Name: Imaging Protein-Protein-Wechselwirkungen In vivo /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Protein-Protein-Wechselwirkungen in Endothelzellen mit einem FRET-basierten Näherungsassay und konfokaler Mikroskopie untersuchen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Rezeptorinteraktionen während der Angiogenese.

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Wir wünschen Herrn Dr. Scott Henderson für die Hilfe bei der konfokalen Mikroskopie zu bestätigen. Diese Forschung wurde durch Bewilligungen von den National Institutes of Health 1RO1CA127501 zu WAB sowie Pilotprojekt Mittel aus dem Massey Cancer Center and School of Medicine (VCU), um WAB-Mikroskopie wurde an der VCU-Abteilung durchgeführt unterstützt. für Neurobiologie und Anatomie Microscopy Facility, unterstützt, zum Teil mit Mitteln aus NIHNINDS Zentrum Kern gewähren 5P30NS047463.

Das Protokoll besteht aus drei Schritten. Der erste Schritt für das Klonen von Ihrem Gen von Interesse in einen Säugerexpressionsvektor Amino-terminal an die monomeren Versionen von GFP und / oder YFP wird nur kurz besprochen werden. Die zweite und dritte Schritt, die Transfektion von Vektor-DNA in EA.hy926 Endothelzellen und konfokale Bildgebung mit FRET, sind in mehr Tiefe im Folgenden erläutert. 1. Bau von CFP und YFP chimäre Rezeptoren Rezeptoren von Interesse sollte Amino-terminal an monomeren erweiterte Versionen von CFP und YFP geklont werden. Bestimmung von FRET ist empirisch und hängt entscheidend von der Länge des Linkers zwischen den Transmembran Spanning Region und zu Beginn des Fluorophors 1. Deshalb müssen verschiedene Längen von Linker für jeden neuen Rezeptor-Paar zu untersuchenden erkundet werden. <ol><li> In den pcDNA3.1 Hygro R oder neo R-Vektor, der monomeren C-oder YFP (dieses Vektors können aus unserem Labor angefordert werden), Klon Ihrer Rezeptor von Interesse in die NheI / EcoRI. * Hinweis: Wenn nötig, wird NheI kompatibel mehrere andere Enzyme, einschließlich SpeI und XbaI. </li><li> Verwandeln Sie Ihren Ligationsreaktion in eine geeignete endA1 recA zuständige Zelllinie (verwenden wir routinemäßig Mach1). Screen-Kolonien auf die Anwesenheit des Einsatzes gefolgt von DNA-Sequenzierung, um die Abwesenheit von Mutationen zu überprüfen. </li><li> Nach Erhalt Konformation des erfolgreichen molekularen Klonen vorbereiten Transfektion-grade Vektor-DNA in sterilem Wasser oder TE mit Qiagen, oder ähnliche, DNA-Kits. Bewerten Konzentration und Reinheit mittels UV-Spektroskopie. Typische Ausbeuten von DNA sollte im Bereich von 100-200 pg, die routinemäßig an eine funktionierende Bestand von 1 ug / ul verdünnt werden. </li></ol> 2. Die Transfektion von EA.hy 926 Cells <ol><li> Split EA.hy 926 Zellen 4, in Komplett-DMEM (DMEM +10% Fötales Rinderserum + Pen. / Strep.) In MatTek Deckglas (Nr. 0) 35 mm Gerichte mit 2 mL Medium. Sie können konservativ zu erhalten ~ 15 Gerichte (~ 90% konfluent am folgenden Tag) aus einer 15 cm konfluenten Schale. Bereiten Sie ein Gericht um die Expression von einzelnen Rezeptor, sowie ein Gericht für jeden Rezeptor-Paar zu bewerten. </li><li> Lassen Sie die Zellen zu inkubieren in 5% CO 2-Atmosphäre über Nacht bei 37 ° C. Am nächsten Tag sollte der