Imaging Protein-Protein-Wechselwirkungen In vivo

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, das Vorhandensein von Protein-Protein-Interaktionen auf der Zelloberfläche zu überprüfen. Dies wird erreicht, indem zwei Rezeptoren der Untersuchung kloniert und in einem zweiten Schritt jeweils an zwei Fluorophore mit überlappenden Emissionsspektren fusioniert werden. Die beiden Vektoren werden anschließend simultan in endotheliale Zellen transfiziert, um die Expression der Rezeptoren zu ermöglichen.

An diesem Punkt unterstützen die Fluorophore bei der Beurteilung des Gesamtausmaßes der Expression sowie der Rezeptorlokalisation. Danach werden die Bildgebungsparameter mithilfe einer Einzeltransfektion als Kontrolle am konfokalen Mikroskop festgelegt. Individuell transfizierte Zellen werden basierend auf ihren relativen Stufen der Rezeptorexpression und -lokalisation ausgewählt.

Bereiche innerhalb dieser Zellen werden anschließend abgebildet, um das Ausmaß der FRET-Ergebnisse zu bewerten, die TIE1- und TIE2-Interaktionen an der Oberfläche endothelialer Zellen auf der Grundlage von FRET und konfokaler Mikroskopie zeigen. Hallo, ich bin Tom Seger aus dem Labor von Dr. William Barton am Department für Biochemie und Molekularbiologie der Virginia Commonwealth University.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in endothelialen Zellen mittels FRET-basierter konfokaler Mikroskopie. In unserem Labor verwenden wir dies, um Rezeptorinteraktionen während der Angiogenese zu untersuchen. Beginnen wir also.

Um Protein-Protein-Interaktionen mithilfe eines FRET-basierten Annäherungsassays abzubilden, klonen Sie zunächst Ihre Rezeptoren der Untersuchung in die NheI- und EcoRI-Stellen des pCD, eines 3.1-Hydro- oder Neo-Vektors, der monomeres CFP oder YFP enthält. Die Bestimmung von FRET ist empirisch und hängt entscheidend von der Länge des Linkers zwischen dem transmembranen Bereich und dem Beginn des Fluorophors ab. Daher müssen für jedes neue zu untersuchende Rezeptorpaar mehrere verschiedene Linkerlängen erforscht werden. Transformieren und amplifizieren Sie die Vektoren gemäß des beigefügten Protokolls.

Dann transfectionsfähige DNA herstellen, die Vektoren gemäß dem beigefügten Protokoll transformieren und amplifizieren. Anschließend die transfectionsfähige DNA herstellen und auf eine Arbeitskonzentration von einem Mikrogramm pro Mikroliter verdünnen, um die Zellen unter einer Zellkulturhaube für die Transfektion vorzubereiten; EAHY 926-Zellen, die in vollständigem DMEM gezüchtet wurden, in mit Deckgläsern ausgelegte 35-Millimeter-Kulturschalen mit je zwei Milliliter Medium aufteilen. Eine Schale zur Evaluierung der Expression jedes einzelnen Rezeptors sowie jeweils eine Schale für jedes Rezeptorpaar vorbereiten.

Lassen Sie die Zellen am folgenden Tag in einer Atmosphäre mit über 95 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die Kultur sollte am Tag der Transfektion etwa 70 bis 90 % Konfluenz aufweisen. Bereiten Sie Nukleolipid-Komplexe zu, indem Sie zwei Mikrogramm der chimären Rezeptor-Vektor-DNA mit acht Mikrolitern Fuji N HD in 200 Mikrolitern vorgewärmtem Optimum mischen; für Rezeptorpaare transfectieren Sie ein Mikrogramm jedes Rezeptors, insgesamt zwei Mikrogramm, und mischen vorsichtig durch Umstülpen. Inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur.

Während der Inkubationszeit bereiten Sie die Zellen für die Transfektion vor, indem Sie das frische Medium abpipettieren und jede Platte vorsichtig und kurz mit warmer PBS waschen, bevor Sie zwei Milliliter vorgewärmtes komplettes DMEM ohne Antibiotika hinzufügen. Es ist wichtig, die Anwesenheit von Penicillin und Streptomycin zu vermeiden, da diese während der Behandlung mit dem FU-Gen-HD-Komplex deutlich toxischer für die Zellen sind. Geben Sie den Komplex tropfenweise zu den Zellen und inkubieren Sie weitere 20 bis 24 Stunden. Nach 24 Stunden pipettieren Sie das Medium vorsichtig von den Zellen ab und geben frisches komplettes DMEM mit Antibiotika nach der Transfektion hinzu.

Die Zellviabilität sollte relativ hoch bleiben. Es sollten nur wenige bis keine schwebenden Zellen beobachtet werden. Für die Live-Cell-Bildgebung verwenden wir ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop vom Typ A-T-C-S-P two A OBS, das mit blauen Dioden-Argon- sowie grünen, orangefarbenen und roten Helium-Neon-Lasern ausgestattet ist, sowie ein H-C-X-P-I-A-O 63x/1,3 NA Glycerin-Immersion, eine motorisierte XY-Bühne und einen Bühneninkubator mit kontrollierter Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Kohlendioxidkonzentration.

Experimentelle Kontrollen sind entscheidend, um Fluoreszenz-Übersprechen zwischen den Emissionskanälen sowie Expressionsprobleme und unspezifische Fluor-markierung auszuschließen. Daher werden einzelne fluor-markierte Transfektionen für die Einrichtung jeder Bildaufnahmesitzung verwendet, um Übersprechen zwischen den Emissionskanälen für CFP und YFP zu vermeiden. Platzieren Sie die CFP-Expressionskontrolle unter Verwendung von Weißlicht in den Inkubator auf dem Mikroskoptisch.

