Direkte Analyse von Einzelzellen durch Massenspektrometrie bei Atmosphärendruck

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, den Inhalt einer einzelnen lebenden Zelle auszustoßen und die freigesetzten Biomoleküle zur Analyse mittels eines Massenspektrometers unter atmosphärischem Druck zu ionisieren. Dies wird erreicht, indem eine einzelne Zelle mithilfe eines Fernmikroskops ausgewählt und durch einen Laserimpuls mit einer Wellenlänge von 2,94 Mikrometern, der über eine geschärfte optische Faser geleitet wird, ablatiert wird. Die Ablation einer einzelnen Zelle führt zur Bildung eines mikroskopisch kleinen Strahls neutraler Partikel, um den Ablationsstrahl zu ionisieren.

Sie wird von einem Elektrospray aufgefangen. Die geladenen Tröpfchen aus dem Spray verschmelzen mit den Partikeln der Ablationswolke, die von der Zelle stammt. Die resultierenden Tröpfchen enthalten Moleküle aus der Zelle und erzeugen die entsprechenden Ionen.

Es werden Ergebnisse erhalten, die ein Massenspektrum aus einer einzelnen Zelle zeigen. Das Spektrum enthält zahlreiche Peaks, die mit den Metaboliten und Lipiden der Zelle assoziiert sind. Hallo, ich bin Dr. Bin Drester vom Verese-Labor im Fachbereich Chemie der George Washington University.

Heute zeigen wir Ihnen die Vorgehensweise für die direkte Analyse einzelner lebender Zellen mittels Massenspektrometrie bei atmosphärischem Druck. In unserem Labor verwenden wir diese Methode, um Metaboliten und Lipide aus einzelnen Pflanzen- und Tierzellen zu untersuchen. Beginnen wir also.

Die Laserablation für die Laserablation, Elektrospray-Ionisation, Massenspektrometrie oder lazy MS wird durch einen fünf Nanosekunden langen Laserimpuls mit einer Wellenlänge von 2,94 Mikrometern erzeugt. Ein abstimmbler optischer Parametrischer Oszillator, der von einem Neodym-YAG-Laser angetrieben wird, wird in dieser Studie für die Ablation verwendet.

Bringen Sie zunächst das geätzte Ende einer optischen Faser an einem Mikromanipulator an und führen Sie es in die Nähe der Zelloberfläche heran. Halten Sie zum effizienten Energieeintrag das nicht geätzte Ende der optischen Faser mit einer Blankfaser-Spannvorrichtung zur optischen Ausrichtung fest. Die Faser-Spannvorrichtung ist auf einem Translator mit fünf Achsen montiert.

Koppeln Sie die Laserenergie in die Faser ein, indem Sie den Strahl mit einer plan-konvexen Linse aus Kalziumfluorid oder mit einer entspiegelten Zink-Selenid-Linse auf das nicht geätzte Ende fokussieren, und verwenden Sie geschützte Goldspiegel, um den mittleren Infrarotlaserstrahl auf die Fokussierlinse zu lenken. Um den Abstand zwischen der geschliffenen Faserspitze und der Zelloberfläche beizubehalten, verwenden Sie ein Video-Mikroskop mit großer Arbeitsdistanz, das in einem Winkel von 15 bis 30 Grad zur Oberfläche gemessen angebracht ist. Dieses System besteht außerdem aus einem fünfmal unendlich korrigierten Objektiv, das mit einer CCD-Kamera zur Überwachung und Bildaufnahme ausgestattet ist.

Ein zweites Videomikroskop ist im rechten Winkel zur Probenoberfläche montiert, um die Zellen von oben zu visualisieren und sie zur Analyse auszuwählen. Dieses System liefert visuelles Feedback, um die Faserspitze über der ausgewählten Zelle für die Ablation und Analyse auszurichten. Es besteht aus einem siebenfachen Präzisionszoombau mit einem zehnfachen, unendlichkeitskorrigierten Objektiv mit langem Arbeitsabstand und einer CCD-Kamera.

Das Elektrospraysystem wurde unter Verwendung eines Metallverbundstücks mit leitfähigen perfluorierten Elastomer-Ferrulenkupplungen, Schläuchen, einer Nadeldurchführung und FU-Kieselsäureschlauch aufgebaut. Als Emitter wird ein aus rostfreiem Stahl gefertigter Emitter mit konischem Ende und einem Durchmesser von 50 Mikrometern empfohlen. Bereiten Sie eine 50 %ige Methanollösung mit 0,1 % Essigsäure für das Elektrospray vor. Pumpen Sie die Lösung mit einer Geschwindigkeit von 200 bis 300 Nanolitern pro Minute mittels einer Spritzenpumpe.

