Mikrosphären-Polymerase-Kettenreaktion zur Amplifikation einzelsträngiger DNA

Bei der Mikrosphären-PCR wird eine mikrogroße Kugel verwendet, die an Oligonukleotide auf ihrer Oberfläche gekoppelt ist, was die bevorzugte Amplifikation von einzelsträngiger DNA ermöglicht.

Um mit der Mikrosphären-PCR zu beginnen, nehmen Sie einen Reaktionsmix, der einzelsträngige DNA-Stränge enthält, Forward-Primer mit einem zusätzlichen Nukleotid-Tag, thermostabile DNA-Polymerase, dNTPs und Mikrosphären mit einzelsträngigen Oligonukleotidsonden.

Legen Sie das Rohr in einen Thermocycler und lassen Sie es unter den definierten Bedingungen laufen.

Im ersten Zyklus, bei der Annealing-Temperatur, bindet die Matrizen-DNA an die Sonde auf der Oberfläche der Mikrosphäre, so dass die Matrizen-DNA als Sinnesstrang fungiert. Während der Verlängerung verlängert die Polymerase die DNA, und der Duplex bleibt an die Mikrosphäre gebunden.

Im nächsten Zyklus, während der Denaturierung, trennt sich die Matrizen-DNA von der Mikrosphäre, so dass der Sondenstrang an die Oberfläche gebunden bleibt – und als Matrize für einen neuen Strang dient.

Während des Glühens bindet der markierte Primer an den Antisense-Strang. Später verlängert die Polymerase es, um den Sinnesstrang mit dem Nukleotid-Tag zu synthetisieren.

Wiederholen Sie den Zyklus mehrmals, um mehrere Kopien der einzelsträngigen DNA zu erzeugen, die in die Lösung gelangen, während die doppelsträngigen Verunreinigungen gebunden bleiben.

Übertragen Sie die PCR-Produkte in ein Röhrchen mit einem Ladepuffer. Laden Sie das Produkt und die Marker in verschiedene Vertiefungen des Gels und trennen Sie es mit Hilfe der Agarosegelelektrophorese.

Die Template-DNAs bilden eine schwache Bande mit niedrigem Molekulargewicht, während eine intensive Bande mit hohem Molekulargewicht die Amplifikation einzelsträngiger DNA bestätigt.