Stellen Sie die Z-Platte ein, um auf die Zellen zu fokussieren. Legen Sie die SP-Fenstereinstellungen für die Emissionsdetektion von CFP auf 465 bis 505 und für YFP auf 525 bis 600 Nanometer fest, während Sie beide Emissionskanäle überwachen, und regen Sie CFP bei 458 Nanometern an. Stellen Sie mithilfe der A-OTF die Laserleistung so ein, dass eine signifikante Übersprechen von CFP in den YFP-Emissionskanal vermieden wird.

Speichern Sie diese Einstellung. Führen Sie die gleiche Kontrolle für YFP-Crosstalk im CFP-Kanal durch, indem Sie die Anregungsleistung bei 514 Nanometern anpassen. Bei Zellen, die nur YFP exprimieren, speichern Sie diese Einstellung.

Als Nächstes geben Sie Zellen, die CFP und YFP koexprimieren, in den Inkubator auf dem Objekttisch. Verwenden Sie die Sequenzeinstellung der LICO-Konfokalsoftware. Suchen Sie mit der LICO-Software Zellen mit ähnlichen Expressionsniveaus von CFP und YFP und einer korrekten Membranlokalisation, mit Ausnahme eines Software-akzeptierten Photobleich-Programms.

Stellen Sie die Donor- und Akzeptoreinstellungen entsprechend Ihren gespeicherten Einstellungen für CFP bzw. YFP ein. Zoomen Sie auf die Zelle heran, markieren Sie einen interessierenden Bereich oder ROI, in dem die photochemische Zerstörung von YFP an der Zellmembran erfolgen soll, und starten Sie das Programm zur photochemischen Zerstörung des Akzeptors. Stellen Sie die A-OTF auf 100 % von 514 Nanometern ein und lassen Sie die Laser-Bleaching-Behandlung so lange fortlaufen, bis 70 % der YFP-Emission erschöpft sind.

Um die Bleichung zu beschleunigen, werden die ROIs typischerweise entlang der Rasterachse des Lasers während der Photobleichung gewählt. Überwachen Sie die zelluläre Bewegung und verwerfen Sie Messungen, bei denen eine deutliche Bewegung in der XY-Ebene auftritt. Da solche Messungen zu falschen FRET-Effizienzwerten führen können, werden vor und nach der Bleichung Bilder sowohl für den Donor als auch für den Akzeptor aufgezeichnet, und die FRET-Effizienz wird berechnet als: FRET-Effizienz = (D₀,post – DLO) / Dpost für alle Dpost > Dpre, wobei Dpre und Dpost die Donor-Intensitäten vor bzw. nach der Photobleichung sind.

JMP wird verwendet, um das Ausmaß der experimentellen Variabilität zu bestimmen. Einzelne Rezeptoren sollten sowohl mit CFP als auch mit YFP und unterschiedlich langen juxtamembranären Sequenzen fusioniert werden. Um das bestmögliche Paar von Rezeptor-FRET-Partnern zu identifizieren, liegen die Transfektionseffizienzen typischerweise zwischen 30 und 40 %, trotz früherer Befunde anderer Arbeitsgruppen.

Wir haben nicht beobachtet, dass die Transfektion und Expression eines Vektors die des anderen begünstigt. Tatsächlich sehen wir häufig eine ausschließliche Expression einer der beiden Farbstoffe, entweder KY oder des anderen. Diese repräsentativen Bilder zeigen eine Akzeptor-Photobleaching-Analyse des FRET-Effekts zwischen CFP und YFP in einer EAHY 926-Zelle.

Die CFP- und YFP-Emissionskanäle wurden vor und nach der Photobleichung separat überwacht, und die Berechnungen beschränkten sich auf den Bereich innerhalb des roten Kastens. Die FRET-Effizienz wird als absoluter Bereich von hoch (rot gefärbt) bei 1,0 bis niedrig (lila gefärbt) bei null auf einer vergrößerten Überlagerung des A-C-F-P-Y-F-P-Mischbildes ausschließlich zu Orientierungszwecken für das T-Rezeptorsystem angezeigt. Typische FRET-Effizienzwerte liegen bei epithelialen Zellen zwischen 20 und 28 % und bei endothelialen Zellen zwischen 19 und 23 %, wie hier gezeigt.

Wenn diese Technik einmal beherrscht ist, dauert sie normalerweise drei bis vier Tage, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass die Länge des Linkers zwischen dem Zielprotein und dem fusionierten fluoreszierenden Protein sowie deren Expressionslevel und zelluläre Beweglichkeit die FRET-Messung nach dem Verfahren direkt beeinflussen. Darüber hinaus können biochemische Assays zur Signalaktivierung durchgeführt werden, um Einblicke in die Signaltransduktionswege nach deren Entwicklung zu erhalten.

Diese Technik ermöglicht einen Nachweis, mit dem entweder schwache oder vorübergehende Protein-Protein-Interaktionen untersucht werden können. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eigene FRET-basierte Annäherungsassays an lebenden Zellen durchführen. Und vergessen Sie nicht, dass bei der Arbeit mit Zellen in Zellkultur stets die geeigneten Sicherheitsvorkehrungen eingehalten werden sollten.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren zukünftigen FRET-Experimenten.