Kulturen ~ 70-90% konfluent sein. </li><li> Am Tag der Transfektion, bereiten die Nukleolipid Komplexe durch Mischen von 2 ug des chimären Rezeptors Vektor-DNA (2 mL) mit 8 ul Fugene6 in 200 ul vorgewärmtes OptiMEM. Für Rezeptor-Paare, transfizieren mit 1 ug jeder Rezeptor, für eine Gesamtmenge von 2 pg (Siehe auch die Diskussion unten). </li><li> Vorsichtig mischen durch Umdrehen. </li><li> Weiter bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubieren. </li><li> Während der Inkubationszeit, bereiten die Zellen für die Transfektion. Absaugen frischen Medien und waschen jede Platte vorsichtig und kurz mit warmem PBS vor der Zugabe von 2 mL vorgewärmten complete-DMEM ohne Antibiotika (DMEM + FBS). Es ist wichtig, um die Anwesenheit von Penicillin und Streptomycin zu vermeiden, da sie wesentlich mehr Zellen toxisch sind während der Behandlung mit Fugene6. </li><li> Fügen Sie die komplexen tropfenweise zu den Zellen und inkubieren für eine weitere 20-24 Stunden bei 37 ° C in einer 5% CO 2-Atmosphäre. </li><li> Nach 24 Stunden sorgfältig absaugen die Medien aus den Zellen und Pipette frisches vollständiges-DMEM mit Antibiotika. Nach der Transfektion die Lebensfähigkeit der Zellen sollte relativ hoch bleiben, also wenig bis gar keine schwimmenden Zellen beobachtet werden sollte. </li><li> Die Genexpression wird in der Regel maximal nach einer weiteren 48-60 Stunden nach der Transfektion. Allerdings ist Bildgebung in der Regel möglich, in so kurz wie 24 Stunden. Zeitlicher Verlauf Experimente für eine optimale Genexpression durchgeführt werden soll. </li></ol> 3. Konfokale Bildgebung und FRET-Analyse Live Cell Imaging ist auf einem Leica TCS-SP2 AOBS konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit blauen Diode (405 nm), Argon (458, 476, 488, 514 nm) ausgestattet war. grünen HeNe (543 nm), orange HeNe (594 nm) und roten HeNe (633 nm)-Laser, ein HCX PI Apo 63x/1.3 na Glycerin-Immersions-Objektiv, einem motorisierten XY-Tisch (Märzhäuser) und einem kontrollierten Umweltbedingungen ( Temperatur, Luftfeuchtigkeit und CO 2) Bühne Inkubator (Pecon). Experimentelle Kontrollen sind wichtig, um Fluorophor cross-talk zwischen der Emission Kanäle sowie Ausdruck auswerten Fragen und unspezifische Fluorophor Multimerisierung beseitigen. Als solche sind einzelne Fluorophor Transfektionen für die Einrichtung jedes Bild Session genutzt. Negative FRET Kontrollen (unter Verwendung von bekannten wechselwirkenden Rezeptoren) müssen durchgeführt werden, um dadurch den Hintergrund herauszurechnen FRET, das auftritt, durch Überexpression. <ol><li> Zur Vermeidung von Übersprechen zwischen den Emissions-Kanäle für CFP und YFP, Ort der GFP Expression Kontrolle in die Stufe Inkubator. Mit weißem Licht, stellen Sie die Z-Platte zu konzentrierenzu den Zellen. </li><li> Set SP-Fenster Einstellungen für Emissions-Detektion von GFP 465-505 nm und YFP zu 525-600 nm. </li><li> Während die Überwachung sowohl Emissions-Kanäle, erregen die GFP bei 458 nm. Mit dem AOTF, setzen Sie die Laserleistung auf nennenswerte Blutung über der GFP zu beseitigen in der YFP-Emission-Kanal. Speichern Sie diese Einstellung. </li><li> Führen Sie die gleiche Steuerung für YFP Übersprechen (mit dem YFP