Gramicidin-basierte Fluoreszenz-Assay; zur Bestimmung Small Molecules Potential für das Ändern von Lipid-Doppelschicht-Eigenschaften

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, arzneimittelinduzierte Veränderungen der Doppelschichteigenschaften zu messen, die von Doppelschicht-übergreifenden Proteinen wahrgenommen werden. Dies wird erreicht, indem zunächst mit Fluor beladene, große, einseitige Sles hergestellt werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Vesikel mit Gramin zu dotieren.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, einen externen Quencher hinzuzufügen und die Abschreckgeschwindigkeit des internen Fluoros zu messen. Vier. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Änderung der Fluor-Quenchung pro Grammin-Aktivität zu quantifizieren, indem eine gestreckte Exponentialfunktion an den Fluoreszenzzeitverlauf angepasst wird. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, um zu bewerten, ob amfi-Dateien die Eigenschaften von Lipiddoppelschichten verändern können.

Hallo, ich bin Ola Anderson. Hallo, ich bin Helson. Hallo, ich bin Richie Kapo.

Und ich bin Leah Sanford aus dem Labor von Dr. Olaf Anderson in der Abteilung für Physiologie und Biophysik am Weill Cornell Medical College. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Messung von Veränderungen der Eigenschaften von Lipid-Bioschichten. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Auswirkungen von Medikamenten und kleinen Molekülen auf die bilaren Eigenschaften der Lipide zu untersuchen.

Fangen wir also an Am ersten Tag dieses Verfahrens nehmen Sie das Lipid aus dem Gefrierschrank und lassen Sie es auf Raumtemperatur ausgleichen. Nach dem Äquilibrieren werden 0,6 Milliliter à 25 Milligramm je Milliliter, Lipid- und Chloroformlösung in einen 25-Milliliter-Rundkolben gegeben. Dann trocknet man die Lösung unter Stickstoffgas und dreht den Kolben so lange, bis das gesamte Chloroform verdampft ist.

Und ein dünner weißer Lipidfilm umhüllt die gesamte untere Hälfte des Kolbens, trocknet das Lipid über Nacht in einem Trockenmittel unter Vakuum weiter. Bereiten Sie eine Lösung aus 100 Millimolar Natriumnitrat, 25 Millimolar, A NTS und 10 Millimolar HEPs mit einem pH-Wert von sieben vor. Vermeiden Sie bei der Einstellung des pH-Werts dieser Lösung chloridhaltige Lösungen.

Da der Thallium-Quencher am zweiten Tag einen unlöslichen Komplex mit dem Chlorid bildet, rehydrieren Sie die Lipide in 1.67. Ein Milliliter dieser Elektrolytlösung, um eine 10 millimolare Lipidsuspension zu erhalten. Sobald die richtige Konzentration erreicht ist, die Suspension mit Parafolie abdecken und vortexen, die Probe gründlich mit Folie vor Licht schützen und über Nacht bei Raumtemperatur altern lassen.

Am dritten Tag beschallen Sie die Mischung eine Minute lang in einem Ultraschallat mit geringer Leistung. Dann die Probe fünf Minuten lang auf Trockeneis auftauen, gefolgt von fünf Minuten in warmem Wasser, und den Gefrierauftauzyklus vier- bis fünfmal wiederholen. Extrudieren Sie die Lipidsuspension mit einem Avanti Mini-Extruder.

Richten Sie den Mini-Extruder mit einem 0,1-Mikron-Polycarbonat-Filter ein, und die Filterstützen extrudieren die Suspension 21 Mal hin und her, so dass eine fast durchscheinende Suspension in der gegenüberliegenden Spritze landet, was zu einem großen ularen Vesikel oder einer LUV-Suspension führt. Entfernen Sie externes A NTS, indem Sie die extrudierte Suspension über eine PD 10-Dulingsäule laufen lassen, die mit Natriumpuffer äquilibriert wurde. Geben Sie 1,5 Milliliter der LUV-Suspension plus einen Milliliter Natriumpuffer in die Säule.

