Name: Elektronen-Spin-Resonanz-Micro-Imaging an lebenden Spezies, bei Oxygen Mapping (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Lernen Sie die dreidimensionale ESR-Mikroskopie zur Sauerstoffkonzentrationsmessung an lebenden Zellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Cyanobakterien und deren Photosyntheseaktivität.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse nicht unterstützt. 213/09 vom israelischen Science Foundation, Grant No. 2005258 vom BSF Stiftung Grant No. 201665 vom European Research Council (ERC) und der Russell Berrie Institut für Nanotechnologie am Technion. Wir erkennen die Hilfe von Prof. Noam Adir und Faris Salame aus der Schulich Fakultät für Chemie am Technion in Bezug auf die Versorgung und Behandlung der Cyanobakterien. Die Hilfe und die Unterstützung von Svetlana Yoffis vom Technion Micro-Nano Fabrication Unit ist sehr geschätzt.

1. Übersicht der ESR Micro-Imaging Erstens bieten wir eine kurze Erläuterung der ESR, ESR-Mikroskopie und die verschiedenen Komponenten unseres Systems, und dann werden wir die tatsächliche Imaging Experimente beschreiben. Elektronen-Spin-Resonanz ist eine spektroskopische Technik, bei der elektromagnetische Strahlung bei einer bestimmten Frequenz durch Moleküle mit ungepaarten Elektronenspins absorbiert wird, platziert im Rahmen eines externen statischen Magnetfeld (Abbildung 1). ESR ist in weiten Bereichen der Wissenschaft, wie Chemie, Biologie, Physik und Materialwissenschaften beschäftigt, für die Detektion und Identifizierung von freien Radikalen und paramagnetischen Zentren. Es ist eine leistungsfähige Methode zur Untersuchung der Umgebung von paramagnetischen Molekülen in lebenden Arten und gibt Auskunft über Säuregrad (pH), Viskosität, Sauerstoff und reaktiven Sauerstoff-Spezies-Konzentrationen 3. Für heterogene Proben, kann ESR spektralen Informationen in ortsaufgelöst (dh durch den Erwerb eines Bildes) gewonnen werden, durch den Einsatz von Magnetfeldgradienten 4. Dies ist sehr ähnlich zu den gängigen Verfahren der Magnetresonanztomographie (MRT), die vor allem beobachtet Protonenspins. Bis jetzt wurden solche ESR bildgebenden Verfahren für lebende Exemplare mit relativ großen Abmessungen von wenigen Zentimetern und in mm-Skala Auflösung. (Zum Beispiel siehe Abbildung 2 aus Lit. 5 entnommen.) Eine relativ neue Entwicklung in ESR-Bildgebung ist die Erweiterung seiner Fähigkeiten aus der Betrachtung Kleintiere im Millimeter-Skala Auflösung der Messungen von Millimeter-und Sub-Millimeter-Größe Proben mit Mikrometer-Skala Auflösung. Dieses Feld wird als ESR-Mikroskopie, die heute 3D-ESR Bilder mit einer Auflösung von fast 1 micron 2 (siehe repräsentative Beispiele in Abbildung 3) kann liefern bekannt. Ein ESR-Mikroskop ist im Wesentlichen ähnlich wie bei einem konventionellen ESR-Spektrometers. Es hat einen Magneten zur Erzeugung des statischen Feldes, ein Mikrowellen-System zum Spinanregung und Signalerkennung, eine Sonde zur Aufnahme der Probe, und ein EDV-Konsole auf den Erwerb Prozess-und Daten-Handling zu kontrollieren. Andere Komponenten einzigartige ESR Bildgebung im Allgemeinen und auch in bestehende ESR Mikrokopie sind Magnetfeldgradienten Quellen, die Teil des elektronischen Systems sind, und Gradientenspulen, die in der Imaging-Sonde entfernt. Weitere Details über unsere speziellen Systems sind in das Protokoll Film gezeigt und beschrieben in Referenz 2. 2. ESR Micro-Imaging Probenvorbereitung Diese Stufe beschreibt die Methode für die Probenvorbereitung für die ESR-Mikro-Imaging Experiment. Am Ende dieser Phase-Zellen sind an der Unterseite eines speziell präparierten Glas ESR-Mikroskopie Probenbehälter zusammen mit einem Trityl-Radikals 6 Pufferlösung gelegt. Dieses Protokoll beschreibt die Messung von Cyanobakterien-Zellen und somit für andere Arten von Zellen, angemessene Anpassungen können in der Probenvorbereitung der Bühne benötigt werden. <ol><li> Zuerst werden ein paar Plätze von saugfähigen Papier mit einer Größe von ~ 400 400 um entnommen und in ein Eppendorf-Röhrchen, die anschließend mit 1,2 ml der Cyanobakterien Suspension (bei einer Konzentration von 40 mg / mL) gefüllt ist. </li><li> Die Suspension wird für 2 Minuten bei 6000 RPM in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. </li><li> Anschließend wird der Überstand Puffer vollständig außer für ~ 50 ul, die von links nach Cyanobakterien Austrocknung zu vermeiden, werden entfernt. Als Ergebnis dieses Prozesses ist die saugfähigen Papier nun durch die Cyanobakterien-Zellen gesättigt. </li><li> Mit feinen Pinzette, sind ein paar Fasern aus dem Papier extrahiert und auf dem Boden eines topfartigen speziell präparierten Glasprobe Halter 7. Nach, dass eine 3 mM Trityl in BG-11-Lösung 8, 9 (siehe Schema 1), um den Probenhalter wird durch die Hilfe einer feinen Spritze zugegeben. Der Halter ist dann versiegelt mit UV-härtenden Klebstoff, so dass eine kleine Luftauslass zu öffnen. <table border="1"><tbody><tr><td> Lager 4 </td><td> Lager 3 </td><td> Lager 2 </td><td> Lager 1 </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 2.86g/liter </td><td> K 2 HPO 4: 3H 2 O 4.0g/liter </td><td> MgSO 4: 7H 2 O 7.5g/liter </td><td> Na 2 Mg EDTA 0.1g/liter </td></tr><tr><td> MnCl 2: 4H 2 O 1.81g/liter </td><td></td><td></td><td> Eisenammoniumcitrat 0.6g/liter </td></tr><tr><td> ZnSO 4: 7 H 2 O 0.222g/liter </td><td></td><td></td><td> Zitronensäure: 1H2O 0.6g/liter </td></tr><tr><td> CuSO 4: 5 H 2 O 0.079g/liter </td><td></td><td></td><td> CaCl 2: 2H 2 O 3.6g/liter </td></tr><tr><td> COCl 2 : 6 H 2 O 0.050g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaMoO 4: 2H 2 O 0.391g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Schema 1. Vorbereitung der BG-11 Medium. </li></ol> 3. ESR Micro-Imaging-Experiments <ol><li> Zu Beginn der Imaging-Experiment auf der ESR-Mikro-Imaging-System ein und legen die Probe in den Resonator, die innerhalb der Imaging-Sonde geht. </li><li> Jetzt, mit dem Computer-Software, stellen Sie das System auf "Tune"-Modus und finden Sie die Resonanz Mikrowellenfrequenz der Sonde, die für die ESR-Messungen verwendet werden. </li><li> Im Anschluss daran setzte das statische Magnetfeld auf den Wert, dass die angewandten Mikrowellenfrequenz entspricht, setzen Sie die Timing-Parameter für die Impulsfolge und beobachten Sie die ESR-Signal, um sicherzustellen, dass das System gut funktioniert und die Probe wird gut vorbereitet. </li><li> Dann setzen Sie die Imaging-Parameter, wie zB die Anzahl der Pixel, die Stärke des Gradienten und die Länge der Gradientenpulsen ihre geforderten Werte. </li><li> Nach Setup sammeln drei 3D-ESR Bilder von einem Hahn-Echo-Bildgebung Pulssequenz (Abbildung 4) mit Puls-Trennung, Werte  500, 600 und 700 ns. </li><li> Licht auf die Probe projiziert wird ein-oder ausschalten abhängig von der erforderlichen experimentellen Bedingungen gedreht. </li><li> Bei der Aufnahme werden die Daten automatisch gespeichert. Thesen Rohdaten-Dateien werden dann via Matlab Software Skript verarbeitet werden, um Bilder der Tritylradikal Konzentration und die Relaxationszeit T 2 Karte, die in einer Sauerstoff-Konzentration image via vorbestehenden Kalibrierung übersetzt sind. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Die Ergebnisse des Experiments sind mehrere dreidimensionale ESR Mikro-Bilder mit unterschiedlichen τ-Werte aufgezeichnet. Typische Rohdaten Bilder sind in Abbildung 5 zur Verfügung gestellt. Die besten drei Bilder, unter dunklen Bedingungen gemessen, sind sehr ähnlich, außer für die Reduktion der Signalintensität. Auf der anderen Seite, das Bildmuster Veränderungen unter Bestrahlung mit Licht durch die unterschiedlichen Relaxationszeiten in verschiedenen Teilen der Probe. Diese Daten können 1 verarbeitet werden, um eine Amplitude Bild zu erhalten, wie in Abbildung 6 gezeigt, und auch Bilder von der Relaxationszeit T 2 (Abbildung 7). Die T 2 Bilder werden in Sauerstoffkonzentration Werte über eine bereits vorhandene Kalibrierkurve, dass die Sauerstoffkonzentration auf die Relaxationszeit über die Gleichung Links übersetzt: <img src="/files/ftp_upload/2122/2122eq.jpg" alt="Gleichung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Gleichung 1"> Hier ist T 2 0 der Spin-Spin-Relaxationszeit von der Sonde unter anoxischen Bedingungen (abhängig von der Sonde Konzentration, C, und die Diffusionskoeffizienten, D), und k eine Proportionalitätskonstante ist. In den meisten Fällen ist der Diffusionskoeffizient variiert nur wenig für die Live-Proben (obwohl, wenn nötig, es kann im Prinzip direkt ausgewertet auch durch ESR 6, 10), und die Spin-Konzentration während der bildgebenden Verfahren erhalten. Daher kann diese Beziehung zur direkten Messung der Sauerstoffkonzentration werden. Gehen wir zurück zu Abbildung 6 geht hervor, aus der Amplitude Bild, dass die Cyanobakterien-Zellen hauptsächlich auf der rechten Seite des Probenhalters befanden. Darüber hinaus, basierend auf Abbildung 7, ist es klar, dass das Licht die Produktion von O 2 initiiert und führt zu einem signifikanten Anstieg in der Lösung O 2-Konzentration, vor allem in der Voxel in der Nähe der Cyanobakterien. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1: Energie-Ebenen in Elektronen-Spin-Resonanz. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2: Typische Sauerstoffkonzentration Bild einer tumortragenden Maus. Das Bild links zeigt die anatomischen Informationen, auf einem MRT-Bild basiert. Ein stabiles freies organisches Radikal war es, die Maus injiziert und dessen ESR Eigenschaften bieten die Sauerstoffkonzentration an seine Umwelt (rechts). ESR-basierte Ergebnisse sind in der MRT anatomischen Bild überlagert. Sehfeld von 32 mm. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3: Zwei Beispiele für hochauflösende Mikro-Maßstab ESR Bilder von photolithographisch erzeugte Probe mit N @ C 60 Pulver (links) und LiPc paramagnetischen Kristallen (rechts) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4: Typische Hahn bildgebenden Pulssequenz zeigt der Mikrowelle (MW) und Steigung, G x, G y und G z Impulse. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5: Typische Rohdaten ESR Mikro-Bilder: a, b und c sind Rohdaten der Cyanobakterium Probe ohne Beleuchtung für τ gemessen = 500600700 ns bzw.. Items d, e, und sind die gleichen wie a, b und c, aber mit Beleuchtung. Die Intensität ist in willkürlichen Maßstab aufgetragen (ist aber in jedem Satz von drei dunkle oder helle Rohdaten Bilder konsistent) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig6.jpg" alt="Abbildung 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 6"> Abbildung 6: Amplitude entsprechendes Bild der radikalen Konzentration in der Lösung (willkürliche Skala). <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig7.jpg" alt="Abbildung 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 7"> Abbildung 7: T 2 Bilder und die entsprechenden [O 2] Werte unter dunkel (links) und Licht (rechts) Bedingungen.

