Name: Gramicidin-basierte Fluoreszenz-Assay; zur Bestimmung Small Molecules Potential für das Ändern von Lipid-Doppelschicht-Eigenschaften (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-13T10:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit einem Gramicidin-basierten Fluoreszenz-Assay Arzneimittel-induzierte Veränderungen von Lipid-Doppelschicht-Eigenschaften messen. Diese Methode nutzt Fluoreszenzlöschung zur Quantifizierung von Kanalaktivitäten.

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Wir danken Michael J. Bruno, Radda Rusinova und Jon T. Sack für viele anregende Diskussionen. Finanzielle Unterstützung von NIH, R01GM021342 und ARRA ergänzen R01GM021342-35S1 und die Josiah Macy, Jr. Foundation OSA, die Tri-I CMB-Programm für HII, und die Iris L. und Leverett S. Woodworth Medical Scientist Fellowship und NIH MSTP gewähren GM07739 für RK.

1. Generieren Sie ANTS gefüllte Liposomen <ol><li> Am Tag 1, entfernen organische Lösungsmittel aus Lipiden. </li><li> Entfernen Lipid aus dem Gefrierschrank und lassen Sie es auf Raumtemperatur äquilibriert. </li><li> Fügen Sie 0,6 ml 25 mg / mL (1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholin) Lipid in Chloroform-Lösung in einen 25 mL Rundkolben. </li><li> Ständig drehen der Flasche während der Trocknung unter Stickstoff, bis alle das Chloroform verdampft ist und eine dünne weiße Lipidfilm bedeckt die gesamte untere Hälfte der Flasche. </li><li> Dry in einem Exsikkator unter Vakuum über Nacht. </li></ol><ol><li> Am Tag 2 Vorbereitung der Probe mit dem Fluorophor, der in die Vesikel aufgenommen werden. </li><li> Rehydrieren in 100 mM NaNO 3, 25 mM ANTS (Na-Salz), 10 mM HEPES. Verwenden HNO 3 oder NaOH auf pH auf 7,0 einzustellen. Jedes Molekül hat ANTS 2 Na +, für eine Gesamtmenge von 150 mM [Na +]. Add 1,671 mL des Elektrolyten zu einer 10 mM Lipidsuspension bekommen. </li><li> Parafilm und Vortex-Fahrwerk gründlich. </li><li> Schützen Probe von Licht mit einer Folie und lassen Sie es Alter über Nacht bei Raumtemperatur. </li></ol><ol><li> Am Tag 3, machen große unilamellare Vesikel und entfernen Sie alle Fluorophor von außerhalb der Vesikel. </li><li> Ultraschallbad für 1 min in einem Low-Power-Ultraschallgerät. </li><li> Frost-Tau-Probe 5-6 Mal, jedes Mal mit 5 Minuten auf Trockeneis und 5 Minuten in warmem (~ 50 ° C) Wasser. </li><li> Extrude die Lipidsuspension mit einem Avanti Mini-Extruder. Richten Sie die Mini-Extruder mit einer 0,1 um Polycarbonat-Filter und Filter unterstützt (siehe Extruder Handbuch für Details). Extrude die Aussetzung hin und her 21 mal so, dass die Aussetzung endet auf der gegenüberliegenden Spritze. Wenn mehrere Chargen extrudiert werden, immer daran denken, Proben mit einer Spritze zu laden. Während der Extrusion die trübe ersten Lipidsuspension werden sollte fast durchsichtig (es wird immer noch gelb wegen der ANTS Fluorophor). Wenn der Extrusion wird plötzlich leichter und weniger Druck benötigt wird, um durch den Filter zu verschieben, kann der Filter gerissen und muss ersetzt werden. </li><li> Entfernen Sie den äußeren ANTS, indem Sie das extrudierte Suspension über eine PD-10 Entsalzungssäule mit einem Schwerpunkt-Protokoll. Äquilibrieren Säule mit 20-30 ml Na-Puffer (140 mM NaNO 3, 10 mM HEPES, pH 7,0, denken Sie daran, HNO 3 oder NaOH zu verwenden, um pH-Einstellung). Fügen Sie 1,5 ml der extrudierten Lipidsuspension, um die Spalte und lassen Sie es sickern in. Bringt das Gesamtvolumen der Probe auf 2,5 ml durch Zugabe von 1 mL Na-Puffer. Nachdem der Puffer ist voll in die Spalte eingearbeitet und es wird nichts ausläuft, eluieren die Liposomen mit 3 ml Na-Puffer und sammeln Sie die erhaltene