Nachdem die Lösung vollständig in die Säule eingearbeitet wurde, eluieren Sie die Liposomen mit drei Millilitern Natriumpuffer und sammeln Sie das Eluat. Die resultierende A NTS-gefüllte LUV-Stammlösung sollte etwa vier bis fünf millimolare Lipide enthalten und durchscheinend erscheinen. Milchig weiß.

Schützen Sie die Lösung mit Folie vor Licht und lagern Sie sie 24 Stunden vor Gebrauch bei 13 Grad Celsius gründlich vor dem Trocknen. Die mit A NTS gefüllte LUV-Stammlösung. Da UUVs eine Dichte von mehr als einem Gramm pro Milliliter und/oder Sediment haben.

Verdünnen Sie dann die mit A NTS gefüllte LUV-Stammlösung. Eins bis 20 mit Natriumpuffer inkubieren drei Viertel der Liposomen mit 260 Nanogramm Abidin in DMSO. Geben Sie das gleiche Volumen DMSO ohne Gramin in das verbleibende Viertel.

Um die Lösungsmittelkonzentration in allen Proben konstant zu halten, lassen Sie das Gramin 24 Stunden lang bei 13 Grad Celsius zwischen den inneren und äußeren Monoschichten der Lipidvesikel äquilibrieren. Hier wird ein Spectro-Fluorimeter mit angewandter Photophysik SX Point 20 mit Temperaturregelung verwendet, um die Rate der Fluoreszenzlöschung zu messen. Schalten Sie die Instrumente zunächst eine Stunde im Voraus ein, um das Aufwärmen des Instruments zu ermöglichen.

Der Schlitz mit den Berichterstattern für die Anregung sollte ein Schlitz sein, und ein 4,55-Nanometer-Hochpassfilter sollte für die Aufzeichnung der Emission mit der Software pro data SX verwendet werden. Stellen Sie zuerst die Aufnahmebedingungen ein und stellen Sie die Anregungswellenlängen des Monochromators auf 3 52 Nanometer ein. Verwenden Sie die Druckhalteeinstellung.

Legen Sie die Zeit auf eine Sekunde und zeigt auf 5.000 fest. Stellen Sie die Anzahl der Wiederholungen auf neun für Pufferläufe und auf 13 für Quencherläufe ein. Überwachen Sie die Temperatur in der Essex-Software, um das Laufwerksprofil zu überprüfen.

Das Antriebsvolumen sollte auf 120 Mikroliter eingestellt werden, was 60 Mikroliter aus jeder Spritze mischt. Dies ergibt eine Totzeit von ca. 1,2 Millisekunden. Stellen Sie die hohe Spannung oder Verstärkung am Fluoreszenzdetektor auf ca. 420 Volt ein.

Ziel ist es, einen Fluoreszenzwert von etwa acht zu erhalten, um die zuvor präparierten A NTS-geladenen UUVs für 10 Minuten bei 25 Grad Celsius im Dunkeln zu äquilibrieren. Sobald die Probe äquilibriert ist, wird sie in die linke Spritze geladen. In der richtigen Spritzenladung entweder Natriumpuffer oder Thallium. Schluck.

Entfernen Sie alle Luftblasen, indem Sie die Spritzen hin und her schieben. Beide Spritzen sollten gleichmäßig geladen werden. Bevor Sie die Ventile für die allererste Probe schließen, zeichnen Sie die Fluoreszenz mit Natriumpuffer auf.

Wiederholen Sie den Vorgang viermal und passen Sie die Verstärkung nach Bedarf an. Wiederholen Sie den Vorgang dann weitere fünf Mal für die restlichen Proben. Nehmen Sie neun Wiederholungen mit Natriumpuffer auf.

Ersetzen Sie den Natriumpuffer durch den Thallium-Quencher und nehmen Sie 13 Wiederholungen auf. Spülen Sie mit Wasser ab und fahren Sie mit den nächsten Probenkontrollen fort. Proben ohne Gramin und mit Lösungsmittel, ohne Gramin und mit der maximalen Verbindungskonzentration einschließen.