Ausdruck control) in der GFP-Kanal durch die Anpassung der Erregung Leistung bei 514 nm für die Zellen, die nur YFP. Speichern Sie diese Einstellung. </li><li> Nächster Ort Zellen co-exprimierenden CFP und YFP in das Stadium Inkubator. Anhand der Sequenzdaten Einstellung für die Leica konfokalen Software, suchen Sie exprimieren ähnliches Niveau von CFP und YFP mit der richtigen Membran Lokalisierung. </li><li> Mit der Leica Software Akzeptor Photobleaching Programm, stellen Sie den Donor-und Akzeptor-Einstellungen, um Ihre gespeicherten CFP und YFP-Einstellungen, anständig. </li><li> Zoomen auf die Zelle, markieren Sie den ROI (Region of Interest), in dem das Foto-Zerstörung von YFP ist auf der Zellmembran auftreten und beginnen das Programm. </li><li> Für Foto-Zerstörung des Akzeptors, passen Sie die AOTF zu 100% bei 514 nm und damit der Laser-Bleaching, weiterhin bis zu 70% der YFP-Emission erschöpft ist. Zur Beschleunigung Bleichen, sind ROIs in der Regel im Raster-Achse des Lasers (X-Achse) gewählt. </li><li> Während Foto-Bleichen, überwachen die zelluläre Bewegung und lehnen Messungen mit nennenswerten Bewegung in der XY-Ebene erhalten, da diese Messungen können Bericht falsch FRET Effizienz. </li><li> Pre-und Post-Bleiche Bilder sind für beide Donor (CFP) und Akzeptor (YFP) erfasst und FRET-Effizienz wie folgt berechnet: FRET Eff = (D post-D pre) / D Beitrag für alle D Beitrag&gt; D vor dem D vor und D Beitrag ist der Spender Intensität vor und nach dem Ausbleichen bzw.. </li><li> JMP Software (SAS) wird verwendet, um das Ausmaß der experimentellen Variabilität zu bestimmen. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Transfektionseffektivitäten sind in der Regel zwischen 30 bis 40%. Trotz früherer Befunde von anderen, haben wir nicht gesehen, dass die Transfektion und Expression von einem Vektor, der anderen begünstigt. In der Tat, wir häufig beobachten, exklusive Expression von einem Fluorophor Chimäre oder das andere. Typische FRET Effizienzen variieren zwischen Rezeptor-Systeme. Für den Tie-Rezeptor-System, sind typische Werte 20-28% für Epithelzellen und 19-23% in Endothelzellen. Für negative Kontrollen sind typische Wirkungsgrade unter 2-3%. Das Ausmaß der Variabilität wird deutlich sinken mit Erfahrung. <img src="/files/ftp_upload/2149/2149fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Repräsentative Bilder von transfizierten EA.hy 926 Zellen. A) DIC Bild EA.hy 926 Zellmonolayer. B) Fluoreszenzbild von Zellen in (A) angezeigt. C) Überlagerung von (A) und (B) demonstriert ~ 20-30% Transfektionseffizienz. <img src="/files/ftp_upload/2149/2149fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Vertreter Akzeptor Photobleaching Analyse von FRET zwischen CFP und YFP vorkommenden in einer EA.hy926 Zelle. Die GFP-Emission-Kanal (obere Bilder) und YFP-Emission-Kanal (unten zwei Tafeln) wurden separat vor überwacht und post-Akzeptor Bleichen. Photobleaching Experimente wurden eingeschränkt, und FRET-Werte aus, die Region in der grünen Box berechnet. FRET-Effizienz wird als absolute reichen von hoch (rot-1.0) zu niedrig ist (lila-0.0) auf einem vergrößerten Überlagerung eines CFP / YFP angezeigt zusammengefügte Bild nur zur Orientierung.