Probe. Die daraus resultierende ANTS gefüllt LUV Stammlösung sollte etwa 4-5 mm Lipide enthalten und erscheinen transparent milchig weiß. Schützen Sie die Probe aus Licht, mit einer Folie. </li><li> Wenn die Aktie Lösung nicht sofort verwendet wird, lagern bei 13 ° C für maximal 7 Tage. Achtung: nicht einfrieren oder kühlen die Lipid-Lösung unter dem Flüssigkeit-Kristall-Phasenübergangstemperatur (~ 12 ° C), da dies die Vesikel "Integrität zu zerstören und das Fluorophor wird auslaufen. </li></ol> 2. Mix Fluoreszenz-Lösung <ol><li> 24 Stunden vor dem Gebrauch zu verdünnen Liposomen und inkubieren mit Gramicidin (bei 13 ° C). Equilibrierung Gramicidin zwischen den Lipid-Vesikel "inneren und äußeren Monoschichten ist ein langsamer Prozess, der eine lange Inkubationszeit. </li><li> Gründlich vortexen der ANTS gefüllten LUV Stammlösung als LUVs einer Dichte von&gt; 1 g / mL haben und wird daher Sediment in den Lösungen. </li><li> Mix der ANTS gefüllten LUV Lager 1:20 in Na-Puffer. Mischen Sie alle Liposomen für den Einsatz an einem Tag von Experimenten in einem einzigen Kolben auf Probe Einheitlichkeit zu verbessern. </li><li> Separate aus 3 / 4 der Liposomen und fügen 260 nm Gramicidin in DMSO vorverdünnt (500 ug / mL). </li><li> Um die restlichen 1 / 4 add das gleiche Volumen an DMSO (ohne Gramicidin) zu halten das Lösungsmittel Konzentration konstant in allen Proben. </li></ol> 3. Einrichten des Fluoreszenz-Instrument <ol><li> Wir verwenden einen Angewandte Photophysik SX.20 stopped-flow Spektrofluorometer mit Temperaturregelung, die Rate der Fluoreszenzlöschung zu messen. </li><li> Schalten Sie die Instrumente auf eine Stunde vor der Zeit, für aufwärmen können. Die Komponenten sind: Computer, elektronische Steuerung, Wasserbad (beide Kühler und Heizer), Lampe Stromversorgung und Stickstoff-Tank. </li><li> Richten Sie die Aufnahmebedingungen mit dem Pro-Data SX-Software. </li><li> Setzen Sie den Monochromator Anregungswellenlänge auf 352 nm und Spaltbreite Öffnungen für die Anregung zu 1 / 1. </li><li> Verwenden Sie ein λ = 455 nm High-Pass-Filter, um die Emission aufzunehmen. </li><li> Verwenden Sie den "Druck Hold"-Einstellung, die das Instrument ermöglicht es, die Stickstoff-Druck während der Aufnahme zu halten und verhindert somit Druckschwankungen (und Aufzeichnung Artefakte) während der ersten paar Millisekunden. </li><li> Set "Time "bis 1 s und" Points "bis 5000. </li><li> Verwenden Sie das wiederholen Box und stellen Sie die Anzahl der Wiederholungen, die wir normalerweise verwenden 9 und 13 Wiederholungen für Puffer-und Quencher läuft, bzw.. </li><li> Wasserbadtemperatur auf 25 ° C eingestellt werden, die Temperatur sollte in der SX-Software überwacht werden. </li><li> Legen Sie das Laufwerk Volumen bis 120 ul, was bedeutet, dass jedes Mal, wenn das Gerät eine Probe läuft, mischt er 60 &amp;mgr; l von jeder der zwei Spritzen. Mit dieser instrumentalen Setup, gibt einen 120 ul Volumen einer Totzeit von ≈ 1,2 ms. </li><li> Passen Sie die Hochspannung (Gewinn) aus dem Fluoreszenz-Detektor für die Ameisen-Liposom-Ausgang auf rund 8 sein. Für einen Standard-experimentelle Mischung der Gewinn sollte 400-420 V. Einige Medikamente sind fluoreszierend, so dass sie sich das Fluoreszenzsignal zu sättigen. In diesen Fällen sollten die Gewinn / Spannung verringert werden. </li><li> Legen Sie immer das fluoreszierende Probe in der linken Spritze und Puffer / Löscher in die richtige Spritze. Stellen Sie sicher, gründlich vortexen alle Proben mit Liposomen vor dem Laden, und sich bewusst sein, dass die LUVs mit der Zeit wird in die Spritze zu begleichen. </li></ol> 4. Ein Experiment <ol><li> Bereiten Sie eine Probe