulturen aus dem erwachsenen menschlichen Gehirn

Hier beschreiben wir die Herstellung von rhinalen Kortex-Hippocampus organotypischen Scheiben. Unter einem allmählichen und kontrollierten Serumentzug zeigen diese Scheiben sich entwickelnde epileptische Ereignisse und können als Ex-vivo-Modell der Epileptogenese angesehen werden. Dieses System stellt ein hervorragendes Werkzeug zur Überwachung der Dynamik spontaner Aktivität sowie zur Beurteilung des Fortschreitens neuroinflammatoratorischer Merkmale im Verlauf der Epileptogenese dar.

Ein Modell der Epileptogenese in rhinalen Kortex-Hippocampus Organotypischen Schnittkulturen

Dieser Artikel zielt darauf ab, ein systematisches Protokoll zu beschreiben, um horizontale Hippocampus-Gehirnscheiben bei Mäusen zu erhalten. Das Ziel dieser Methode ist es, die Integrität von Hippocampus-Faserwegen zu erhalten, wie dem Perforantenweg und dem moosigen Fasertrakt, um dentate Gyrus-bezogene neurologische Prozesse zu bewerten.

Horizontale Hippocampal Scheiben der Maus Gehirn

Erfahren Sie die Erstellung von organotypischen hippocampalen Schnittkulturen zur Untersuchung neuronaler Schädigung. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Zelltod in CA1, CA3 und Dentatus.

Die Organotypische hippokampalen Slice-Kultur-Modell für die Prüfung neuronaler Schädigung

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