<ol><li>Kim, M., Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+transmembrane+signaling+by+cytoplasmic+domain+separation+in+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bidirectional transmembrane signaling by cytoplasmic domain separation in integrins.</a> Science. 301, 1720-1725 (2003).</li>
<li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+lipidmodified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Partitioning of lipidmodified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296, 913-916 (2002).</li>
<li>Seegar, T. C. M., Eller, B., Tzvetkova-Robev, D., Kolev, M., Henderson, S. C., Nikolov, D. B., Barton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tie1-Tie2+interactions+mediate+functional+differences+between+angiopoietin+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Tie1-Tie2 interactions mediate functional differences between angiopoietin ligands.</a> Molecular Cell. 37 (5), 643-655 (2010).</li>
<li>Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+cell+line+expressing+human+factor+VIII-related+antigen+established+by+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (12), 3734-3737 (1983).</li>
</ol>

Es gibt mehrere Schritte, die für den Erfolg entscheidend sind. Der prominenteste unter ihnen ist die relative Bedeutung der Ausdruck zwischen den beiden chimären Rezeptoren. Zur Umgehung dieses Problems, kann man machen, stabilen Zelllinien, sowohl Proteine ​​von Interesse, oder ermitteln die optimale Verhältnis von Vektor-DNA zu gleichwertigen Ausdruck zu ermöglichen. Auch aufgrund der uneinheitlichen Transfektion in eine Schüssel, werden Protein-Ebene nur selten gleichwertig zwischen den Zellen. Deshalb ist darauf zu achten, um &quot;high&quot; Expressoren von «niedrig» zu unterscheiden. Diejenigen, die Anzeige &quot;durchschnittlichen&quot; Mengen an Protein in der Regel liefern zuverlässige und reproduzierbare FRET Effizienz. Eine Methode, unser Labor verfolgt, um dieses Problem zu lindern, ist die Verwendung von Adeno-und Lenti-Viren &quot;, auch&quot; Gen-Expression. Darüber hinaus FRET eine alternative Methode zur Akzeptor Photobleaching zur Bestimmung Effizienz ist sensibilisierte Emission. Obwohl trotz des Potenzials der sensibilisierte Emission auf einzelne Zellen in Echtzeit zu überwachen, haben wir Akzeptor Photobleaching empfindlicher und zuverlässiger gefunden. Schließlich kann mittels FRET zu Protein-Wechselwirkungen Monitor eine Herausforderung sein, und erfordert eine sorgfältige Auswahl der Linker Längen für membrangebundene Rezeptoren. Darüber hinaus Zugabe von C / YFP oft einen großen Einfluss auf die Proteinexpression Ebenen und die Ergebnisse in die Aggregation im endoplasmatischen Retikulum und Golgi-Apparat. Doch für transiente oder instabil, Interaktionen, ist FRET die ideale Methode zu nutzen.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960-069</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Hyclone</td><td>N/V</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>FUGENE 6</td><td>Roche-Gruppe</td><td>11814443001</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas-Schalen</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G014C</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1(+)</td><td>Invitrogen</td><td>V790&amp;#8208;20</td><td></td></tr><tr><td>Mach-1-kompetente Zellen</td><td>Invitrogen</td><td>C862003</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging protein-protein-wechselwirkungen in vivo</em

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-Protein-Interaktionen sind ein Markenzeichen aller wesentlichen zellulären Prozessen. Allerdings sind viele dieser Wechselwirkungen transiente oder energetisch schwach, die Verhinderung ihrer Identifizierung und Analyse durch traditionelle biochemische Methoden wie Co-Immunopräzipitation. In dieser Hinsicht haben die genetisch kodierbaren fluoreszierende Proteine ​​(GFP, RFP, etc.) und die damit verbundenen überlappenden Fluoreszenzspektrum revolutioniert unsere Fähigkeit, schwache Wechselwirkungen in vivo mit Förster resonance energy transfer (FRET) 1-3 überwachen. Hier Detail haben wir den Einsatz eines FRET-basierten Proximity Assay zur Überwachung Rezeptor-Rezeptor-Wechselwirkungen auf der endothelialen Zelloberfläche.