<ol><li>Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-imaging+of+Oxygen+Concentration+near+Live+Photosynthetic+Cells+by+Electron+Spin+Resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance.</a> Biophysical Journal. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESR+imaging+in+solid+phase+down+to+sub-micron+resolution%3A+methodology+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications.</a> J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).</li>
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</ol>

Dieses Protokoll zeigt, wie ESR Mikro-Imaging eingesetzt werden, um Sauerstoff-Konzentration in der Nähe leben, kleine Proben abzubilden. Eine räumliche Auflösung von ca. 30 x 30 x 100 pm nachgewiesen wird, mit nahezu mikromolaren Sauerstoffkonzentration Sensitivität und sub-Femtomol absolute Sauerstoffempfindlichkeit pro Voxel. Der Einsatz von ESR Mikro-Imaging für Sauerstoff-Mapping in der Nähe Zellen ergänzt die derzeit verfügbaren Techniken der Mikro-Elektroden oder Fluoreszenz / Phosphoreszenz basiert. Darüber hinaus mit der richtigen paramagnetischen Sonde, wird es leicht anwendbar für die intrazelluläre Sauerstoff-Mikro-Imaging, eine Fähigkeit, die andere Methoden finden, sehr schwer zu erreichen. In naher Zukunft planen wir auf eine weitere Verbesserung dieser Methodik zu leben Probe Bilder mit einer Auflösung von wenigen Mikrometern zu schaffen, bietet dagegen Parameter wie Superoxid-Konzentration, Säuregrad (pH), Sonde Diffusionskoeffizienten und, natürlich, Sauerstoffkonzentration. Diese Fähigkeiten sind komplementär zu den aktuellen optischen-basierten Methoden sowohl in Bezug auf Kontrast-Typ und auch von Proben Merkmale (z. B. nicht-transparenten dicken Proben und in einigen Fällen intrazellulären vs extrazelluläre Messungen).

