Der Nachweis eines multiresistenten Mycobacterium tuberculosis Verstärkung Microarray

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist die Genotypisierung des multiresistenten Mikrobakteriums tuberculosis unter Verwendung eines Amplifikations-Microarrays. Dies wird erreicht, indem eine asymmetrische Multiplex-PCR über einem Microarray in einer einzigen mikrofluidischen Reaktionskammer durchgeführt wird. Dort wird die Probe gleichzeitig amplifiziert, in der markierten Größe ausgewählt, einzelsträngig gemacht und mit dem Microarray hybridisiert.

Als nächstes, nachdem der Microarray gewaschen wurde, zeigt ein Reader, ob das Mikrobakterium tuberculosis vorhanden ist und ob es eine DNA-Mutation enthält, von der bekannt ist, dass sie Resistenz gegen Rifampicin iso, Niazi ethambutol oder Streptomycin verleiht. Der Vorteil dieses Verfahrens gegenüber bestehenden Microarray-Liniensonden- oder Nukleinsäure-Hybridisierungsverfahren besteht darin, dass ein Amplifikations-Microarray die Benutzerinteraktion mit dem Test erheblich vereinfacht. Dennoch bieten Sie die analytische Empfindlichkeit der PCR und die Multiplexing-Kapazität eines Microarrays. Für dieses Verfahren sollten Sie einen sauberen Arbeitsbereich haben, der mit dekontaminierter Lösung abgewischt wurde, und Nukleinsäuren haben, die rein genug für die Multiplex-PCR sind.

Nachdem Sie alle Stammlösungen aufgetaut und gemischt haben, stellen Sie den PCR-Mastermix zusammen. Wenn Sie diese Mischung zubereiten, stellen Sie mindestens ein zusätzliches Volumen der Mischung für den hier gezeigten TB-Test her. Fügen Sie dem Mastermix außerdem zusätzliche T-Polymerase hinzu.

Zusätzlich zu der Menge an Klebrigkeit, die mit den Stammreagenzien geliefert wird, wird ein Mikroliter Aliquots der Proben-DNA auf 49 Mikroliter Mastermix gemischt. Geben Sie vorsichtig 48 Mikroliter jedes Reaktionsgemisches in die Mitte des entsprechenden Microarrays. Berühren Sie nicht den Microarray selbst.

Decken Sie dann den Microarray vorsichtig ab und versiegeln Sie ihn unsachgemäß. Durch das Anbringen des Deckglases können Blasen entstehen, die zu Artefakten, Verdunstung, schlechter Amplifikation oder ungleichmäßiger Hybridisierung führen können. Jede dieser Bedingungen kann zu einem fehlerhaften Ergebnis führen.

Laden Sie als Nächstes die Mikrorate in den Thermocycler. Wenn die Substrate gegen den Heizblock anliegen, muss die Option für den beheizten Deckel ausgeschaltet sein. Für Labore, die universelle PCR-Vorsichtsmaßnahmen befolgen, ist es effizienter, mehrere Amplifikations-Microarrays pro Objektträger einzuschließen und mehrere Tests gleichzeitig zu verarbeiten.

Führen Sie nun das entsprechende Temperaturwechselprogramm aus. Dieses Programm umfasst 50 Amplifikationszyklen, was hoch erscheinen mag, aber aufgrund der überwiegend einzelsträngigen Amplikonpopulation, die durch die Reaktion entsteht, erforderlich ist. Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, entfernen Sie die Microarrays und schalten Sie den Thermocycler ab.

Öffnen Sie die Microarray-Kammer vorsichtig mit der Platte und der Pinzette. Entfernen Sie den Slip, die Abdeckung und die Dichtung. Der Microarray kann durch diesen Schritt beschädigt werden, seien Sie also vorsichtig Unsachgemäß.