Dieses Protokoll beschreibt, wie Bild-Protein-Protein-Interaktionen mit Hilfe eines FRET-basierten Proximity Assay.

Imaging Protein-Protein-Wechselwirkungen In vivo</em

Protein-Protein-Interaktionen sind ein Kennzeichen aller essenziellen zellulären Prozesse. Viele dieser Interaktionen sind jedoch transient oder energetisch schwach, ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, das Vorhandensein von Protein-Protein-Interaktionen auf der Zelloberfläche zu überprüfen. Dies wird erreicht, indem zwei Rezeptoren der Untersuchung kloniert und in einem zweiten Schritt jeweils an zwei Fluorophore mit überlappenden Emissionsspektren fusioniert werden. Die beiden Vektoren werden anschließend simultan in endotheliale Zellen transfiziert, um die Expression der Rezeptoren zu ermöglichen.An diesem Punkt unterstützen die Fluorophore bei der Beurteilung des Gesamtausmaßes der Expression sowie der Rezeptorlokalisation. Danach werden die Bildgebungsparameter mithilfe einer Einzeltransfektion als Kontrolle am konfokalen Mikroskop festgelegt. Individuell transfizierte Zellen werden basierend auf ihren relativen Stufen der Rezeptorexpression und -lokalisation ausgewählt.Bereiche innerhalb dieser Zellen werden anschließend abgebildet, um das Ausmaß der FRET-Ergebnisse zu bewerten, die TIE1- und TIE2-Interaktionen an der Oberfläche endothelialer Zellen auf der Grundlage von FRET und konfokaler Mikroskopie zeigen. Hallo, ich bin Tom Seger aus dem Labor von Dr. William Barton am Department für Biochemie und Molekularbiologie der Virginia Commonwealth University.Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in endothelialen Zellen mittels FRET-basierter konfokaler Mikroskopie. In unserem Labor verwenden wir dies, um Rezeptorinteraktionen während der Angiogenese zu untersuchen. Beginnen wir also.Um Protein-Protein-Interaktionen mithilfe eines FRET-basierten Annäherungsassays abzubilden, klonen Sie zunächst Ihre Rezeptoren der Untersuchung in die NheI- und EcoRI-Stellen des pCD, eines 3.1-Hydro- oder Neo-Vektors, der monomeres CFP oder YFP enthält. Die Bestimmung von FRET ist empirisch und hängt entscheidend von der Länge des Linkers zwischen dem transmembranen Bereich und dem Beginn des Fluorophors ab. Daher müssen für jedes neue zu untersuchende Rezeptorpaar mehrere verschiedene Linkerlängen erforscht werden. Transformieren und amplifizieren Sie die Vektoren gemäß des beigefügten Protokolls.Dann transfectionsfähige DNA herstellen, die Vektoren gemäß dem beigefügten Protokoll transformieren und amplifizieren. Anschließend die transfectionsfähige DNA herstellen und auf eine Arbeitskonzentration von einem Mikrogramm pro Mikroliter verdünnen, um die Zellen unter einer Zellkulturhaube für die Transfektion vorzubereiten; EAHY 926-Zellen, die in vollständigem DMEM gezüchtet wurden, in mit Deckgläsern ausgelegte 35-Millimeter-Kulturschalen mit je zwei Milliliter Medium aufteilen. Eine Schale zur Evaluierung der Expression jedes einzelnen Rezeptors sowie jeweils eine Schale für jedes Rezeptorpaar vorbereiten.Lassen Sie die Zellen am folgenden Tag in einer Atmosphäre mit über 95 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die Kultur sollte am Tag der Transfektion etwa 70 bis 90 % Konfluenz aufweisen. Bereiten Sie Nukleolipid-Komplexe zu, indem Sie zwei Mikrogramm der