<table><tbody><tr><td>Zentrifuge </td><td>Kendro</td><td>Heraus, 75003235</td><td></td></tr><tr><td>Perdeuterierter triarylmethyli (Trityl)radikal</td><td>Novosibirsk</td><td></td><td>In Novosibirsk nach der in Referenz &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; beschriebenen Methode synthetisiert.</td></tr><tr><td>BG-11-Puffer</td><td></td><td></td><td>Zur Anleitung zur Herstellung siehe Schema 1 und die Referenzen 8, 9.</td></tr><tr><td>Spritze</td><td>Hamilton Co</td><td>Microliter 7000.5</td><td></td></tr><tr><td>UV-Härtung</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA63 oder NOA61.</td><td></td></tr></tbody></table>

elektronen-spin-resonanz-micro-imaging an lebenden spezies, bei oxygen mapping

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

Dieses Protokoll beschreibt ein Elektron-Spin-Resonanz (ESR) Mikro-Imaging-Methode zur dreidimensionalen Abbildung von Sauerstoff in der unmittelbaren Umgebung lebende Zellen mit Mikrometer-Skala Auflösung 1. Sauerstoff ist eines der wichtigsten Moleküle in den Kreislauf des Lebens. Es dient als terminaler Elektronenakzeptor der oxidativen Phosphorylierung in den Mitochondrien und ist in der Produktion von reaktiven Sauerstoff-Spezies verwendet. Messungen der Sauerstoff für das Studium der Mitochondrien und Stoffwechselfunktionen, Signalwege, die Auswirkungen der verschiedenen Reize, Membranpermeabilität und Krankheit Differenzierung wichtig. Sauerstoffverbrauch ist daher eine informative Marker des zellulären Stoffwechsels, die weitgehend für die verschiedenen biologischen Systemen aus den Mitochondrien von Zellen bis zu ganzen Organismen ist. Aufgrund seiner Bedeutung ist, haben viele Methoden für die Messung von Sauerstoff in Live-Systemen entwickelt. Aktuelle Versuche, hochauflösenden Sauerstoff Bildgebung bieten sich vor allem auf optische Fluoreszenz und Phosphoreszenz Methoden, um zufriedenstellende Ergebnisse zu erzielen, wie sie Sonden mit hoher Bild-Toxizität und geringe Empfindlichkeit gegenüber Sauerstoff beschäftigen scheitern basiert. ESR, die das Signal vom exogenen paramagnetischen Sonden in der Probe misst, ist bekannt, dass sehr genaue Messungen der Sauerstoffkonzentration liefern. In einem typischen Fall map ESR-Messungen der Sonde Linienform Verbreiterung und / oder Entspannungs-Zeit verkürzen, die direkt an der lokalen Sauerstoffkonzentration verbunden. (Sauerstoff ist paramagnetisch; daher beim Zusammenstoß mit der exogenen paramagnetischen Sonde, Kurzatmigkeit sie ihren Relaxationszeiten.) Traditionell diese Art von Experimenten mit niedriger Auflösung, Millimeter-Skala ESR für Kleintiere Imaging durchgeführt. Hier zeigen wir, wie ESR Bildgebung kann auch in den Mikrometer-Maßstab durchgeführt werden für die Untersuchung von kleinen Live-Proben. ESR Mikro-Imaging ist eine relativ neue Methode, die den Erwerb von ortsaufgelösten ESR-Signale mit einer Auflösung von fast 1 Mikron bei Raumtemperatur 2 ermöglicht. Das Hauptziel dieses Protokoll-Papier ist zu zeigen, wie diese neue Methode, zusammen mit neu entwickelten Sauerstoff-sensitive Sonden kann die Zuordnung der Sauerstoffgehalt in kleine Live-Proben angewandt werden. Eine räumliche Auflösung von ca. 30 x 30 x 100 pm nachgewiesen wird, mit nahezu mikromolaren Sauerstoffkonzentration Sensitivität und sub-Femtomol absolute Sauerstoffempfindlichkeit pro Voxel. Der Einsatz von ESR Mikro-Imaging für Sauerstoff-Mapping in der Nähe Zellen ergänzt die derzeit verfügbaren Techniken der Mikro-Elektroden oder Fluoreszenz / Phosphoreszenz basiert. Darüber hinaus mit der richtigen paramagnetischen Sonde, wird es auch leicht anwendbar für die intrazelluläre Sauerstoff-Mikro-Imaging, eine Fähigkeit, die andere Methoden finden, sehr schwer zu erreichen.