von ANTS-geladen LUVs entweder mit Lösungsmittel oder Verbindung, und laden Sie in die Spektrofluorometer entweder zusammen mit Na-Puffer oder Tl-Löscher (50 mM TlNO 3, 94 mm NaNO 3, 10 mM HEPES bei pH 7,0). </li><li> Verwenden Sie 1,5 ml verdünnt ANTS-LUV-Lösung, mit oder ohne Gramicidin, vorbereitet vom Vortag. </li><li> Fügen Sie die Verbindung in der gewünschten Konzentration oder das Lösungsmittel für die Kontrollen. Halten Sie die Lösemittelkonzentration auf ein Minimum und konstant über alle Proben. Die Konzentrationen müssen bei jedem neuen (unbekannten) Verbindung eingestellt werden, um die gewünschte Dosis-Wirkungs-Bereich zu erreichen. Inkubieren für 10 min bei 25 ° C im Dunkeln. </li><li> Vortex die LUV Probe und Last in der linken Spritze. Laden Sie die Na-Puffer oder Tl-Löscher in die richtige Spritze. </li><li> Gründlich entfernen Luftblasen aus beiden Proben, indem Sie die Spritzen hin und her. </li><li> Achten Sie darauf, beide Spritzen gleichermaßen vor dem Schließen der Ventile geladen. Ungleiche Belastung wird in der Vor-Mischen von Lösungen führen, bevor sie die Aufnahme Kammer zu erreichen. </li><li> Zum ersten Probe, Aufzeichnung der Fluoreszenz mit Na-Puffer, 4-mal wiederholen, stellen Sie die Hochspannung (Gewinn) wie nötig, und wiederholen Sie 5 mal. </li><li> Für die restlichen Proben, Record 9 wiederholt mit Na-Puffer. </li><li> Ersetzen Sie den Na-Puffer mit dem Tl-Quencher und Datensatz 13 Wiederholungen. </li><li> Mit Wasser abspülen und weiter mit der nächsten Probe. Als Kontrollen verwenden wir Proben mit: no Gramicidin und mit Lösungsmittel, keine Gramicidin und mit der maximalen Konzentration der Verbindung, sowohl mit Gramicidin und Lösungsmittel. </li></ol> 5. Analysieren von Daten <ol><li> Übertragen Sie die Ergebnisse der Analyse-Computer. Lesen Sie alle Daten in MATLAB zur Analyse. Für jede Probe in all den Puffer und Quencher wiederholt zu lesen, ohne die ersten vier in jedem Fall, wie die Vermischung Artefakte enthalten. Ausgehend von einem Laufwerk Volumen von 120 ul dauert es ein bisschen weniger als vier Schüsse ganz klar aus der vorherigen Mischung aus der Stopped-Flow-Schlauch. </li><li> Der Puffer wiederholt sich für alle Proben sollten sehr ähnlich sein. Wenn es eine deutliche Verschiebung in der Fluoreszenz-Signal, das auf der Konzentration der Verbindung hängt, dann ist die Verbindung selbst kann fluoreszierenden und kann es notwendig sein, zuerst subtrahieren diese zusätzliche Fluoreszenzsignal vor der Normalisierung der Proben. </li><li> Manuell über die Spuren zu gehen und zu entfernen "schlechte" wiederholt: wiederholt mit Spikes oder Abweichungen von multi-Exponentialität durch Mischen Artefakte und / oder Blasen. </li><li> Normalisieren der Quencher wiederholt, um die durchschnittliche Startwert des Puffers wiederholt sich für jede Probe. Kombinieren Mittelwerte aller Proben in einem Diagramm zur Visualisierung. </li><li> Traces ohne Gramicidin aufgezeichnet sollten alle ähnlich und zeigen fast keine Fluoreszenzlöschung, es kann eine langsame Reduktion der Fluoreszenz-Signal durch Leckage von Tl + langsam durch die Vesikel-Doppelschicht 8 sein. Wenn die Probe ohne Gramicidin und kein Modifikator zeigt deutliche Abschreckung, dann die Bläschen haben sich verschlechtert und sollte nicht weiter verwendet werden. Wenn die Proben ohne Gramicidin aber mit dem Modifikator signifikante Abschrecken zeigen, dann ist die Modifier stört die Vesikel-Doppelschicht in einem solchen Ausmaß, dass sie das Fluorophor oder Quencher der Doppelschicht Kreuz ermöglicht. </li><li> Wenn die Verbindung ändert Lipiddoppelschicht Eigenschaften, wie spürte von Gramicidin-Kanäle