Unter Verwendung einer 500-Mikroliter-Spritze wird an die Metallverbindung mittels einer geregelten Stromversorgung eine hohe Spannung zwischen 2.803.000 Volt angelegt. Um einen stabilen Elektrospray zu erzeugen, stellen Sie sicher, dass alle elektrischen Verbindungen sicher sind und mit der Abschirmung ordnungsgemäß geerdet werden, da direkter Kontakt mit freiliegenden Hochspannungsteilen zu einem elektrischen Schlag führen kann. Gewinnen Sie die lebende Gewebe- oder Zellprobe aus einer geeigneten Quelle und lagern Sie sie vor der Analyse gemäß den Empfehlungen.

Die Zwiebeln für diese Demonstration wurden in einem örtlichen Geschäft gekauft. Schneiden Sie die Zwiebel längs mit einem chirurgischen Skalpell und entnehmen Sie einen etwa zwei Quadratzentimeter großen Abschnitt der Schuppe aus der Zwiebel. Anschließend wird eine intakte einschichtige Schicht des inneren Epidermisgewebes abgezogen. Verwenden Sie die feuchte Oberfläche der Epidermis, um das Gewebe auf einer vorher gereinigten Glasobjektträgerplatte zu montieren.

Halten Sie den Objektträger mit einem universellen Plattenhalter, der an einer Dreiaxen-Translationsvorrichtung zur Positionierung montiert ist. Unmittelbar nach der Probenaufnahme die Massenspektren erfassen, um einen Zellabbau zu verhindern. Schalten Sie zunächst den Laser, den Elektrospray und das Massenspektrometer ein.

Optimieren Sie die Geometrie der trägen Ionenquelle, indem Sie die Position des Ablationsflecks und des Elektrospray-Emitters zueinander und zur Öffnung des Massenspektrometers anpassen. Um die maximale Ionenintensität zu erreichen, wählen Sie die für die Analyse interessierende Zelle mithilfe des Visualisierungssystems mit Oberansicht aus. Bewegen Sie nach der Auswahl den Probenhalter, um die ausgewählte Zelle direkt unter die abgeschliffene Spitze der optischen Faser zu bringen.

Stellen Sie mithilfe des Seitenmikroskops den Abstand zwischen der Pipettenspitze und der Zelloberfläche auf etwa 20 Mikrometer neu ein. Sobald die korrekte Position erreicht ist, geben Sie Laserpulse durch die geätzte Faserspitze auf die ausgewählte Zelle ab. Dies führt zur Perforation der Zellwand und zur Ausstoßung des Zytoplasmas in Form von Partikeln.

Nach der Post-Ionisierung mittels Elektrospray werden die erzeugten Ionen vom Massenspektrometer gesammelt und Massenspektren aufgezeichnet. Nach Abschluss der Datenaufnahme schalten Sie den Laser, den Elektrospray und das Massenspektrometer in den Standby-Modus oder schalten Sie diese Geräte aus. Bewahren Sie die ablatierte Allium-cepa-Gewebeprobe für eine optionale Beobachtung mittels Lichtmikroskopie auf; eine erfolgreiche Ablation einer einzelnen Zelle führt zum Platzen der Zellwand und zur Aufnahme eines trägen Massenspektrums.

Hier sind die Ergebnisse der trägen MS-Analyse einer einzelnen eingebetteten Epidermiszelle einer Allium-SEPA-Zwiebel, die ein repräsentatives Bild der optischen Mikroskopie zeigt. Nach der Probenahme einer Zelle wird die Zellwand perforiert, wobei das Ausmaß der Perforation durch die Grenzen zu den benachbarten Zellen begrenzt ist. Die angrenzenden Zellen erscheinen intakt.

Hier ist ein repräsentatives träges Massenspektrum dargestellt, das aus der Zelle gewonnen wurde. Eine Vielzahl von Ionen wird aus dem Allium-See pro Zelle detektiert, und basierend auf ihren genauen Massen, Isotopenverteilungsmustern und tandem-massenspektrometrischen Spektren werden die Ionen sorgfältig endogenen Metaboliten zugeordnet. Die aus einer einzelnen Zelle detektierten Ionen ähnelten denen, die bei der Analyse des gleichen Gewebes durch konventionelle träge MS mehrerer Zellen beobachtet wurden.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man einzelne lebende Zellen mittels Massenspektrometrie bei atmosphärischem Druck analysiert. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, Schutzbrille zu tragen, um eine versehentliche Exposition gegenüber Infrarotlasern der Klasse vier zu vermeiden. Damit ist der Vorgang abgeschlossen.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.