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für Mikrometer-Skala dreidimensionale Bildgebung der Sauerstoffkonzentration in der unmittelbaren Umgebung der lebenden Zellen durch Elektronen-Spin-Resonanz-Mikroskopie.

Elektronen-Spin-Resonanz-Micro-Imaging an lebenden Spezies, bei Oxygen Mapping

Dieses Protokoll beschreibt eine Mikro-Imaging-Methode mittels Elektronenspinresonanz (ESR) zur dreidimensionalen Kartierung von Sauerstoffgehalten in der unmittelbaren Umgebung ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, dreidimensionale Bilder der Sauerstoffkonzentration im unmittelbaren Umfeld lebender Zellen mit einer Auflösung im Mikrometerbereich mittels Elektronenspinresonanz- oder ESR-Mikroskopie zu erhalten. Das Protokoll wird an Cyanobakterien demonstriert, die häufig vorkommende photosynthetisch aktive Zellen darstellen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Probe aus Cyanobakterienzellen in der Probenhalterung für die ESR-Mikroskopie vorbereitet wird.Eingebettet in eine stabile organische Radikallösung. Der Probenträger wird in die Abbildungsprobenhalterung eingesetzt, die anschließend in das statische Elektromagnet des ESR-Mikroskopsystems gebracht wird. Anschließend werden mehrere dreidimensionale ESR-Mikrobilder der organischen Radikallösung mit dem ESR-Mikroskop aufgenommen.Dies wird für mehrere Varianten von Impulssequenzen durchgeführt und häufig unter verschiedenen äußeren Bedingungen, beispielsweise unter Licht- und Dunkelheitbedingungen. Anschließend werden die Bilddaten mit dem Computer verarbeitet, um die dreidimensional räumlich aufgelösten Relaxationszeiten des Radikals zu extrahieren. Diese Relaxationszeiten liefern über eine vorab vorhandene Kalibrierung ein direktes Maß für die Sauerstoffkonzentration und ermöglichen so die Erstellung vollständiger dreidimensionaler Sauerstoffverteilungskarten der untersuchten Proben unter verschiedenen äußeren Bedingungen.Es werden Ergebnisse erhalten, die eindeutig zeigen, dass die Cyanobakterien keine Sauerstoffproduktion aufweisen, wenn kein Licht angelegt wird. Darüber hinaus wird gezeigt, dass unter Lichtbestrahlung signifikante Sauerstoffgradienten und Sauerstoffheterogenitäten in der Nähe der Cyanobakterienzellen entstehen. Hallo, ich bin al aus dem Labor von BLA an der S Fakultät für Chemie am Technion, dem israelischen Institut für Technologie in Haifa.Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Abbildung der Sauerstoffkonzentration in der Nähe lebender Zellen in dreidimensionaler Weise mit hoher räumlicher Auflösung mittels FISE-ARM-Mikroskopie. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Sauerstoffverbrauchsrate und die metabolische Aktivität von Zellen zu untersuchen. Beginnen wir also.Die Elektronenspinresonanz oder ESR ist eine spektroskopische Methode, bei der elektromagnetische Strahlung einer bestimmten Frequenz von paramagnetischen Spezies mit ungepaarten Elektronenspins absorbiert wird, die sich in einem äußeren statischen Magnetfeld befinden. Sie ist eine leistungsfähige Methode zur Untersuchung der Umgebung paramagnetischer Moleküle in lebenden Organismen, einschließlich der Konzentrationen von Sauerstoff und reaktiven Sauerstoffspezies. Hier wird ein typisches Bild der Sauerstoffkonzentration bei einer Maus mit Tumor für heterogene Proben gezeigt.Die ESR-spektrale Information kann räumlich aufgelöst durch die Verwendung magnetischer Feldgradienten gewonnen werden. Ein stabiler, freier organischer Radikal wurde in die Maus injiziert, und seine ESR-Eigenschaften liefern die Sauerstoffkonzentration in seiner Umgebung. Die auf ESR basierenden Ergebnisse werden überlagert mit einem MRT-anatomischen Bild dargestellt.Bisher wurden solche ESR-Abbildungstechniken an lebenden Proben nur mit relativ großen, im Millimeterbereich liegenden Proben durchgeführt. Die ESR-Mikroskopie umfasst die Messung von Proben im Millimeter- und Submillimeterbereich und liefert dreidimensionale ESR-Bilder mit einer Auflösung nahe einem Mikrometer.Hier sind zwei Beispiele einer hochauflösenden, mikrometergroßen ESR-Aufnahme, Bilder einer erzeugten Probe mit NNC-60-Pulver und paramagnetischen Lithiumferrocyanid-Kristallen. Ein ESR-Mikroskop ähnelt einem herkömmlichen ESR-Spektrometer und verfügt über einen Magneten zur Erzeugung des statischen Feldes, ein Mikrowellensystem zur Anregung der Spins und zur Signaldetektion, eine Sonde zur Halterung der Probe sowie eine computerisierte Konsole zur Steuerung des Erfassungsprozesses und der Datenverarbeitung. Weitere Bestandteile des Systems sind Gradientenstromtreiber, die Teil des elektronischen Systems sind, sowie Gradientenspulen, die sich in der Bildgebungs-Sonde befinden.Die Gradientenspulen weisen ebenfalls eine Öffnung auf, die eine Lichtbestrahlung der Probe ermöglicht. Es wird kontrolliert temperierte, feuchte Luft auf die Probe gegeben, um eine minimale Dehydrierung während des Experiments sicherzustellen. Die wichtigsten besonderen Merkmale der ESR-Mikroskopie sind die geringe Größe der Sonde und der Gradientenspulen, die höhere Spinsensitivität des Systems sowie die