chimären Rezeptor-Vektor-DNA mit acht Mikrolitern Fuji N HD in 200 Mikrolitern vorgewärmtem Optimum mischen; für Rezeptorpaare transfectieren Sie ein Mikrogramm jedes Rezeptors, insgesamt zwei Mikrogramm, und mischen vorsichtig durch Umstülpen. Inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur.Während der Inkubationszeit bereiten Sie die Zellen für die Transfektion vor, indem Sie das frische Medium abpipettieren und jede Platte vorsichtig und kurz mit warmer PBS waschen, bevor Sie zwei Milliliter vorgewärmtes komplettes DMEM ohne Antibiotika hinzufügen. Es ist wichtig, die Anwesenheit von Penicillin und Streptomycin zu vermeiden, da diese während der Behandlung mit dem FU-Gen-HD-Komplex deutlich toxischer für die Zellen sind. Geben Sie den Komplex tropfenweise zu den Zellen und inkubieren Sie weitere 20 bis 24 Stunden. Nach 24 Stunden pipettieren Sie das Medium vorsichtig von den Zellen ab und geben frisches komplettes DMEM mit Antibiotika nach der Transfektion hinzu.Die Zellviabilität sollte relativ hoch bleiben. Es sollten nur wenige bis keine schwebenden Zellen beobachtet werden. Für die Live-Cell-Bildgebung verwenden wir ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop vom Typ A-T-C-S-P two A OBS, das mit blauen Dioden-Argon- sowie grünen, orangefarbenen und roten Helium-Neon-Lasern ausgestattet ist, sowie ein H-C-X-P-I-A-O 63x/1,3 NA Glycerin-Immersion, eine motorisierte XY-Bühne und einen Bühneninkubator mit kontrollierter Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Kohlendioxidkonzentration.Experimentelle Kontrollen sind entscheidend, um Fluoreszenz-Übersprechen zwischen den Emissionskanälen sowie Expressionsprobleme und unspezifische Fluor-markierung auszuschließen. Daher werden einzelne fluor-markierte Transfektionen für die Einrichtung jeder Bildaufnahmesitzung verwendet, um Übersprechen zwischen den Emissionskanälen für CFP und YFP zu vermeiden. Platzieren Sie die CFP-Expressionskontrolle unter Verwendung von Weißlicht in den Inkubator auf dem Mikroskoptisch.Stellen Sie die Z-Platte ein, um auf die Zellen zu fokussieren. Legen Sie die SP-Fenstereinstellungen für die Emissionsdetektion von CFP auf 465 bis 505 und für YFP auf 525 bis 600 Nanometer fest, während Sie beide Emissionskanäle überwachen, und regen Sie CFP bei 458 Nanometern an. Stellen Sie mithilfe der A-OTF die Laserleistung so ein, dass eine signifikante Übersprechen von CFP in den YFP-Emissionskanal vermieden wird.Speichern Sie diese Einstellung. Führen Sie die gleiche Kontrolle für YFP-Crosstalk im CFP-Kanal durch, indem Sie die Anregungsleistung bei 514 Nanometern anpassen. Bei Zellen, die nur YFP exprimieren, speichern Sie diese Einstellung.Als Nächstes geben Sie Zellen, die CFP und YFP koexprimieren, in den Inkubator auf dem Objekttisch. Verwenden Sie die Sequenzeinstellung der LICO-Konfokalsoftware. Suchen Sie mit der LICO-Software Zellen mit ähnlichen Expressionsniveaus von CFP und YFP und einer korrekten Membranlokalisation, mit Ausnahme eines Software-akzeptierten Photobleich-Programms.Stellen Sie die Donor- und Akzeptoreinstellungen entsprechend Ihren gespeicherten Einstellungen für CFP bzw. YFP ein. Zoomen Sie auf die Zelle heran, markieren Sie einen interessierenden Bereich oder ROI, in dem die photochemische Zerstörung von YFP an der Zellmembran erfolgen