wird die Fluoreszenz Zeitverlauf sichtbar verändert werden. </li><li> Für jede Probe eine gestreckte Exponentialfunktion <img src="/files/ftp_upload/2131/2131eg1.jpg" alt="Gleichung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Gleichung 1"> zB 4) ist die erste 2-100 ms der normierten Fluoreszenzlöschung Kurve der einzelnen Wiederholungen und die Rate fit <img src="/files/ftp_upload/2131/2131eg2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> 4berechnet auf 2 ms. Mittelwerte und Standardabweichungen sind für eine gegebene Probe von allen den einzelnen Wiederholungen berechnet. </li><li> Schließlich bestimmen die relative Änderung in Abschreckgeschwindigkeit durch die Normalisierung auf den nächsten Kontrollprobe in der Zeit, dass Gramicidin und kein Modifier hat. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1: Die Grundlagen der Fluoreszenz löschen-basierter Assay, um Änderungen in Lipiddoppelschicht Eigenschaften erkennen Oben links:. Ein Zoom-in auf einem einzigen Lipidvesikel mit Ameisen und NaNO 3 auf der Innenseite und NaNO 3 plus TlNO 3 auf der Außenseite. Oben rechts: Die Fluoreszenz-Signal aufgezeichnet Verwendung (Formular oben nach unten) ANTS-Vesikel ohne Quencher, mit Löscher, mit Quencher und pre-dotiert mit 87, 260 und 780 nm Gramicidin. Unten: Schematische Darstellung der Stopped-Flow-Mischkammer. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2: A-Bildschirm aus dem Pro-Data SX-Software, welche die verschiedenen Panels in der Beschreibung des Versuchsaufbaus verwiesen erschossen. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3:. Multiple wiederholen Bestimmungen des Fluoreszenzsignals von ANTS-geladen LUVs mit Na-Puffer Die ersten vier Wiederholungen sind grundsätzlich ausgeschlossen, da sie Mischen Artefakte enthalten. Der Schlauch verbindet die Probe Spritzen der Mischzelle haben ein definiertes Volumen, also die ersten paar Wiederholungen geben uns eine Lesart dessen, was vorher in den Schlauch: Wasser für Repeat 1 und 2, eine Kombination von Wasser und Probe zu wiederholen 3, meist Probe wiederholen 4, und nur Probe für die verbleibenden Wiederholungen. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4:. Multiple wiederholen Bestimmungen des Fluoreszenzsignals von ANTS-geladen LUVs mit Na-Puffer und mit Tl-Quencher Die ersten vier Wiederholungen wurden von beiden Bedingungen wurden entfernt. Zusätzlich für die Tl-Quencher Messungen wiederholen 8 muss durch Artefakte, wahrscheinlich Luftblasen entfernt werden. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> . Abbildung 5: Wirkung von Capsaicin (Cap) an den zeitlichen Verlauf der ANTS Fluoreszenzlöschung (A) Normalisierte Fluoreszenzsignal über 1 s, bezeichnen graue Punkte Ergebnisse aus allen Wiederholungen (n&gt; 5 pro Bedingung); roten Linien bezeichnen den Mittelwert aller Wiederholungen. (B) Die ersten 100 ms, bezeichnen graue Punkte ergibt sich aus einer einzigen Wiederholung für jede Bedingung, roten Linien sind exponentielle passt (von 2 bis 100 ms) gestreckt, um die Wiederholungen. Die gestrichelte blaue Linie zeigt die 2 ms markieren, zu welchem ​​Zeitpunkt die Rate der Abschreckung bestimmt wird. In beiden A und B die obere Kurve zeigt die Ergebnisse in der Abwesenheit von Tl +, der nächsten zwei Spuren zeigen die Ergebnisse in der Abwesenheit von gA, mit Tl + ± Cap; die vier unteren Spuren zeigen die Ergebnisse mit 260 nM gA und Tl +, wo Die Zahlen bedeuten [Cap] in uM. Die Preise der Abschreckung für 0, 10, 30 und 90 uM Cap, als durch die Geschwindigkeit der eine gestreckte Exponentialfunktion bestimmt, 36 ± 6, 69 ± 6, 85 ± 8 und 247 ± 27 (Mittelwert ± Standardabweichung, n&gt; 8) bzw..