hohe Leistungsfähigkeit der magnetischen Feldgradiententreiber. Vor Beginn dieses Verfahrens ist eine Cyanobakterien-Suspension mit einer Konzentration von 40 Milligramm pro Milliliter herzustellen.Um mit der Probenvorbereitung für die ESR-Mikroabbildung zu beginnen, nehmen Sie mit feinen Pinzetten einige Quadrate aus saugfähigem Papier mit einer Größe von etwa 400 mal 400 Mikrometern. Anschließend geben Sie diese in ein Eppendorf-Röhrchen. Danach füllen Sie das Röhrchen mit 1,2 Millilitern der Cyanobakterien-Suspension. Anschließend die Suspension zwei Minuten lang bei 6.000 U/min in einer Mikrozentrifuge zentrifugieren; nach der Zentrifugation den Überstand vollständig entfernen, bis auf etwa 50 Mikroliter, die zurückgelassen werden, um eine Austrocknung der Cyanobakterien zu vermeiden. Dieser Vorgang führt dazu, dass das saugfähige Papier mit den Cyanobakterienzellen gesättigt wird. Danach einen speziell vorbereiteten, cupähnlichen Glasprobenhalter bereitstellen, einige Fasern mithilfe feiner Pinzette aus dem Papier entnehmen und sie auf den Boden des Probenhalters legen.Danach drei Millimolar Tridel und BG-11-Lösung hinzufügen, die gemäß dem schriftlichen Protokoll mit einem Achtel der Spritze hergestellt wird. Dann den Probenhalter mit UV-härtbarem Kleber versiegeln, indem der Kleber zwischen die Kanten des Glasprobenhalters und das dazugehörige Deckglas aufgetragen wird, wobei eine kleine Luftöffnung offen bleibt. Schließlich den Kleber für zwei Sekunden mit UV-Licht aushärten.Um das Abbildungsexperiment zu beginnen, schalten Sie das ESR-Mikroabbildungssystem ein und geben Sie die Probe in den Resonator, der sich innerhalb der Abbildungssonde befindet. Stellen Sie nun mithilfe der Computersteuerungssoftware das System auf Abstimmmodus und ermitteln Sie die Resonanz-Mikrowellenfrequenz der Sonde, die für die ESR-Messungen verwendet wird. Danach stellen Sie das statische Magnetfeld auf den Wert ein, der mit der angelegten Mikrowellenfrequenz übereinstimmt.Stellen Sie die Zeitparameter für die Pulsserie ein und beobachten Sie das ESR-Signal, um sicherzustellen, dass das System ordnungsgemäß funktioniert und die Probe gut vorbereitet ist. Danach stellen Sie die Bildgebungsparameter wie die Anzahl der Pixel, die Stärke der Gradienten und die Dauer der Gradientenpulse auf die erforderlichen Werte ein. Nach der Einrichtung erfassen Sie drei 3D-ESR-Bilder mittels einer Han-Echo-Bildgebungspulssequenz mit Zwischenpulsabständen (tau) von 500, 600 und 700 Nanosekunden.Zu diesem Zeitpunkt das Licht, das auf die Probe projiziert wird, bei Bedarf für die experimentellen Bedingungen während der Aufnahme einschalten; die Daten werden automatisch gespeichert. Nach dem Datenerfassungsprozess werden die Rohdatendateien über ein MATLAB-Software-Skript verarbeitet. Mit der Software werden Bilder der Konzentration des Trill-Radikals und der Relaxationszeit erzeugt.T zwei wird verwendet, um diese Bilder abzubilden und anschließend mithilfe einer vorbestehenden Kalibrierungskurve, die die Sauerstoffkonzentration mit der Relaxationszeit verknüpft, in ein Sauerstoffkonzentrationsbild zu überführen. Dabei ist T zwei null die Spin-Spin-Relaxationszeit der Sonde unter anoxischen Bedingungen, die von der Konzentration C der Sonde und ihrem Diffusionskoeffizienten D abhängt. Typische Rohbilddaten aus mehreren dreidimensionalen ESR-Bildgebungsexperimenten an Cyanobakterien werden gezeigt. Diese Bilder wurden mit verschiedenen τ-Werten entweder im Dunkeln oder unter Lichteinfluss aufgenommen.Unter dunklen Bedingungen sind die Ergebnisse sehr ähnlich, mit Ausnahme einer verringerten Intensität bei größeren T-Werten aufgrund der Spin-Spin-Relaxationszeit T zwei. Umgekehrt verändert sich unter Lichtbestrahlung das Bildmuster aufgrund unterschiedlicher Relaxationszeiten im gesamten Probenmaterial. Diese Daten werden anschließend verarbeitet, um aus diesem Bild ein Amplitudenbild zu erhalten.Es ist ersichtlich, dass sich die Cyanobakterien hauptsächlich auf der rechten Seite des Probenhalters befinden. Die beiden Bilder werden mithilfe einer vorab erstellten Kalibrierungskurve, die die Sauerstoffkonzentration mit der Relaxationszeit verknüpft, in Sauerstoffkonzentrationswerte umgerechnet. Die Ergebnisse werden für Cyanobakterien in Gegenwart und Abwesenheit von Licht gezeigt.Es ist ersichtlich, dass die Sauerstoffproduktion durch Licht eingeleitet wird und eine signifikante Erhöhung der Sauerstoffkonzentration in der Lösung verursacht. Dies führt zu einer Abnahme des Radikals T zwei, vor allem in den Voxel in der Nähe der absorbierenden Papierfasern mit den Cyanobakterien. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man eine Probe mit lebenden Zellen und stabilen freien Radikalen zur Abbildung der Sauerstoffkonzentration mittels ESR-Mikroskopie vorbereitet. Bei dieser Prozedur ist es wichtig, daran zu denken, dass sie so kurz wie möglich gehalten werden sollte, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten und einer Zerstörung der Probe vorzubeugen.Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg mit Ihrem Experiment.

