Die Organotypische hippokampalen Slice-Kultur-Modell für die Prüfung neuronaler Schädigung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, organotypische Hippocampus-Schnittkulturen zu erzeugen, die zur Modellierung neuronaler Schädigungen als Reaktion auf eine Vielzahl von Reizen verwendet werden können, darunter NMDA, Exzitotoxizitätssauerstoff, Glukoseentzug oder Entzündungsreize wie Lipopolysaccharid oder Amyloid-Beta-Peptid. Dies wird erreicht, indem zunächst das postnatale Gehirn isoliert und jede Hemisphäre aufgeschnitten wird, um koronale Sucs zu erzeugen. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Hippocampusregionen zu isolieren und auf Membraneinsätzen in sechs Well-Platten zu kultivieren. Nach der Kultivierung der Schnitte werden die Schnitte mit Propidiumiodid gefärbt und der Grad des spontanen neuronalen Todes berechnet.

Schließlich werden die Scheiben mit einem neurotoxischen Mittel behandelt und restauriert, um die Toxizitätsreaktion auf die Behandlung zu messen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die den prozentualen neuronalen Tod in den Regionen CA eins, CA drei und dentaten des Hippocampus unter experimentellen Bedingungen durch Quantifizierung der Propidiumiodid-Fluoreszenz mittels Immunfluoreszenzmikroskopie zeigen. Der Hauptvorteil der geringsten Technik gegenüber bestehenden Geizhälsen, wie einer primären neuronalen Kultur, besteht darin, dass der Mechanismus der neuronalen Schädigung untersucht wird, bei dem die grundlegende Architektur des Hippocampus relativ intakt ist.

Und die dritte Art beinhaltet Bewegung. Mikroglia und ROY werden vor Beginn der Dissektion konserviert. Setzen Sie jeweils eine Millipore-permeable Membran ein.

Nun, fügen Sie einen Milliliter Nährmedium zu jeder Vertiefung von mehreren hinzu. Sechs Well-Gewebekulturplatten. Erwärmen Sie die Platten in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius.

Tauchen Sie den enthaupteten Kopf eines Tages, sieben Rattenwelpen kurz in 70% Ethanol. Zur Desinfektion wurde mit einer Mikro-Präparierschere ein sagittaler Schnitt durch den Schädel gemacht, um das Gehirn freizulegen. Entferne das Gehirn mit einer Pinzette schnell und übertrage es in eine 60-Millimeter-Schale mit Präpariermedium auf Eis.

Trennen Sie das Gehirn mit einer Pinzette in zwei Hemisphären. Legen Sie jede Halbkugel mit der medialen Seite nach unten für zwei bis drei Sekunden auf einen trockenen Abdeckschwamm, um überschüssige Feuchtigkeit aufzufangen. Übertragen Sie das Gehirn auf ein Quadrat eines CLAR-Films und platzieren Sie es auf der Plattform eines Gewebe-Choppers, der in 350-Mikrometer-Schnitten koronal schneidet, beginnend am Rosland.

Und verhätschelt weiter. Heben Sie das A-Clar-Quadrat vorsichtig an und tauchen Sie die Scheiben in eine frische Schüssel mit eiskaltem Präpariermedium. Identifizieren Sie unter einem Präpariermikroskop den Hippocampus, eine CS-förmige Struktur, die unterhalb der Großhirnrinde liegt und mit dem Striatum verhätschelt ist.

Trennen Sie den Hippocampus mit einer Pinzette von jedem koronalen Abschnitt. Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette, die wie im Text beschrieben modifiziert wurde, um fünf Hippocampus-Scheiben auf jede Membran zu übertragen. Setzen Sie die vorbereiteten warmen Sechs-Well-Platten ein.

Entfernen Sie überschüssiges Medium auf der Oberfläche der Membran. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für 12 bis 14 Tage. Wechseln Sie das Medium, wie im Begleittext beschrieben, nach 12 bis 14 Tagen in Kultur, tauschen Sie das Medium aus und fügen Sie fünf Mikrogramm pro Milliliter pro Kilogramm, abgekürzt Pi, hinzu, um die Visualisierung und Quantifizierung des Basalzelltods zu ermöglichen.

Inkubieren Sie die Scheiben über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop, das mit einer CCD-Kamera verbunden ist. Nehmen Sie diesmal Bilder der Scheibe mit 40-facher Vergrößerung auf. Point erfasst die PI-Fluoreszenz, die dem basalen Zelltod entspricht, wenn der Zeitpunkt gleich null Stunden oder T null unmittelbar nach der Bildgebung ist. Die Schnitte induzieren eine neuronale Schädigung mit der für das aktuelle Experiment bevorzugten Methode.

Hier werden die Scheiben eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid mit frischem Medium inkubiert, das 10 mikromolare NMDA enthält. Nach neurotoxischer Behandlung. Ersetzen Sie das Medium durch ein frisches Kulturmedium mit fünf Mikrogramm pro Milliliter Pi.

Inkubieren Sie die Scheiben über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid Bild der PI-Fluoreszenz nach der neurotoxischen Behandlung. Die mittleren Fluoreszenzmessungen für diesen Zeitpunkt stellen den Grad des Zelltods dar. Nach 24 Stunden experimenteller Schädigung oder T 24 Stunden ist das Medium sofort durch frisches Kulturmedium zu ersetzen, das 10 mikromolare NMDA und fünf Mikrogramm pro Milliliter enthält.

PI inkubiert die Scheiben über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, um einen maximalen neuronalen Tod zu erreichen. Erfassen Sie den endgültigen Satz von Bildern der PI-Fluoreszenz, die mittleren Fluoreszenzmessungen für diesen Zeitpunkt. Stellen Sie den maximalen Zelltod oder Tmax dar.

Quantifizieren Sie die PI-Fluoreszenz im interessierenden Bereich mit Hilfe einer Bildanalysesoftware, wie im Begleittext beschrieben. Dies ist ein repräsentatives Bild der PI-Färbung des basalen neuronalen Todes in der ca. einen Region des Hippocampus. Hier ist ein repräsentatives Bild des PI-gefärbten neuronalen Todes.

24 Stunden nach einer einstündigen Behandlung mit 10 mikromolaren NMDA bemerken Sie die intensivere Färbung, die auf einen höheren Grad des Zelltods hinweist. Dieses Bild zeigt die maximale PI-Färbung nach einer Inkubation über Nacht mit 10 mikromolaren NMDA. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen organischen Hippocampus-Schnitt erzeugt und wie hoch das Messniveau einer neuronalen Verletzung ist.