Quantitatives Western Blot zur Abschätzung der Proteinexpressionsniveaus

Quantitatives Western Blotting – eine auf der Normalisierung von Gesamtproteinen basierende Technik – ist nützlich für die Quantifizierung der Expression von Zielproteinen.

Laden Sie zunächst Gewebelysat in die Vertiefungen eines Polyacrylamid-Gradientengels. Das Lysat enthält das Zielprotein zusammen mit anderen zellulären Proteinen.

Lassen Sie das Gel mit einer geeigneten Spannung für die elektrophoretische Trennung der Probenproteine entlang des Gradienten laufen. Legen Sie das Gel nach Abschluss auf die Polymermembran eines Transferstapels.

Anlegen eines elektrischen Stroms, um die abgetrennten Proteine auf die Membran zu übertragen. Legen Sie als Nächstes die Membran in eine fluoreszierende Gesamtproteinfärbung. Die geladenen Farbstoffmoleküle in der Färbung binden elektrostatisch an alle Proteine auf der Membran.

Fügen Sie eine Blockierungslösung hinzu. Die Proteine in der Lösung binden also an die Membran. Verhinderung der unspezifischen Bindung von Nachweisreagenzien. Fügen Sie einen primären Antikörper hinzu, der nur an das Zielprotein bindet. Fügen Sie dann einen Sekundärantikörper hinzu, der mit einem Fluorophor markiert ist und an den Primärantikörper bindet.

Stimulieren Sie die Probe mit einem Laser. Erfassen Sie die emittierte Fluoreszenz von den Farbstoffmolekülen der Gesamtproteinfärbung und den antikörpergebundenen Fluorophoren bei den entsprechenden Wellenlängen.

Um den normalisierten Proteinbeladungswert zu berechnen, dividieren Sie das Gesamtproteinsignal jeder Spur durch den höchsten Wert. Dividieren Sie das Zielproteinsignal durch den entsprechenden normierten Ladungswert, um die relative Expression des Zielproteins zu bestimmen.