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Eine vorläufige Patentanmeldung, dass die Methoden in dem Manuskript beschrieben deckt eingereicht worden ist. Die Co-Erfinder sind HII und OSA.

Wir haben eine schnelle Fluoreszenz-basierter Assay für die Bestimmung der Doppelschicht Änderung Potential von Medikamenten und anderen kleinen Amphiphile demonstriert. Verbindungen, die Doppelschicht Eigenschaften zu verändern dürften membrane protein-Funktion in eine indirekte, unspezifische Art und Weise verändern, möglicherweise einen Beitrag zur &quot;off-target&quot; Arzneimittelwirkungen. Der Test nutzt die Leistung von Gramicidin Kanäle als Sonden für die Veränderungen in Doppelschicht Eigenschaften 12,</s...

<table><tbody><tr><td>ANTS</td><td>Invitrogen</td><td>A-350</td><td></td></tr><tr><td>Gramicidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-5002</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholin</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850398C</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Extruder-Kit</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>PD-10-Desalzungssäule</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54805</td><td></td></tr></tbody></table>

gramicidin-basierte fluoreszenz-assay; zur bestimmung small molecules potential für das Ändern von lipid-doppelschicht-eigenschaften

Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

Viele Medikamente und andere kleine Moleküle zur Modulation biologischen Funktion sind Amphiphile, die Adsorption an der Doppelschicht / Lösung-Grenzfläche und damit Lipiddoppelschicht Eigenschaften zu verändern. Dies ist wichtig, weil Membranproteine ​​energisch an ihre Host-Doppelschicht durch hydrophobe Wechselwirkungen gekoppelt. Änderungen in Doppelschicht Eigenschaften verändern somit membrane protein-Funktion, die einen indirekten Weg für Amphiphile modulieren Protein-Funktion und einen möglichen Mechanismus für &quot;off-target&quot; Arzneimittelwirkungen zu Verfügung stellt. Wir haben bereits eine elektrophysiologische Assay zum Nachweis von Veränderungen in Lipiddoppelschicht Eigenschaften mittels linearer Gramicidin Kanäle als Sonden 3,12 entwickelt. Gramicidin-Kanäle sind Mini-Proteine ​​durch die Transbilayer Dimerisierung von zwei nicht-leitenden Untereinheiten gebildet. Sie reagieren empfindlich auf Veränderungen in ihrer Membran-Umgebung, die ihnen leistungsfähige Sonden zur Überwachung von Veränderungen in Lipiddoppelschicht Eigenschaften wie spürte durch Doppelschicht Spanning Proteine ​​macht. Wir zeigen jetzt, ein Fluoreszenz-Assay zum Nachweis von Veränderungen in Doppelschicht Eigenschaften mit den gleichen Kanälen wie Sonden. Der Test basiert auf der Messung der zeitliche Verlauf der Fluoreszenzlöschung von Fluorophor-geladen große unilamellare Vesikel durch die Eingabe einer Quencher durch die Gramicidin-Kanäle auf. Wir nutzen die Fluoreszenz-Anzeige / Quencher-Paar 8-Aminonaphthalin-1 ,3,6-trisulfonat (ANTS) / Tl. +, Mit der bereits in anderen Fluoreszenzlöschung Assays 5,13 verwendet Tl + durchdringt die Lipid-Doppelschicht langsam 8, sondern geht leicht durch die Durchführung Gramicidin Kanäle 1,14. Die Methode ist skalierbar und eignet sich sowohl für mechanistische Studien-und High-Throughput-Screening von kleinen Molekülen für Doppelschicht-stören, und das Potenzial &quot;off-target&quot;, Effekte. Wir finden, dass die Ergebnisse mit dieser Methode in guter Übereinstimmung mit früheren elektrophysiologischen Ergebnisse 12 sind.