soll, und starten Sie das Programm zur photochemischen Zerstörung des Akzeptors. Stellen Sie die A-OTF auf 100 % von 514 Nanometern ein und lassen Sie die Laser-Bleaching-Behandlung so lange fortlaufen, bis 70 % der YFP-Emission erschöpft sind.Um die Bleichung zu beschleunigen, werden die ROIs typischerweise entlang der Rasterachse des Lasers während der Photobleichung gewählt. Überwachen Sie die zelluläre Bewegung und verwerfen Sie Messungen, bei denen eine deutliche Bewegung in der XY-Ebene auftritt. Da solche Messungen zu falschen FRET-Effizienzwerten führen können, werden vor und nach der Bleichung Bilder sowohl für den Donor als auch für den Akzeptor aufgezeichnet, und die FRET-Effizienz wird berechnet als: FRET-Effizienz = (D₀,post – DLO) / Dpost für alle Dpost > Dpre, wobei Dpre und Dpost die Donor-Intensitäten vor bzw. nach der Photobleichung sind.JMP wird verwendet, um das Ausmaß der experimentellen Variabilität zu bestimmen. Einzelne Rezeptoren sollten sowohl mit CFP als auch mit YFP und unterschiedlich langen juxtamembranären Sequenzen fusioniert werden. Um das bestmögliche Paar von Rezeptor-FRET-Partnern zu identifizieren, liegen die Transfektionseffizienzen typischerweise zwischen 30 und 40 %, trotz früherer Befunde anderer Arbeitsgruppen.Wir haben nicht beobachtet, dass die Transfektion und Expression eines Vektors die des anderen begünstigt. Tatsächlich sehen wir häufig eine ausschließliche Expression einer der beiden Farbstoffe, entweder KY oder des anderen. Diese repräsentativen Bilder zeigen eine Akzeptor-Photobleaching-Analyse des FRET-Effekts zwischen CFP und YFP in einer EAHY 926-Zelle.Die CFP- und YFP-Emissionskanäle wurden vor und nach der Photobleichung separat überwacht, und die Berechnungen beschränkten sich auf den Bereich innerhalb des roten Kastens. Die FRET-Effizienz wird als absoluter Bereich von hoch (rot gefärbt) bei 1,0 bis niedrig (lila gefärbt) bei null auf einer vergrößerten Überlagerung des A-C-F-P-Y-F-P-Mischbildes ausschließlich zu Orientierungszwecken für das T-Rezeptorsystem angezeigt. Typische FRET-Effizienzwerte liegen bei epithelialen Zellen zwischen 20 und 28 % und bei endothelialen Zellen zwischen 19 und 23 %, wie hier gezeigt.Wenn diese Technik einmal beherrscht ist, dauert sie normalerweise drei bis vier Tage, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass die Länge des Linkers zwischen dem Zielprotein und dem fusionierten fluoreszierenden Protein sowie deren Expressionslevel und zelluläre Beweglichkeit die FRET-Messung nach dem Verfahren direkt beeinflussen. Darüber hinaus können biochemische Assays zur Signalaktivierung durchgeführt werden, um Einblicke in die Signaltransduktionswege nach deren Entwicklung zu erhalten.Diese Technik ermöglicht einen Nachweis, mit dem entweder schwache oder vorübergehende Protein-Protein-Interaktionen untersucht werden können. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eigene FRET-basierte Annäherungsassays an lebenden Zellen durchführen. Und vergessen Sie nicht, dass bei der Arbeit mit Zellen in Zellkultur stets die geeigneten Sicherheitsvorkehrungen eingehalten werden sollten.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren zukünftigen FRET-Experimenten.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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