Dünnschicht-Chromatographie-(TLC) Trennungen und Bioassays der Pflanzenextrakte antimikrobielle Verbindungen zu identifizieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, pflanzliche Metaboliten zu identifizieren, die antimikrobiell gegenüber anaeroben Bakterien sind. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Pflanzenextrakt durch Dünnschichtchromatographie oder DC getrennt wird. Als nächstes wird das Chromatogramm in Zonen geschnitten, die eine oder mehrere Verbindungen umfassen.

Die Zonen werden dann auf Agar gelegt, der mit anaeroben Bakterien geimpft ist, und inkubiert. Nach der Inkubation werden die Zonen entfernt und die Platten gefärbt, um Verbindungen zu identifizieren, die das Bakterienwachstum hemmen. Die daraus resultierenden Daten zeigen das Vorhandensein oder Fehlen von antimikrobiellen Pflanzenmetaboliten.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Wiederkäuerernährung zu beantworten, wie z.B. welche Auswirkungen pflanzliche Sekundärmetaboliten auf die Nährstoffverwertung durch bestimmte Mikroorganismen haben. Diese Methode deckt jedoch Pflanzenstoffe auf, die gegen Pansenbakterien hemmend sind. Es kann auch angewendet werden, um Verbindungen aufzudecken, die für andere Bakterien oder Pilze hemmend sind.

In diesem Protokoll werden phenolische Verbindungen aus Rotklee verwendet, um die Identifizierung von antimikrobiellen Verbindungen durch Kontaktbiographie zu demonstrieren. Beginnen Sie mit der Reinigung der Dünnschichtchromatographie- oder DC-Platten, die in einem Abzug arbeiten. Bereiten Sie genügend Reinigungslösungsmittel vor, um den Boden der DC-Entwicklungskammer sowie den unteren Rand der A-DC-Platte zu bedecken.

Wenn es hier in die Kammer gesetzt wird, wird Ethylacetat-Methanol zwei zu eins hergestellt. Als nächstes tragen Sie Handschuhe und arbeiten in einem Abzug. Verwenden Sie eine Schere, um flexible Silica-Platten mit Aluminium- oder Kunststoffrücken so zu schneiden, dass sie in die Entwicklungskammer passen.

Setzen Sie die Platten so in die Kammer ein, dass die Oberseiten an die Kammerwände gelehnt sind. Die Platten sollten sich nicht berühren. Decken Sie die Kammer ab und lassen Sie das Lösungsmittel durch Kapillarwirkung die Platten hinaufwandern.

Wenn das Lösungsmittel die Oberseite der Platten erreicht hat, nehmen Sie sie aus der Kammer und stellen Sie sie stehend in den Abzug, bis das Lösungsmittel verdampft ist. Sobald die Platten trocken sind, überprüfen Sie, ob Verunreinigungen in der Nähe der Oberseite der DC-Platten gewandert sind. Diese erscheinen als gelbes Band unter sichtbarem Licht oder als fluoreszierendes Band unter ultraviolettem Licht.

Wenn der Großteil der Platte immer noch einen gelblichen Schimmer aufweist, wiederholen Sie den Reinigungsvorgang in derselben DC-Kammer mit demselben Lösungsmittel. Nachdem Sie die DC-Platten aus der Kammer genommen haben, entsorgen Sie das Lösungsmittel. Lassen Sie das restliche Lösungsmittel vollständig verdampfen, bevor Sie die Kammer für den nächsten Teil des Protokolls verwenden.

Um die Restfeuchtigkeit zu entfernen, die die Migration von Verbindungen auf Kieselsäure beeinträchtigen kann, stützen Sie die Platten in einem Trockenofen bei 100 Grad Celsius für 10 bis 15 Minuten für eine 20 x 20 Zentimeter große Platte und fünf Minuten für sieben x 10 Zentimeter große Platten. Sobald die Platten trocken sind, lassen Sie sie auf Umgebungstemperatur abkühlen, bevor Sie sie mit Extrakten befüllen. Um die Kammern für die Extraktabscheidung vorzubereiten, schneiden Sie mit einer Schere ein Stück Filterpapier etwas unterhalb der Kammerhöhe und etwa die Hälfte des Kammerumfangs in der Breite ab.

