Study Gliazellen Heterogenität Einfluss auf Axon Wachstum Mit einer neuen Methode Cokultur

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Einfluss der glialen Heterogenität auf das Wachstum von DRG-Axonen und die Zellentladung zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst Gliazellen aus dem Kortex neugeborener Ratten gewonnen werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, DRG-Neuronen aus Rattenembryonen zu kultivieren und zu reinigen.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die gereinigten DRG-Neuronen auf die Gliazellen aufzubringen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Beobachtung des Axonwachstums im Zellaxon sowie die Durchführung der Zellfärbung und der Quantifizierungsanalyse. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden.

Diese Aufnahme zeigt, dass das Wachstum von DRG-Neuronen durch heterogene Gliazellen beeinflusst wird, wie Zeitrafferaufnahmen und immunfluoreszenzmikroskopische Analysen belegen. Hallo, ich komme aus dem Labor für Neuroimaging der Abteilung für Neurologie an der UCRA. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren, um den Einfluss glialer Zellen auf das Wachstum in einer neuartigen Kulturmethode zu untersuchen.

In unserem Labor verwenden wir diese neue Methode, um die Interaktion zwischen Neuronen und den ggl-Zellen zu untersuchen. Testen wir also die Studie. Um eine Ko-Kultur von glialen Zellen und Neuronen des dorsalen Wurzelganglions oder DRGs herzustellen, beginnen wir mit dem Kultivieren glialer Zellen unter einer Gewebekulturhaube. Legen Sie die Böden vorsterilisierter 24-Loch-Kulturplatten mit sterilisierten runden Glasdeckgläsern aus, beschichten Sie die Deckgläser in den Vertiefungen einer 6-Loch-Kulturplatte mit Polylysin und inkubieren Sie zwei Stunden bei Raumtemperatur.

Spülen Sie die Deckgläser und Kulturschalen zweimal mit destilliertem Wasser und lassen Sie sie an der Luft trocknen. Geben Sie anschließend 200 Mikroliter oder zwei Milliliter DCOS-modifiziertes Eagle-Medium oder DMEM mit 10 % fetalem bovinem Serum oder FBS in jede 24-Loch- bzw. 6-Loch-Schale. Inkubieren Sie die Schalen am folgenden Tag bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid.

Sterilisieren Sie die Abzugshaube mit positivem Luftstrom. Schalten Sie das UV-Licht für 20 Minuten ein und besprühen Sie anschließend alle Oberflächen unter der Haube mit 70 % Ethanol. Warten Sie 15 Minuten, bevor Sie fortfahren. Beginnen Sie mit den Köpfen von zwei P2- bis P6-Rattenwürfen, die durch Hypothermie anästhesiert wurden.

Dann am Foramen magnum mit Operationschere köpfen. Den Schädel entlang der Sagittalsymphese mit Iris-Schere öffnen und den Schädel abziehen. Das Vorderhirn entfernen und in gekühltes Leibovitz L-15 geben und mit dem zweiten Kopf wiederholen.

Danach unter einem Stereomikroskop arbeiten. Vorsichtig die Dura und die darunterliegenden Membranen sowie die Blutgefäße, die das Gehirn bedecken, entfernen. Den Kortex isolieren und mehrmals mit L 15 Medium waschen.

Verwenden Sie Mikrochirurgiescheren, um die Hirnrinde in kleine Stücke zu schneiden. Anschließend inkubieren Sie ein L-15-Medium, das 0,125 % Trypsin in EDTA enthält, bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten. Danach überführen Sie die Gewebestücke in ein 50-Milliliter-Röhrchen, das 20 Milliliter DMEM mit 20 % FBS enthält.

Fügen Sie DS in einer Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter hinzu. Dann agitieren Sie die Gewebelösung mithilfe einer feuerpolierten Pasteurpipette etwa 20-mal, um die Zellen zu lösen. Waschen Sie die Zellen abschließend einmal mit DMEM, der 10 % FBS enthält, und bestimmen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer.

Anschießend die Zellen mit 5.000 bis 10.000 Zellen pro Quadratzentimeter aussäen und bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Das Medium zweimal wöchentlich wechseln, um die DRGs zu isolieren, zu reinigen und zu kultivieren. Zunächst 24-Well-Platten mit mit Polylysin beschichteten Glas-Deckgläsern vorbereiten, wie zuvor gezeigt.