Und da sowohl Gramin als auch Lösungsmittel nach dem Fluoreszenzassay verwendet werden, lesen Sie die Daten zur Analyse in die MATLAB-Software ein. Für jede Probe, die in allen Puffer- und Quencher-Wiederholungen gelesen wird, werden die ersten vier Wiederholungen durch das verunreinigt, was sich zuvor im Schlauch befand. In diesem Fall kommt das Signal von der Natriumpufferprobe, die sich mit Wasser aus der vorherigen Wäsche vermischt

Die Wiederholungen fünf bis neun stellen ein Signal dar, das nur von der Probe stammt. Daher schließen wir immer die ersten vier Wiederholungen jeweils aus. Um Vermischungsartefakte zu vermeiden, gehen Sie die Ablaufverfolgungen manuell durch und entfernen Sie alle fehlerhaften Wiederholungen, z. B. die rote Spur mit Spitzen oder Abweichungen aufgrund von Mischartefakten und/oder Blasen.

Normalisieren Sie dann die Quencher-Wiederholungen auf den durchschnittlichen Startwert der Pufferwiederholungen für jede Probe für jede Versuchsbedingung, kombinieren Sie die Durchschnittswerte aller Proben in einem Diagramm der Visualisierungsproben, die alle ähnlich sein sollten und fast keine Fluoreszenzlöschung aufweisen sollten. Bei Proben mit Gram-Sidin kommt es zu einer langsamen Reduktion des Fluoreszenzsignals aufgrund der langsamen Absorption von Thallium-Ionen in die Vesikel. Wenn der Fluoreszenzzeitverlauf durch die Verbindung sichtbar verändert wird, ändert die Verbindung die Eigenschaften der Lipiddoppelschicht bei der Konzentration, die als nächstes getestet wird, eine gestreckte Exponential zu den ersten zwei bis 100 Millisekunden der normierten Fluoreszenzlöschkurven.

Für die einzelnen Wiederholungen berechnet man die Rate mit zwei Millisekunden. Berechnen Sie dann die Mittelwerte und Standardabweichungen für eine gegebene Probe aus den einzelnen Wiederholungen der Wirkung von Capsaicin, die hier als cap bezeichnet wird, auf den Zeitverlauf der Fluoreszenzlöschung in Abwesenheit oder Anwesenheit von Gramin, das als ga bezeichnet wird, das normalisierte Fluoreszenzsignal wird hier über eine Sekunde gezeigt. Graue Punkte stellen die Ergebnisse aller Wiederholungen dar, während die roten Linien die Durchschnittswerte darstellen.

Dargestellt sind die ersten 100 Millisekunden des normierten Fluoreszenzsignals. Graue Punkte sind das Ergebnis einer einzelnen Wiederholung für jede Bedingung. Rote Linien sind exponentielle Anpassungen an diese Wiederholungen.

Die erstickte blaue Linie markiert die Zwei-Millisekunden-Marke. Der Zeitpunkt, zu dem die Abschreckgeschwindigkeit bestimmt wird. Die relative Änderung der Quenchrate wird bestimmt, indem die Daten auf die Kontrollprobe mit Gramin und ohne Modifikator normiert werden.

Wenn Capsaicin in die Lipiddoppelschicht absorbiert wird, verändert es die Eigenschaften der Doppelschicht. Die Verschiebung hin zur weicheren Doppelschicht wird sich als Verschiebung der Grammseite im Monodimer-Gleichgewicht zugunsten des leitenden Dimers widerspiegeln. Wir haben Ihnen gerade ein Verfahren gezeigt, mit dem Sie die störenden Effekte eines kleinen Moleküls messen können.

Wenn Sie dieses Verfahren durchführen, ist es wichtig, daran zu denken, dass Sie für jedes Experiment mit derselben Charge von Vesikeln die richtigen Kontrollen verwenden. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.