Dieses Papier dient als Docht, um Lösungsmittel an der Kammerwand hochzuziehen und die Kammer mit Lösungsmittelpapieren zu sättigen, wodurch die Reproduzierbarkeit der Trennungen verbessert wird. In einem Abzug mischen Sie hier die Lösungsmittel. Die verwendeten Lösungsmittel sind Ethylacetat-Methanol mit vier zu einem Volumen pro Volumen. Gießen Sie die Lösungsmittelmischung in die Kammer und decken Sie sie ab.

Markieren Sie mit einem Bleistift leicht den Ursprung an einem Punkt auf der DC-Platte, der sich über der Oberfläche des sich entwickelnden Lösungsmittels in der Kammer befindet. Wenn das Absorptionsmittel der DC-Platte weich und leicht zu beschädigen ist, machen Sie Markierungen an den Rändern, wie hier gezeigt. Als nächstes lösen Sie die Extrakte in genügend organischem Lösungsmittel auf, um eine konzentrierte Lösung anstelle einer trüben Suspension zu erhalten.

Als Lösungsmittel kommt hier Methanol zum Einsatz. Mit Kapillar-Mikropipetten oder einer Mikroliterspritze werden Standards und Proben als schmale Bänder geladen, während an den Seiten der Platte ein Zentimeter Rand verbleibt, damit die Bänder trocknen können. Das Auffächern der Platte oder das Laden in einen Abzug hilft, die Bänder schneller zu trocknen. Sobald die Bänder getrocknet sind, laden Sie die Proben erneut an der gleichen Stelle oder über dem Punkt.

Wenn eine höhere Probenkonzentration auf der Platte erforderlich ist, wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf in der DC-Kammer. Stellen Sie sicher, dass der gesamte Docht mit Lösungsmittel gesättigt ist. Platzieren Sie dann die Platten mit einer Pinzette oder Zange in der DC-Kammer.

Die Platten sollten den Docht nicht berühren. Decken Sie die Kammer ab und lassen Sie die Platten sich entwickeln, bevor die Lösungsmittelfront die Oberseite der Platte erreicht. Entfernen Sie die Platten aus dem DC-Tank und markieren Sie mit einem Bleistift die Höhe der Lösungsmittelfront.

Lass die Platte trocknen. Entwickeln Sie in einem Abzug alle verbleibenden DC-Platten in derselben DC-Kammer, die in der Regel einen ganzen Tag lang verwendet werden kann, wenn sie geschlossen gehalten wird. Wenn die Menge des Lösungsmittels in der Kammer merklich abnimmt, stellen Sie nach dem Trocknen der Platten eine stärkere Lösungsmittelmischung her.

Visualisieren Sie die Bänder unter sichtbarem oder UV-Licht. Eine Betrachtungskammer mit einer tragbaren UV-Lampe ist praktisch, insbesondere wenn die Lampe Verbindungen sowohl bei 254 Nanometer kurzwelligem UV als auch bei 365 Nanometer langwelligem UV nachweisen kann. Verwenden Sie einen Bleistift, um die Bänder mit einem Gel-Fotodokumentationssystem abzugrenzen, das mit Überkopf-, UV- und/oder sichtbarem Licht ausgestattet ist, um Bilder der Platten zu erhalten.

Um die Charakterisierung der Banden zu erleichtern, berechnen Sie schließlich den Retentionsfaktor oder die HF-Werte, indem Sie zuerst die von der Verbindung zurückgelegte Strecke messen, dann die vom Lösungsmittel zurückgelegte Strecke messen und die erstere durch die Leiter dividieren. Sobald die Bandenpositionen markiert sind, können die Platten für später aufbewahrt werden. Verwendung im Bioassay.

Wickeln Sie die Teller in Plastik ein und decken Sie sie mit Folie ab. Lagern Sie die Platten bei minus 20 Grad Celsius. Die maximale Lagerzeit hängt von der Stabilität der Verbindung ab, da Kieselsäure nicht neutral ist.

