Ultra-High-Speed Western Blot mit Immunoreaction Enhancing Technology

Western Blotting ist eine etablierte Methode, die Antigene auf einer übertragenen Membran nachweist und in der biomedizinischen Forschung häufig eingesetzt wird, aber es dauert Stunden oder Tage, bis das gesamte Verfahren abgeschlossen ist. Durch die Kombination aus immunverstärkender Technologie mit zyklischer Drainage und Auffüllung kann der gesamte Eingriff, sobald Sie eine Blockmembran haben, in nur 20 Minuten durchgeführt werden, ohne die Empfindlichkeit zu beeinträchtigen. Da Western Blotting in vielen verschiedenen Forschungsbereichen üblich ist, ist es breit anwendbar, um die Forschung zu beschleunigen.

Die erfolgreiche Anwendung dieses Protokolls beruht auf der Optimierung der Antikörperverdünnung mit Immunreaktion, die das Reagenz und die Inkubationszeit erhöht. Beginnen Sie mit der Inkubation der PVDF-Membranen in geeigneten Blockierungspuffern für eine Stunde unter Rühren bei Raumtemperatur. Während die Membranen inkubieren, bereiten Sie eine 10%ige Immunreaktionsverstärkerlösung oder IRE1 mit destilliertem Wasser vor und wirbeln Sie sie gut ein, verdünnen Sie dann den Primärantikörper mit 10%IRE1 und mischen Sie ihn vorsichtig und gründlich.

Sie die PVDF-Membran mit einer Pinzette auf und lassen Sie die Verstopfungslösung kurz abtropfen. Führen Sie die Membran in ein konisches Röhrchen mit primärem Antikörper ein und stellen Sie sicher, dass die gesamte Membran an der Wand des Röhrchens haftet und dass die Seite der Membran, die ursprünglich mit dem Gel in Kontakt war, nach innen zeigt. Verschließen Sie die Tube fest.

Stecken Sie das Rohr in eine Glasflasche für den Hybridisierungsofen und schalten Sie den Ofen ein. Inkubieren Sie die Membran mindestens fünf Minuten lang mit sechs Umdrehungen pro Minute. Stoppen Sie die Drehung und entfernen Sie die PVDF-Membran vorsichtig mit einer Pinzette aus dem Rohr.

Legen Sie die Membran in einen Behälter mit 50 Millilitern PBST und spülen Sie sie aus, dann spülen Sie sie in einem Behälter mit destilliertem Wasser aus, bis keine Blasen mehr entstehen, wodurch der Großteil des Antikörpers entfernt wird. Übertragen Sie die Membran in eine Salatschleuder, die 250 Milliliter PBST enthält. Setzen Sie den Siebkorb in die Schleuse ein und stellen Sie sicher, dass der Deckel fest aufgesetzt ist, aktivieren Sie dann die Schleudermaschine und lassen Sie sie 20 bis 30 Sekunden lang laufen.

Entsorgen Sie die Lösung und spülen Sie das Innere der Schleuderbahn kurz mit destilliertem Wasser aus. Geben Sie 250 Milliliter PBST in den Spinner und wiederholen Sie den Spin, inkubieren Sie dann die Membran mit den Sekundärantikörpern und waschen Sie sie erneut, wie im Textmanuskript beschrieben. Legen Sie ein Stück halbtransparente flexible Folie auf eine ebene Fläche.

Mischen Sie zwei Komponenten des chemilumineszierenden Substrats in einem Fünf-Milliliter-Röhrchen und übertragen Sie sofort 1,5 Milliliter des gemischten Substrats auf die halbtransparente Folie. Legen Sie die PVDF-Membran auf die Lösung und übertragen Sie den Rest der Substratlösung auf die Membran. Inkubieren Sie die PVDF-Membran mit dem gemischten Substrat eine Minute lang.

Sie die PVDF-Membran mit einer Pinzette auf und lassen Sie die Substratlösung kurz abtropfen. Stecken Sie die Membran zwischen ein Paar transparenter Filme und bilden Sie sie im Chemilumineszenzmodus ab. Hier sind die Mengen an Antigen bzw. Antikörpern dargestellt, die für den chemilumineszierenden Nachweis von Western Blots notwendig sind.

Sowohl in statischen als auch in CDR-Inkubationen erhöhte die Verwendung von IRE-Lösungen die Empfindlichkeit. In ähnlicher Weise wurde die Mindestkonzentration von Anti-6s-His-Tag-Antikörpern unter statischen Bedingungen von 100 auf 50 Nanogramm pro Milliliter und unter CDR-Bedingungen von 100 auf 12,5 Nanogramm pro Milliliter gesenkt. Die CDR-Inkubation für 5 oder 10 Minuten senkte die Nachweisgrenze im Vergleich zur statischen Inkubation drastisch.

Darüber hinaus zeigte die Kombination von CDR mit IRE eine überlegene Sensitivität des Western Blots, selbst innerhalb der extrem kurzen Inkubationszeit. Die erfolgreiche Anwendung dieser Methode auf einen Western Blot mit Fluoreszenzdetektion wird hier demonstriert. Die Fluoreszenzdetektion hat im Gegensatz zur Chemilumineszenzdetektion die einzigartige Fähigkeit, mehrere Ziele gleichzeitig auf demselben Blot zu detektieren, ohne dass Antikörper abgestreift und erneut untersucht werden müssen.

His-markierte alkalische Phosphatase und Beta-Aktin in den Zelllysaten wurden gleichzeitig mit einem zweifarbigen Fluorophor nachgewiesen. Die CDR-Inkubation mit IRE beschleunigte nicht nur die Detektion, sondern erhöhte auch die Sensitivität. Während der Inkubation sollte die Membran an der Wand des Röhrchens befestigt bleiben.

Das Röhrchen sollte horizontal gedreht werden, so dass die Lösung kontinuierlich über die Membranoberfläche gewaschen wird. Dieses Protokoll hat unsere Forschungsproduktivität, die stark von westlichen Blotting-Verfahren abhängt, erheblich beschleunigt.