Imaging Protein-Protein-Wechselwirkungen In vivo

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, das Vorhandensein von Protein-Protein-Wechselwirkungen auf der Zelloberfläche zu bewerten. Dies wird durch die Klonierung von zwei Rezeptoren von Interesse erreicht, einem Myoterminal zu zwei Fluorophoren, die in einem zweiten Schritt überlappende Emission und Spektren aufweisen. Die beiden Vektoren werden gleichzeitig in Endothelzellen transfiziert, um die Rezeptorexpression zu ermöglichen.

Zu diesem Zeitpunkt helfen die Fluorophore bei der Bewertung des Gesamtausmaßes der Expression sowie der Rezeptorlokalisation. Anschließend werden die Bildgebungsparameter mit Hilfe eines einzelnen Transfekts als Kontrolle am konfokalen Mikroskop ermittelt. Einzeln werden die transfizierten Zellen auf der Grundlage ihres relativen Niveaus der Rezeptorexpression und -lokalisation ausgewählt.

Regionen innerhalb dieser Zellen werden dann abgebildet, um das Ausmaß der Bünde zu bewerten. Diese zeigen die Verknüpfung von eins und zwei Wechselwirkungen auf der Endothelzelloberfläche, basierend auf der fre- und konfokalen Mikroskopie. Hallo, ich bin Tom Seger aus dem Labor von Dr. William Barton in der Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie an der Virginia Commonwealth University.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in Endothelzellen durch eine bundbasierte konfokale Mikroskopie. In unserem Labor nutzen wir dies, um Rezeptorinteraktionen während der Angiogenese zu untersuchen. Also lasst uns loslegen.

Um Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einem bundbasierten Proximity-Assay abzubilden, klonen Sie zunächst Ihre interessierenden Rezeptoren in die NHE-, eine-, eco-R-One-Stelle des pcd, einen 3.1-Hydro- oder Neo-Vektor, der monomeres CFP oder YFP enthält. Die Bestimmung des Bunds ist empirisch und hängt entscheidend von der Länge des Linkers zwischen der Transmembran überspannenden Region und dem Beginn des Fluors ab. Daher müssen für jedes neue Rezeptorpaar, das untersucht wird, mehrere verschiedene Linker-Glieder untersucht werden, transformieren und amplifizieren Sie die Vektoren gemäß dem begleitenden Protokoll.

Bereiten Sie dann DNA in Transfektionsqualität vor, transformieren und amplifizieren Sie die Vektoren gemäß dem begleitenden Protokoll. Bereiten Sie dann DNA in Transfektionsqualität vor und verdünnen Sie sie auf eine Arbeitskonzentration von einem Mikrogramm pro Mikroliter, um die Zellen für die Transfektion vorzubereiten: Unter einer Gewebekulturhaube werden EAHY 92 6-Zellen, die in vollständigem DMEM gezüchtet wurden, in 35-Millimeter-Schalen mit zwei Millilitern Medium aufgeteilt. Bereiten Sie eine Schale zu, um die Expression jedes einzelnen Rezeptors zu bewerten, sowie eine Schale für jedes Rezeptorpaar.

Lassen Sie die Zellen am nächsten Tag über 95 % Kohlendioxidatmosphäre bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die Kultur sollte am Tag der Transfektion etwa 70 bis 90 % Konfluenz aufweisen. Bereiten Sie Nukleolipidkomplexe vor, indem Sie zwei Mikrogramm der chimären Rezeptorvektor-DNA mit acht Mikrolitern Fuji N HD in 200 Mikrolitern Vorwarmoptimum für Rezeptorpaare mischen, transfizieren Sie mit einem Mikrogramm jedes Rezeptors für insgesamt zwei Mikrogramm, mischen Sie sanft durch Inversion und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Während der Inkubationszeit werden die Zellen für die Transfektion vorbereitet, frische Medien abgesaugt und jede Platte vorsichtig und kurz mit warmem PBS gewaschen, bevor zwei Milliliter vollständiges DMEM aus der Vorkriegszeit ohne Antibiotika hinzugefügt werden. Es ist wichtig, das Vorhandensein von Penicillin und Streptomycin zu vermeiden, da sie während der Behandlung erheblich toxischer für Zellen sind Mit dem FU-Gen HD am Komplex tropfenweise zu den Zellen Und inkubieren Sie für weitere 20 bis 24 Stunden. Nach 24 Stunden das Medium vorsichtig aus den Zellen aspirieren und nach der Transfektion frisches vollständiges DMEM mit Antibiotika pipettieren.

Die Zellviabilität sollte relativ hoch bleiben. Es sollten nur wenige bis keine schwimmenden Zellen beobachtet werden. Um die Bildgebung lebender Zellen durchzuführen, verwenden wir ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop wie A-T-C-S-P mit zwei OBS, das mit blauen Dioden-Argon- und grünen, orangefarbenen und roten Helium-Neonlasern ausgestattet ist, ein H-C-X-P-I-A-O 63 x 1,3 NA Glycerin-Immersion, einen motorisierten XY-Tisch und einen Temperatur-, Feuchtigkeits- und Kohlendioxid-kontrollierten Tischinkubator.

