Elektronen-Spin-Resonanz-Micro-Imaging an lebenden Spezies, bei Oxygen Mapping

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, dreidimensionale Bilder der Sauerstoffkonzentration im unmittelbaren Umfeld lebender Zellen mit einer Auflösung im Mikrometerbereich mittels Elektronenspinresonanz- oder ESR-Mikroskopie zu erhalten. Das Protokoll wird an Cyanobakterien demonstriert, die häufig vorkommende photosynthetisch aktive Zellen darstellen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Probe aus Cyanobakterienzellen in der Probenhalterung für die ESR-Mikroskopie vorbereitet wird.

Eingebettet in eine stabile organische Radikallösung. Der Probenträger wird in die Abbildungsprobenhalterung eingesetzt, die anschließend in das statische Elektromagnet des ESR-Mikroskopsystems gebracht wird. Anschließend werden mehrere dreidimensionale ESR-Mikrobilder der organischen Radikallösung mit dem ESR-Mikroskop aufgenommen.

Dies wird für mehrere Varianten von Impulssequenzen durchgeführt und häufig unter verschiedenen äußeren Bedingungen, beispielsweise unter Licht- und Dunkelheitbedingungen. Anschließend werden die Bilddaten mit dem Computer verarbeitet, um die dreidimensional räumlich aufgelösten Relaxationszeiten des Radikals zu extrahieren. Diese Relaxationszeiten liefern über eine vorab vorhandene Kalibrierung ein direktes Maß für die Sauerstoffkonzentration und ermöglichen so die Erstellung vollständiger dreidimensionaler Sauerstoffverteilungskarten der untersuchten Proben unter verschiedenen äußeren Bedingungen.

Es werden Ergebnisse erhalten, die eindeutig zeigen, dass die Cyanobakterien keine Sauerstoffproduktion aufweisen, wenn kein Licht angelegt wird. Darüber hinaus wird gezeigt, dass unter Lichtbestrahlung signifikante Sauerstoffgradienten und Sauerstoffheterogenitäten in der Nähe der Cyanobakterienzellen entstehen. Hallo, ich bin al aus dem Labor von BLA an der S Fakultät für Chemie am Technion, dem israelischen Institut für Technologie in Haifa.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Abbildung der Sauerstoffkonzentration in der Nähe lebender Zellen in dreidimensionaler Weise mit hoher räumlicher Auflösung mittels FISE-ARM-Mikroskopie. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Sauerstoffverbrauchsrate und die metabolische Aktivität von Zellen zu untersuchen. Beginnen wir also.

Die Elektronenspinresonanz oder ESR ist eine spektroskopische Methode, bei der elektromagnetische Strahlung einer bestimmten Frequenz von paramagnetischen Spezies mit ungepaarten Elektronenspins absorbiert wird, die sich in einem äußeren statischen Magnetfeld befinden. Sie ist eine leistungsfähige Methode zur Untersuchung der Umgebung paramagnetischer Moleküle in lebenden Organismen, einschließlich der Konzentrationen von Sauerstoff und reaktiven Sauerstoffspezies. Hier wird ein typisches Bild der Sauerstoffkonzentration bei einer Maus mit Tumor für heterogene Proben gezeigt.

Die ESR-spektrale Information kann räumlich aufgelöst durch die Verwendung magnetischer Feldgradienten gewonnen werden. Ein stabiler, freier organischer Radikal wurde in die Maus injiziert, und seine ESR-Eigenschaften liefern die Sauerstoffkonzentration in seiner Umgebung. Die auf ESR basierenden Ergebnisse werden überlagert mit einem MRT-anatomischen Bild dargestellt.

Bisher wurden solche ESR-Abbildungstechniken an lebenden Proben nur mit relativ großen, im Millimeterbereich liegenden Proben durchgeführt. Die ESR-Mikroskopie umfasst die Messung von Proben im Millimeter- und Submillimeterbereich und liefert dreidimensionale ESR-Bilder mit einer Auflösung nahe einem Mikrometer.

Hier sind zwei Beispiele einer hochauflösenden, mikrometergroßen ESR-Aufnahme, Bilder einer erzeugten Probe mit NNC-60-Pulver und paramagnetischen Lithiumferrocyanid-Kristallen. Ein ESR-Mikroskop ähnelt einem herkömmlichen ESR-Spektrometer und verfügt über einen Magneten zur Erzeugung des statischen Feldes, ein Mikrowellensystem zur Anregung der Spins und zur Signaldetektion, eine Sonde zur Halterung der Probe sowie eine computerisierte Konsole zur Steuerung des Erfassungsprozesses und der Datenverarbeitung. Weitere Bestandteile des Systems sind Gradientenstromtreiber, die Teil des elektronischen Systems sind, sowie Gradientenspulen, die sich in der Bildgebungs-Sonde befinden.

Die Gradientenspulen weisen ebenfalls eine Öffnung auf, die eine Lichtbestrahlung der Probe ermöglicht. Es wird kontrolliert temperierte, feuchte Luft auf die Probe gegeben, um eine minimale Dehydrierung während des Experiments sicherzustellen. Die wichtigsten besonderen Merkmale der ESR-Mikroskopie sind die geringe Größe der Sonde und der Gradientenspulen, die höhere Spinsensitivität des Systems sowie die hohe Leistungsfähigkeit der magnetischen Feldgradiententreiber. Vor Beginn dieses Verfahrens ist eine Cyanobakterien-Suspension mit einer Konzentration von 40 Milligramm pro Milliliter herzustellen.