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Elektronenspin-Resonanz (EPR)-Spektroskopie wurde eingesetzt, um Stickoxid aus Rinder-Endothelzellen und Superoxidradikalanion von menschlichen Neutrophilen unter Verwendung von Eisen (II)-N-Methyl-D-glucamin Dithiocarbamat, Fe (MGD)...

Nachweis von Stickstoffmonoxid und Superoxid-Radikalanion von paramagnetischer Resonanzspektroskopie von Zellen mit Spinfallen

Zeitraffer-Mikroskopie von fluoreszenzmarkierten Autophagie Marker erlaubt die Überwachung der dynamischen Autophagie Reaktion mit hoher zeitlicher Auflösung. Mit spezifischen Autophagie und Organellen Marker in einer Kombination aus 3 verschiedenen Farben, können wir folgen den Beitrag eines Proteins an Autophagosom Bildung in einem robusten räumlichen und zeitlichen Kontext.

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Eine neue Elektronenspinresonanz (EPR) Verfahren, schnelle Scan - EPR (RS-EPR) wird für 2D - spektrale räumliche Abbildung gezeigt , die auf die traditionelle kontinuierliche Welle (CW) Technik überlegen ist , und eröffnet neue Orte für in - vivo - Bildgebung. Die Ergebnisse werden bei 250 MHz gezeigt, aber die Technik ist bei jeder Frequenz anwendbar.

