Dünnschichtchromatographie-basierter Enzymaktivitätsassay: Eine Technik zur Bestimmung der In-vitro-Pyrophosphokinase-Aktivität mittels Dünnschichtchromatographie

Pyrophosphokinase katalysiert den Diphosphat- oder Pyrophosphattransfer von Nukleotidvorläufern wie Adenosintriphosphat (ATP) zu Substraten wie Guanosindiphosphat (GDP). Dabei entsteht Guanosintetraphosphat – ein wichtiges Signalmolekül.

Zur Bestimmung der Pyrophosphokinase-Aktivität wird ein Reaktionsgemisch aus GDPs und radioaktiv markierten ATPs in einem geeigneten Puffer hergestellt, der mit Magnesiumchlorid ergänzt wird. Geben Sie die gewünschte Menge Pyrophosphokinase in das Reaktionsgemisch und inkubieren Sie.

Im Laufe der Zeit beginnt die Pyrophosphokinase in Gegenwart von Magnesiumionen, den radioaktiv markierten Pyrophosphatanteil von ATP auf GDP zu übertragen, wodurch radioaktives Guanosintetraphosphat entsteht.

Nehmen Sie nun eine Dünnschichtchromatographie oder DC, eine Platte, die mit Polyethylenimin-Cellulose vorbeschichtet ist - einer stationären Phase auf Basis eines kationischen Polymers. Lokalisieren Sie Aliquots der Analyten des Reaktionsgemisches in der Nähe der DC-Plattenbasis zu verschiedenen Zeitpunkten, um die Reaktion zu stoppen und den Fortschritt zu bewerten.

Tauchen Sie die Platte in eine Glaskammer, die monobasisches Kaliumphosphat enthält - ein Lösungsmittel in der mobilen Phase. Wenn sich die Lösungsmittelfront nach oben bewegt, beginnen negativ geladene Analyten aufgrund ihrer Affinität zur positiv geladenen stationären Phase zu migrieren.

Die Unterschiede in den negativen Ladungen und dem Gewicht unterschiedlich phosphorylierter Analyten bestimmen ihre relative Migration auf der DC-Platte, so dass sie als unterschiedliche Banden immobilisiert werden können.

Wenn die Lösungsmittelfront den gewünschten Abstand erreicht hat, entfernen Sie die Platte und trocknen Sie sie an der Luft. Messung der Intensität des radioaktiven Signals, die dem radioaktiv markierten ATP-Abbau und der Guanosintetraphosphat-Akkumulation entspricht, um die Pyrophosphokinase-Aktivität zu analysieren.