Um mit der Probenvorbereitung für die ESR-Mikroabbildung zu beginnen, nehmen Sie mit feinen Pinzetten einige Quadrate aus saugfähigem Papier mit einer Größe von etwa 400 mal 400 Mikrometern. Anschließend geben Sie diese in ein Eppendorf-Röhrchen. Danach füllen Sie das Röhrchen mit 1,2 Millilitern der Cyanobakterien-Suspension.

Anschließend die Suspension zwei Minuten lang bei 6.000 U/min in einer Mikrozentrifuge zentrifugieren; nach der Zentrifugation den Überstand vollständig entfernen, bis auf etwa 50 Mikroliter, die zurückgelassen werden, um eine Austrocknung der Cyanobakterien zu vermeiden. Dieser Vorgang führt dazu, dass das saugfähige Papier mit den Cyanobakterienzellen gesättigt wird. Danach einen speziell vorbereiteten, cupähnlichen Glasprobenhalter bereitstellen, einige Fasern mithilfe feiner Pinzette aus dem Papier entnehmen und sie auf den Boden des Probenhalters legen.

Danach drei Millimolar Tridel und BG-11-Lösung hinzufügen, die gemäß dem schriftlichen Protokoll mit einem Achtel der Spritze hergestellt wird. Dann den Probenhalter mit UV-härtbarem Kleber versiegeln, indem der Kleber zwischen die Kanten des Glasprobenhalters und das dazugehörige Deckglas aufgetragen wird, wobei eine kleine Luftöffnung offen bleibt. Schließlich den Kleber für zwei Sekunden mit UV-Licht aushärten.

Um das Abbildungsexperiment zu beginnen, schalten Sie das ESR-Mikroabbildungssystem ein und geben Sie die Probe in den Resonator, der sich innerhalb der Abbildungssonde befindet. Stellen Sie nun mithilfe der Computersteuerungssoftware das System auf Abstimmmodus und ermitteln Sie die Resonanz-Mikrowellenfrequenz der Sonde, die für die ESR-Messungen verwendet wird. Danach stellen Sie das statische Magnetfeld auf den Wert ein, der mit der angelegten Mikrowellenfrequenz übereinstimmt.

Stellen Sie die Zeitparameter für die Pulsserie ein und beobachten Sie das ESR-Signal, um sicherzustellen, dass das System ordnungsgemäß funktioniert und die Probe gut vorbereitet ist. Danach stellen Sie die Bildgebungsparameter wie die Anzahl der Pixel, die Stärke der Gradienten und die Dauer der Gradientenpulse auf die erforderlichen Werte ein. Nach der Einrichtung erfassen Sie drei 3D-ESR-Bilder mittels einer Han-Echo-Bildgebungspulssequenz mit Zwischenpulsabständen (tau) von 500, 600 und 700 Nanosekunden.

Zu diesem Zeitpunkt das Licht, das auf die Probe projiziert wird, bei Bedarf für die experimentellen Bedingungen während der Aufnahme einschalten; die Daten werden automatisch gespeichert. Nach dem Datenerfassungsprozess werden die Rohdatendateien über ein MATLAB-Software-Skript verarbeitet. Mit der Software werden Bilder der Konzentration des Trill-Radikals und der Relaxationszeit erzeugt.

T zwei wird verwendet, um diese Bilder abzubilden und anschließend mithilfe einer vorbestehenden Kalibrierungskurve, die die Sauerstoffkonzentration mit der Relaxationszeit verknüpft, in ein Sauerstoffkonzentrationsbild zu überführen. Dabei ist T zwei null die Spin-Spin-Relaxationszeit der Sonde unter anoxischen Bedingungen, die von der Konzentration C der Sonde und ihrem Diffusionskoeffizienten D abhängt. Typische Rohbilddaten aus mehreren dreidimensionalen ESR-Bildgebungsexperimenten an Cyanobakterien werden gezeigt. Diese Bilder wurden mit verschiedenen τ-Werten entweder im Dunkeln oder unter Lichteinfluss aufgenommen.

Unter dunklen Bedingungen sind die Ergebnisse sehr ähnlich, mit Ausnahme einer verringerten Intensität bei größeren T-Werten aufgrund der Spin-Spin-Relaxationszeit T zwei. Umgekehrt verändert sich unter Lichtbestrahlung das Bildmuster aufgrund unterschiedlicher Relaxationszeiten im gesamten Probenmaterial. Diese Daten werden anschließend verarbeitet, um aus diesem Bild ein Amplitudenbild zu erhalten.

Es ist ersichtlich, dass sich die Cyanobakterien hauptsächlich auf der rechten Seite des Probenhalters befinden. Die beiden Bilder werden mithilfe einer vorab erstellten Kalibrierungskurve, die die Sauerstoffkonzentration mit der Relaxationszeit verknüpft, in Sauerstoffkonzentrationswerte umgerechnet. Die Ergebnisse werden für Cyanobakterien in Gegenwart und Abwesenheit von Licht gezeigt.

Es ist ersichtlich, dass die Sauerstoffproduktion durch Licht eingeleitet wird und eine signifikante Erhöhung der Sauerstoffkonzentration in der Lösung verursacht. Dies führt zu einer Abnahme des Radikals T zwei, vor allem in den Voxel in der Nähe der absorbierenden Papierfasern mit den Cyanobakterien. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man eine Probe mit lebenden Zellen und stabilen freien Radikalen zur Abbildung der Sauerstoffkonzentration mittels ESR-Mikroskopie vorbereitet. Bei dieser Prozedur ist es wichtig, daran zu denken, dass sie so kurz wie möglich gehalten werden sollte, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten und einer Zerstörung der Probe vorzubeugen.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg mit Ihrem Experiment.