Experimentelle Kontrollen sind von entscheidender Bedeutung, um das Übersprechen von Fluor zwischen den Emissionskanälen zu eliminieren sowie Expressionsprobleme und unspezifische Fluor-Vier-Verbindungen zu bewerten. Daher werden einzelne Fluoro-Vier-Transfekten für die Einrichtung jeder Bildsitzung verwendet, um das Übersprechen zwischen den Emissionskanälen für CFP und YFP zu eliminieren. Platzieren Sie das CFP-Ausdruckssteuerelement mit weißem Licht im Bühneninkubator.

Passen Sie die Z-Platte so an, dass sie auf die Zellen fokussiert wird. Legen Sie die SP-Fenstereinstellungen für die Emissionsdetektion von CFP auf 465 bis 505 und YFP auf 525 bis 600 Nanometer fest, während Sie beide Emissionskanäle überwachen, um die CFP bei 458 Nanometern anzuregen. Mit dem A OTF stellen Sie die Laserleistung so ein, dass ein nennenswertes Überbluten von CFP in den YFP-Emissionskanal vermieden wird.

Speichern Sie diese Einstellung. Führen Sie die gleiche Steuerung für das YFP-Übersprechen im CFP-Kanal durch, indem Sie die Anregungsleistung auf 514 Nanometer einstellen. Die Zellen, die nur YFP exprimieren, speichern diese Einstellung.

Als nächstes, nächstes Ort, coex Zellen, die CFP und YFP exprimieren, in den Stage-Inkubator. Verwendung der Sequenzeinstellung für die konfokale LICO-Software. Lokalisieren Sie Zellen, die ähnliche Mengen an CFP und YFP exprimieren, mit der richtigen Membranlokalisierung unter Verwendung der LICO-Software, mit Ausnahme eines Software-Akzepter-Photobleichprogramms.

Legen Sie die Spender- und Annahmeeinstellungen auf Ihre gespeicherten CFP- bzw. YFP-Einstellungen fest. Zoomen Sie auf die Zelle, markieren Sie eine Region von Interesse oder ROI, in der die Photozerstörung von YFP auf der Zellmembran stattfinden soll Und starten Sie das Programm Für die Photozerstörung des Akzeptors. Stellen Sie den A-OTF auf 100 % von 514 Nanometern ein und lassen Sie das Laserbleichen so lange weitergehen, bis 70 % der YFP-Emission aufgebraucht sind.

Um das Bleichen zu beschleunigen, werden die ROIs während des Photobleachings in der Regel in der Rasterachse des Lasers ausgewählt. Überwachen Sie die Zellbewegung und unterwerfen Sie Messungen, die mit nennenswerten Bewegungen in der XY-Ebene durchgeführt wurden. Da diese Messungen falsche Bundeffizienzen anzeigen können, werden Bilder vor und nach dem Bleichen sowohl für den Spender als auch für den Akzeptor aufgezeichnet, und die Bundeffizienz wird berechnet, da die Bundeffizienz gleich dem offenen übergeordneten Stift abzüglich der DLO-Klammern dividiert durch den Depost für alle Deposts größer als D pre ist, wobei D, pre und D post die Donorintensitäten vor bzw. nach dem Photobleaching sind.

JMP wird verwendet, um das Ausmaß der experimentellen Variabilität zu bestimmen. Einzelne Rezeptoren sollten sowohl mit CFP als auch mit YFP fusioniert werden, wobei die Juxta-Membransequenz unterschiedlich lang ist. Um das bestmögliche Paar von Rezeptorbundpartnern zu identifizieren, liegt die Transfektionseffizienz in der Regel zwischen 30 und 40 %, trotz früherer Erkenntnisse anderer.

Wir haben nicht gesehen, dass die Transfektion und Expression des einen Vektors die des anderen begünstigt. In der Tat beobachten wir häufig die exklusive Ausprägung der einen oder anderen Flora, vier KY-Spiegel. Diese repräsentativen Bilder zeigen eine Akzeptor-Photobleaching-Analyse von Bünden, die zwischen CFP und YFP in einer EAHY 9 26-Zelle auftreten.

Die CFP- und YFP-Emissionskanäle wurden vor und nach der Photobleiche getrennt überwacht und die Berechnungen auf die Region beschränkt. Innerhalb des roten Kästchens wird die Bundeffizienz als absoluter Bereich von hoch gefärbtem Rot bei 1,0 bis niedrig gefärbtem Violett bei Null auf einer vergrößerten Überlagerung von A-C-F-P-Y-F-P zusammengeführtem Bild nur zu Orientierungszwecken für das T-Rezeptor-System angezeigt. Typische Bundeffizienzwerte liegen bei 20 bis 28 % für Epithelzellen und 19 bis 23 % für Endothelzellen.

Wenn diese Technik einmal gemeistert ist, dauert es in der Regel drei bis vier Tage, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Linkerlänge zwischen Ihrem Zielprotein und dem fluoreszierenden Fusionsprotein sowie deren Expressionsniveaus und Zellbewegungen die Bundmessung nach dem Eingriff direkt beeinflussen. Darüber hinaus können biochemische Assays zur Signalaktivierung durchgeführt werden, um Einblicke in die Signaltransduktionswege nach ihrer Entwicklung zu gewinnen.

Diese Technik stellt einen Assay zur Verfügung, in dem Protein-Protein-Wechselwirkungen, die entweder schwach oder vorübergehend sind, untersucht werden können. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ihre eigenen bundbasierten Proximity-Assays und lebenden Zellen durchführen können. Und vergessen Sie nicht, dass bei der Arbeit mit Zellen in Gewebekulturen immer angemessene Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden sollten.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren zukünftigen Bundexperimenten.