Das Entfernen der Dichtungsbaugruppe kann zu einer physischen Beschädigung des Microarrays führen. Achten Sie darauf, den Deckglas nicht zu verbiegen oder zu biegen und achten Sie sehr darauf, dass die Oberfläche des Microarrays nicht mit der Pinzette zerkratzt wird. Übertragen Sie nun die Microarray-Substrate auf einen Objektträgerhalter für die Histologie. Baden Sie die Substrate 10 Minuten lang bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren im Waschpuffer und folgen Sie nach dem Waschlösungsbad mit zwei oder drei weiteren Wäschen, alles in deionisiertem Wasser.

Trocknen Sie die Microarrays, bevor Sie mit der Bildgebung fortfahren. Zu diesem Zweck kann in dieser Demonstration ein sanfter Druckluftstrom verwendet werden, die Parameter sind spezifisch für den MDR TB-Test und einen Econ DX 2100 Field Portable Imager. Ein blaues Licht am Imager zeigt an, dass er bereit ist.

Schalten Sie den Computer ein. Öffnen Sie die von einem conni bereitgestellte Systemsoftware und warten Sie, bis die Software ankündigt, dass sie eine Verbindung mit der Kamera hergestellt hat. Legen Sie anschließend den getrockneten Microarray in den Imager ein.

Mit dem Microarray in Richtung Objektiv und weg vom Benutzer. Die Software stellt nun ein Vorschaubild aus dem Dropdown-Menü zur Verfügung. Wählen Sie das MDR-TB-Analyseskript aus.

Geben Sie eine Belichtungszeit zwischen 100 und 500 Millisekunden ein. Überbelichtete Pixel werden ausgelesen. Passen Sie die Belichtung an, um sie zu minimieren.

Wenn die Sättigung so eingestellt ist, dass die Überbelichtung minimiert wird, starten Sie die Analyse. Die Software platziert ein MDRT-TB-Raster auf den Bildwerten, Proben und Hintergrundintensitäten und meldet dann die Ergebnisse der Arzneimittelresistenz und der Genotypisierung. Sobald die Analyse abgeschlossen und gespeichert ist, entfernen Sie den Chip aus dem Imager und starten Sie eine neue Analysesitzung, um das nächste Array zu analysieren.

Setzen Sie die Analyse für jeden der verarbeiteten Microarrays fort. Speichern Sie die Daten jedes Mal. Die qualitative Bildanalyse kann Einblicke in Quellen von experimentellem Rauschen oder Variabilität geben, die in Datentabellen, die von automatisierter Bildanalysesoftware erstellt werden, nur schwer zu identifizieren sind.

Hier ist ein qualitativ hochwertiges Array ohne Artefakte zu sehen. Verschiedene Artefakte können zur Einführung von Blasen führen, die Halos erzeugen. Trotz Array-Artefakten ruft die Software weiterhin Werte aus dem Scannen ab.

Ein Diagnoseberichtsalgorithmus würde dieses Array trotz erhaltener Werte als ungültig erkennen. Eine Verdünnungsreihe von genomischer Wildtyp-DNA H 37 RA wurde auf einem Microarray-PCR-Template bei 6,25 Pikogramm verwendet, was 1.250 Zellen entspricht. Alle Sonden wurden detektiert.

Ein SNR-Wert über drei ist ein positives Ergebnis, und die registrierten Werte waren viel höher. Als nächstes wurden Referenzisolate der Weltgesundheitsorganisation genotypisiert. Einzelnukleotid-Polymorphismen, die auf dem Array vorhanden waren, wurden als entsprechende Mutation im MDR-TB-Genom nachgewiesen.

Es gab auch mehrere Beispiele für den Nachweis von Mutationen in der Nähe von Nachbarn. Eine Diskussion ist im Textprotokoll vorgesehen. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie in etwa dreieinhalb bis sechseinhalb Stunden durchgeführt werden, abhängig von der DNA-Konzentration, dem spezifischen Assay, der Effizienz und Gleichmäßigkeit des Thermocyclers und der gewünschten analytischen oder klinischen Sensitivität und Spezifität.

Auch die Anzahl der Amplifikationszyklen und die Hybridisierungszeiten nach der Amplifikation können leicht verkürzt oder verlängert werden, um die gewünschten Leistungsmerkmale zu erhalten.