Fügen Sie 100 Mikroliter NVF-Medium zu jedem Deckglas hinzu und inkubieren Sie die Platten am folgenden Tag bei 37 Grad Celsius. Desinfizieren Sie die Abluftwerkbank erneut. Beginnen Sie dann mit E 12 bis E 15 Rattenembryonen, die unter dem Stereomikroskop aus dem Uterus einer mit Kohlendioxid euthanasierten trächtigen Ratte isoliert wurden.

Isolieren Sie die Rückenmarkstränge mit den verbundenen Spinalganglien und überführen Sie sie in 35-Millimeter-Dishs, die gekühltes Leibovitz-L-15-Medium enthalten. Mit Mikrochirurgiezangen vorsichtig die verbundenen DRGs von den Rückenmarksträngen im gekühlten L-15-Medium ablösen, wobei die DRGs nicht verletzt werden dürfen, und die verbundenen Axone durchtrennen.

Normalerweise werden 20 bis 30 DRGs aus einem Rückenmark isoliert, wenn alle DRGs aus den Rückenmarksegmenten gewonnen wurden. Alle isolierten DRGs in 0,125 % Trips in EDTA geben und 20 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Die Zellen einmal mit DMEM mit 20 % FBS waschen, dann DNase hinzufügen und mehrmals mit einer feuerpolierten Pasteurpipette pipettieren, um eine einheitliche Zellsuspension zu erzeugen, wie bereits bei den Gliazellen gezeigt. Eine zweite Waschung in MBF-Medium durchführen, die Zellen zählen und anschließend auf vorbereitete Deckgläser in 24-Loch-Platten mit jeweils 5.000 Zellen pro Vertiefung aussäen. Über Nacht inkubieren, um die DRG-Neuronen zu reinigen.

18 bis 24 Stunden nach der Aussaat. Ersetzen Sie das Medium 72 Stunden später durch Neurobasal-Medium, das 20 Mikromolar 5-Fluor-2-desoxyuridin enthält. Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums durch Neurobasal-Medium ohne FUDR.

Das Medium wird anschließend jeden zweiten Tag gewechselt. Ungefähr 20 Tage nach der Aussaat der Gliazellen erreichen diese die Konfluenz und sind bereit, 24 Stunden vor der Kombination der beiden Zelltypen, mit Neuronen koinzidiert zu werden.

Ersetzen Sie das Gliazellmedium durch MBF-Medium. Bereiten Sie eine Einzelzell-Suspension gereinigter DRGs wie zuvor gezeigt vor. Bestimmen Sie die Zelldichte.

Anschießend säen Sie die Neuronen mit einer Dichte von 500 Zellen pro Quadratzentimeter auf die Gliazellen aus. Die Neuronenmigration und das Neuritenwachstum auf Gliazellen können zu verschiedenen Zeitpunkten mithilfe von Bildanalyse-Software und immunhistochemischen Methoden mit zelltypspezifischen Antikörpern analysiert werden. Hier sind Beispiele für Gliazellen und DRG-Neuronen, die getrennt sowie in einer Kokultur gezüchtet wurden; die Gliazellen erreichen nach 20 Tagen Konfluenz.

In Kultur. Unter einem Phasenkontrastmikroskop war ersichtlich, dass verschiedene Teilpopulationen glialer Zellen unterschiedliche Wachstumsmuster und Morphologien bilden. Mittels Immunzytochemie wurde nachgewiesen, dass GFAP-positive Astrozyten mehr als 90 % der Kultur ausmachten.

Mithilfe unserer Methode der Behandlung mit FUDR für 72 Stunden erreicht die Reinheit der DRG-Neuronen innerhalb von sechs Tagen bis zu 99 % und weist ihre charakteristischen Morphologien mit einem hohen Dichte an Neuritenwachstum in einer Kultur von Neuronen und Gliazellen auf. Das Anheften der DRG-Neuronen und das Auswachsen der Neuriten erfolgte leicht auf Gliazellen innerhalb von vier Stunden nach der Aussaat; das Anheften der Neuronen und das Neuritenwachstum wurden durch Gliazell-Subpopulationen beeinflusst, die spezielle substrukturelle Wachstumsmuster bilden, die leicht im Phasenkontrastmikroskop identifiziert werden können. Und mithilfe der Immunzytochemie werde ich Ihnen lediglich zeigen, wie man DRG-Neuronen mit klaren Zellen kultiviert, um den Einfluss der Heterogenität von Gliazellen auf das Neuritenwachstum zu untersuchen.

Während dieser Sitzung ist es sehr wichtig, daran zu denken, das Gewebe sehr sorgfältig zu behandeln und die Zellen stets im Medium zu belassen. Niemals der Luft aussetzen oder austrocknen lassen. Das war's.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.