Einige Verbindungen können sich auf der DC-Platte zersetzen. Zur Vorbereitung des Kontaktbiographie-Assays werden hyperammoniakproduzierende Bakterien oder HAB-Medium unter anaeroben Bedingungen vorbereitet und inokuliert. Bei der in diesem Fall verwendeten Kultur handelt es sich um den Clostridium stickland eye strain sr.

Züchten Sie die Kultur auf eine exponentielle oder stationäre Phase bei 39 Grad Celsius. Verwenden Sie sterile anaerobe Techniken, wenn Sie mit anaeroben Mikroorganismen arbeiten. Bereiten Sie den Nullpunkt 75% Gewicht pro Volumen vor.

Agar in demselben Medium, das zum Züchten der Bakterien verwendet wird, nachdem die Temperatur des Agars auf weniger als 60 Grad Celsius gesunken ist. Beimpfen Sie den geschmolzenen Agar mit 1 % Volumen pro Volumen der Kultur und mischen Sie ihn vorsichtig, legen Sie ihn sofort in eine anaerobe Kammer und gießen Sie ihn mit einer Schere in 15 x 100 Millimeter große Kunststoff-Petrischale. Schneiden Sie die DC-Platte in Bereiche, in denen sich das Band oder die Banden von Interesse befinden.

Mit einem Edding die Rückseiten der Platten markieren. Legen Sie einen unbenutzten DC-Streifen als Kontrolle auf die Agarplatte. Lege dann die Bänder mit der Vorderseite nach unten auf die Agarplatten.

Inkubieren Sie die Platten mit der Agarseite nach unten in der anaeroben Kammer. Inkubator für 24 Stunden bei 39 Grad Celsius mit Pinzette. Entfernen Sie die DC-Banden von den Agarplatten, während sie sich in der anaeroben Kammer befinden.

Geben Sie Tetra Oleum red tropfenweise auf die Oberflächen der Agarplatten. Lassen Sie die Farbe mindestens 20 Minuten einwirken. Wenn die Kontrollplatte vollständig rot wird, entfernen Sie die Platten aus der anaeroben Kammer.

Clostridium-Stick Landi ist ein anaerobes Bakterium, so dass es sofort nach der Entnahme aus der anaeroben Kammer an Lebensfähigkeit verliert, aber die Farbe ist länger als 24 Stunden stabil. Fotografieren Sie die Platten mit einer Digitalkamera unter sichtbarem Licht auf einem Hintergrund, der einen ausreichenden Kontrast bietet. Eine leuchtend rote Farbe wird beobachtet, wenn lebende Zellen gefärbt werden.

Abgestorbene Zellen färben sich nicht ab. Repräsentative Kieselsäure- und DC-Trennungen von Rotkleeextrakten, die phenolische Verbindungen enthalten, sind hier dargestellt. Die Trennung in Ethylacetat Hexan neun zu eins über 8,5 Zentimeter ergab fünf Banden, von denen eine vollständig vom Ursprung aufgelöst war.

Die geladenen Standards waren Formin, Bio, Canon A und Genine. Vier Banden aus dieser Platte wurden 24 Stunden lang auf Kulturen mit Clostridium-Stick Landi, einem Pansen-Hyperammoniak-produzierenden Bakterium, aufgebracht und mit Tetraoleumrot gefärbt, wie hier beschrieben. Die Inkubation mit Band eins Bio Canon A und einem Teil von Band zwei vier Monon nein auf bakteriell besiedeltem Agar führte zu einer gut definierten Hemmzone.

Die Inkubation des Rests der zweiten Bande sowie der Banden drei und vier hemmte das Bakterienwachstum jedoch nicht. Diese Ergebnisse zeigten, dass Bio-Kanon A hemmend war, um das Wachstum von Stickland-Augen zu sehen, aber nicht bei einem Nein. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Technik flexibel ist.

Andere Testmikroorganismen können verwendet werden, solange das geeignete Medium ausgewählt wird und Kontrollen enthalten sind, um sicherzustellen, dass die Trennchemie und die Nachweismethode kompatibel sind. Nach diesem Verfahren wird nachgedacht. Andere Techniken wie Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie können verwendet werden, um die in einem Bioassay identifizierten antimikrobiellen Verbindungen zu charakterisieren.