Wir stellen Ihnen eine schnelle Fluoreszenz-basierter Assay, dass die Rate der Fluoreszenzlöschung als Maß für Gramicidin-Kanal-Aktivität überwacht. Die Gramicidin Kanäle sind als molekulare Kraftaufnehmer verwendet, um Änderungen in Lipiddoppelschicht Eigenschaften wie spürte durch Doppelschicht Spanning Proteine ​​zu überwachen.

Gramicidin-basierte Fluoreszenz-Assay; zur Bestimmung Small Molecules Potential für das Ändern von Lipid-Doppelschicht-Eigenschaften

Viele Arzneimittel und andere kleine Moleküle, die zur Modulation biologischer Funktionen eingesetzt werden, sind Amphiphile, die an der Grenzfläche zwischen Bilayer und Lösung adsorbieren und dadurch ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, durch Medikamente hervorgerufene Veränderungen in den Eigenschaften einer Doppelschicht zu messen, wie sie von doppelschichtüberspannenden Proteinen wahrgenommen werden. Dies wird erreicht, indem zunächst Fluor-beladene, große einseitige SLES hergestellt werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Vesikel mit Gramin zu dotieren.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, einen externen Löscher hinzuzufügen und die Abklingrate des internen Fluorophors zu messen. Vier. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Quantifizierung der Änderung der Fluoreszenzlöschung pro Gramm Aktivität, indem eine gestreckte Exponentialfunktion an den zeitlichen Verlauf der Fluoreszenz angepasst wird. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, um zu bewerten, ob Amfi-Dateien die Eigenschaften von Lipiddoppelschichten verändern können.Hallo, ich bin Ola Anderson. Hallo, ich bin Helson. Hi, ich bin Richie Kapo.Und ich bin Leah Sanford aus dem Labor von Dr. Olaf Anderson an der Abteilung für Physiologie und Biophysik am Weill Cornell Medical College. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Messung von Veränderungen in den Ei

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Membranprotein-Funktion wird durch die Zellmembran Lipidzusammensetzung geregelt. Dieses Video-Artikel beschreibt, wie ein Pflaster mit Doppelschicht-Patch-Elektroden, sowie zur Verwendung von Gramicidin Kanäle als Reporter der veränderten Eigenschaften der Membran bilden.

Single Molecule Methoden zur Überwachung von Veränderungen in Bilayer Elastic Properties

Ein Echtzeit-Screening-Verfahren zur Identifizierung von Medikamenten, die mit G-Protein-gated Einwärtsgleichrichter K...

Ein fluoreszierendes Screening Assay zur Identifizierung von Modulatoren der GIRK Kanäle

In diesem Video demonstrieren wir Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen in einem mikrofluidischen Muster unter Verwendung des pH-Modulationsassays unter Verwendung eines pH-empfindlichen Fluoreszenzfarbstoffs, der an das Phosphatidylethanolamin-Lipid einer unterstützten Lipiddoppelschicht, einer sogenannten mikrofluidischen Plattform, gebunden ist. Die Modulation des pH-Werts nach der Proteinbindung an Phospholipid führt zu einer Fluoreszenzlöschung.

pH-Modulationsassay an gestützten Lipiddoppelschichten zum Nachweis von Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen

Wir zeigen eine speicherbare, transportierbar Lipid-Doppelschicht Bildungssystem. Eine Lipid-Doppelschicht-Membran kann mit mehr als 80% Erfolgsquote innerhalb von 1 h gebildet werden, wenn eine gefrorene Membran Vorläufer auf Umgebungstemperatur gebracht wird. Dieses System wird mühsamen Prozesse reduzieren und Know-how mit Ionenkanälen verbunden.