Rapid-Scan-Elektronenspinresonanz eröffnet neue Wege für Imaging Physiologisch Wichtige Parameter<em&gt; In Vivo</em

Wir beschreiben die Verwendung einer neuartigen, Frequenzbereichs-Lumineszenz-Lebensdauerkamera zur Kartierung von 2D O2-Verteilungen mit optischen Sensorfolien. Das Kamerasystem und die Bildanalyseverfahren werden zusammen mit der Vorbereitung, Kalibrierung und Anwendung von Sensorfolien zur Visualisierung der O 2-Mikroumgebung in der Rhizosphäre von Wasserpflanzen beschrieben.

Lumineszenz-Lebensdauer-Bildgebung von O2 mit einem Frequency-Domain-basierten Kamerasystem

Das Protokoll beschreibt die Hochdurchsatz-Sphäroiderzeugung für Bioprinting unter Verwendung der multiparametrischen Analyse ihrer Oxygenierung und ihres Zelltods auf einem Standardfluoreszenzmikroskop. Dieser Ansatz kann angewendet werden, um die Lebensfähigkeit der Sphäroide zu kontrollieren und eine Standardisierung durchzuführen, die für die Modellierung von 3D-Gewebe, Tumormikroumgebung und erfolgreicher (Mikro-) Gewebebiofabrikation wichtig ist.

Erschwingliche Sauerstoffmikroskopie-unterstützte Biofabrikation von mehrzelligen Sphäroiden

Dieser Artikel beschreibt die Verwendung eines neuen, schnellen optischen Bildgebungsgeräts für die makroskopische Photolumineszenz-Lebensdauer-Bildgebung von Proben mit langem Zerfall. Die Integrations-, Bildaufnahme- und Analyseverfahren werden ebenso beschrieben wie die Präparation und Charakterisierung der Sensormaterialien für die Bildgebung und die Anwendung des Imagers bei der Untersuchung biologischer Proben.

Fluoreszenzlebensdauer-Makro-Imager für biomedizinische Anwendungen

Wir stellen ein Protokoll vor, um metabolische Aktivitäten in Zellen, die durch Aminosäuren reguliert werden, direkt sichtbar zu machen, indem wir Deuteriumoxid (schweres Wasser D2O) mit sondierter stimulierter Raman-Streuung (DO-SRS) verwenden, die in die Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenzmikroskopie (2PEF) integriert ist.

Bioorthogonale chemische Bildgebung des Zellstoffwechsels, der durch aromatische Aminosäuren reguliert wird

Quantitative 3D-Sauerstoffkarten von murinen Tumoren wurden nichtinvasiv mit Hilfe der Pulselektronen-Paramagnetischen Resonanz abgebildet. Ultraschall B-Modus und Power-Doppler wurden für die Anatomie und den Gefäßaufbau eingesetzt. Bilder aus beiden Modalitäten wurden überlagert, um eine multiparametrische Tumoranalyse zu ermöglichen.

Beurteilung der Tumorhypoxie: In vivo 3D-Sauerstoffbildgebung durch paramagnetische Elektronenresonanz 

Unter Verwendung einer multimodalen Plattform, die markierungsfreie optische Bildgebungsmodalitäten kombiniert, haben wir ein Protokoll zur Visualisierung und Quantifizierung der zellulären Dynamik und des Stoffwechsels entwickelt. Durch Bildgebung mittels Multiphotonenfluoreszenz, Erzeugung der zweiten Harmonischen und stimulierte Raman-Streumikroskopie können wir einen ganzheitlichen Überblick über die zelluläre und molekulare Umgebung erhalten.

Multimodale optische Bildgebungsplattform zur Untersuchung des zellulären Stoffwechsels

Wir führten eine neuartige Bildgebungstechnik namens Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT) ein, die eine unvoreingenommene Bildgebung aller Zellen in Hirnproben auf Mesoskala ermöglicht und nahtlos in den Bildablauf der bandbasierten seriellen Rasterelektronenmikroskopie an derselben Probe integriert werden kann.

Eine optische Bildgebungsmethode mit Rasterelektronenmikroskopie zur mesoskopischen Allzell-Gehirnkartierung

Lernen Sie die dreidimensionale ESR-Mikroskopie zur Sauerstoffkonzentrationsmessung an lebenden Zellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Cyanobakterien und deren Photosyntheseaktivität.

Elektronen-Spin-Resonanz-Micro-Imaging an lebenden Spezies, bei Oxygen Mapping

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