Automatisierte Lipid Bilayer Membrane Formation eines Polydimethylsiloxans Dünnschicht unter Verwendung

Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Fluoreszenz basierende Assays, die die Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz durch fluorometrisch und bildgebende Untersuchungen in lebenden Zellen misst. Dieser Test kann verwendet werden, für das screening von Drogen oder Zielgene, die Plasmamembran Wiederverschließen in Säugetierzellen zu regulieren.

Hochdurchsatz-Messung der Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz in Säugerzellen

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von Liposomen und wie diese auf einer Oberfläche immobilisiert und mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie massiv parallel abgebildet werden können. Dies ermöglicht die Quantifizierung der Größe und der kompositorischen Inhomogenität zwischen einzelnen Liposomen der Population.

Ein quantitativer Fluoreszenzmikroskopie-basierter Single Liposome-Assay zum Nachweis der kompositorischen Inhomogenität zwischen einzelnen Liposomen

Der Fluoreszenz-Leckage-Assay ist eine einfache Methode, die die Untersuchung von Peptid/Membran-Wechselwirkungen ermöglicht, um ihre Beteiligung an mehreren biologischen Prozessen und insbesondere die Fähigkeit von zelldurchdringenden Peptiden zu verstehen, Phospholipide-Doppelschichten während eines direkten zellulären Translokationsprozesses zu stören.

Fluoreszenz-Leckage-Assay zur Untersuchung der Membrandestabilisierung durch zelldurchdringendes Peptid

Dieses Protokoll stellt eine Fluoreszenzbildgebungsmethode vor, die eine Klasse von pH-empfindlichen Lipidfluorophoren verwendet, um den Lipidmembrantransport während der Zellexozytose und des Endozytosezyklus zu überwachen.

Messung des Membranlipidumsatzes mit dem pH-empfindlichen Fluoreszenz-Lipid-Analogon ND6

Dieses Protokoll stellt eine Reihe von Experimenten vor, die für die Evaluierung von photoschaltbaren Antikrebspeptiden verwendet wurden, die für das präklinische Screening solcher Verbindungen verwendet werden können. Dazu gehören die Bewertung der Zytotoxizität in 2D- und 3D-Zellkulturen, die Bewertung der Ex-vivo-Photoisomerisierungseffizienz (Modellgewebe) und der In-vivo-Wirksamkeit.

In-vitro - und In-vivo-Evaluierung photokontrollierter biologisch aktiver Substanzen - potenzielle Wirkstoffkandidaten für die Krebspharmakologie

Ein experimentelles Protokoll wird vorgestellt, um Gramicidin-A-dotierte Tröpfchen-Interface-Doppelschichten zusammenzusetzen, elektrisch zu stimulieren und zu analysieren. Lipid-Protein-Struktur-Funktion-Beziehungen werden quantifiziert, indem Veränderungen der Membranfläche, des Ionenflusses und der Einkanal-Leitfähigkeit gemessen und diese Reaktionen auf plastizitätsähnliche Veränderungen der ionischen Leitung in einem von elektrischen Synapsen inspirierten Membranmodell in Beziehung gesetzt...

Lipid-Protein-Membranstruktur-Funktions-Charakterisierung mittels Tropfen-Interface-Doppelschichten

Erfahren Sie, wie Sie mit einem Gramicidin-basierten Fluoreszenz-Assay Arzneimittel-induzierte Veränderungen von Lipid-Doppelschicht-Eigenschaften messen. Diese Methode nutzt Fluoreszenzlöschung zur Quantifizierung von Kanalaktivitäten.

Gramicidin-basierte Fluoreszenz-Assay; zur Bestimmung Small Molecules Potential für das Ändern von Lipid-Doppelschicht-Eigenschaften (Video) | JoVE Journal

Gramicidin-basierte Fluoreszenz-Assay; zur Bestimmung Small Molecules Potential für das Ändern von Lipid-Doppelschicht-Eigenschaften

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