Ein Ex-ovo Chicken Embryo Culture-System Geeignet für Imaging und Mikrochirurgie Anwendungen

Im X-Ovo-System der Hühnerembryokultur ermöglicht die Vorbereitung der Schalenliste der Kükenembryokulturen die Untersuchung der Embryogenese. Das Verfahren beginnt mit der Gewinnung und Inkubation befruchteter Hühnereier bei 37,5 Grad Celsius für 72 Stunden. Hängematten zum Halten des Eigelbs mit den heranwachsenden Embryonen werden vorbereitet.

Als nächstes kann das Eigelb in Hängematten umgefüllt werden, und die Embryogenese setzt sich außerhalb der Schale fort. Diese Technik kann für Mikroinjektionen in das Gefäßsystem, Ultraschall und Mikrochirurgie angewendet werden, und die Ergebnisse können zeigen, wie sich Embryonen unter normalen und gestörten Bedingungen entwickeln. Hallo, mein Name ist Akshay Shaker und ich bin Masterstudent im kardiovaskulären Entwicklungslabor für Biotechnik, das von Jonathan Butcher am Department of Biomedical Engineering der Cornell University geleitet wird.

Und der Hauptvorteil unserer Technik gegenüber früheren Methoden, wie z.B. in der Ovo-Eikultur, besteht darin, dass sie einen vollständigen optischen Zugang zum Embryo sowie einen einfachen Transport ohne Beschädigung ermöglicht. Hallo, mein Name ist Char Hin. Ich bin Postdoktorand am Cardiovascular Developmental Bioengineering Laboratory, Jonathan Chu Lab am Department of Biomedical Engineering der Cornell University.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Entwicklungsbiologie zu beantworten, z. B. wie Herzfehler während der Embryogenese entstehen. Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, sterilisieren Sie alle Materialien, indem Sie sie mit 70% Ethanol abwischen. Um den Vorgang zu beginnen, füllen Sie drei Viertel eines neun Unzen schweren Plastikbechers mit warmem, sterilem Wasser.

Wiederholen Sie den Vorgang für so viele Tassen wie nötig. Ein normaler Becher mit neun Unzen hat einen oberen Durchmesser von acht Zentimetern, was die Größe ist, die für die hier vorgestellte erweiterte Kulturanwendung am besten geeignet ist. Schneiden Sie als Nächstes ein 20 Zentimeter langes Stück Frischhaltefolie ab.

Decken Sie die Oberseite des mit warmem, sterilem Wasser gefüllten Plastikbechers mit einem Stück Frischhaltefolie ab und halten Sie die Plastikfolie mit einem Gummiband an Ort und Stelle. Frischhaltefolie ist für diese Anwendung am besten geeignet, da sie ein Anhaften des Eigelbs verhindert, das zu einer Spaltung des Eigelbs führen kann. Während des Transports sollte das Plastik so verteilt werden, dass es die Wasseroberfläche berührt.

Schneiden Sie das überschüssige Plastik um das Band herum ab und wischen Sie das Plastik ab. Mit Kim-Tüchern, die mit 70 % Ethanol verheiratet sind, sind die Hängematten nun bereit, die Embryonen zu stützen. Befruchtete Hühnereier können bis zu fünf Tage vor der Inkubation bei 13 Grad Celsius gelagert werden.

Ohne die Entwicklung zu aktivieren, kann ein Rotweinkühler diese Temperatur halten, um die Eier für die Kultivierung bereit zu haben. Aktivieren Sie die Entwicklung des Embryos, indem Sie die Eier eine Stelle höher in einem Inkubator mit konstanter Luftfeuchtigkeit und kontinuierlichem Schaukeln bei 37,5 Grad Celsius für 72 Stunden inkubieren. Wenn die Eier fertig sind, nehmen Sie sie aus dem Brutkasten.

Sterilisiere die Eier, indem du mit Kim Gras mit 70% Ethanol abwischst. Legen Sie die Eizellen ein bis zwei Minuten lang horizontal auf die Seite auf einen Eierkarton, um den Embryo richtig zu positionieren. Arbeite mit maximal sechs Eiern auf einmal, da du versuchst, mehr als sechs Eier auf einmal zu knacken.

Kann dazu führen, dass die Temperatur des Ausgangsraums zu lange gehalten wird, was die Lebensfähigkeit beeinträchtigen kann. Nach ein bis zwei Minuten ist der Embryo an die Spitze der Eizelle gerutscht. Um jeden Embryo in eine Hängematte zu übertragen, arbeiten Sie aseptisch in einer Laminar-Flow-Haube.

Knacken Sie zuerst die Unterseite des Eies vorsichtig mit einer scharfen Kante, z. B. mit dem Rand eines Metalleimers oder eines Glasbechers. Denken Sie daran, dass sich der Embryo auf der Oberseite befindet. Trenne die beiden Hälften der Eierschale vorsichtig, indem du sie mit zwei Daumen zur Seite ziehst.

Legen Sie dann den Embryo, das Eigelb und das Albumin auf die Hängematte. Das Albumin sorgt für eine dämpfende Umgebung um das Eigelb und absorbiert Stöße, die durch die Bewegung des Systems verursacht werden. Das Albumin versorgt den Embryo auch während der langen Kulturperiode mit Nährstoffen.

Wenn der Transfer des Embryos ordnungsgemäß durchgeführt wird, sollte der Embryo bereits oben positioniert sein. Wenn sich der Embryo unten befindet, reiben Sie das Eigelb mit einer geschlossenen Kurve, einer kleinen Schere oder einem ähnlichen stumpfen Instrument, so dass es sich um sich selbst dreht und der Embryo nach oben wandert. Wenn Sie Embryonen über den embryonalen Tag hinaus kultivieren, verstreuen Sie zerkleinerte Eierschalenstücke in der Peripherie des Embryos als Kalziumquelle für die Knochenentwicklung und -reifung.

Nachdem der Transfer des Embryos abgeschlossen ist, stellen Sie eine Petrischale mit einem Durchmesser von 10 Zentimetern auf den Becher, um den Embryo zu versiegeln. Legen Sie die Hängematte in den auf 37,5 Grad Celsius eingestellten Inkubator. Wenn ein tragbarer Inkubator verwendet wird, stellen Sie auch ein bis zwei mit Wasser gefüllte Becher mit neun Unzen in den Inkubator.

Um die Luftfeuchtigkeit bei ca. 60% zu halten, entwickeln sich die Embryonen weiter und können für Mikroinjektionen in mikrochirurgischen Anwendungen verwendet werden. Diese Embryokultur eignet sich für Mikroinjektionsanwendungen, bei denen Lösungen in das Gefäßsystem injiziert werden müssen. Bereiten Sie zuerst die Injektionsvorrichtung vor, beginnend mit den Nadeln, indem Sie auf Mikroschmiedeweise Glaskapillarröhrchen in Mikronadeln mit abgeschrägter Spitze ziehen.

Die Größe der Spitze hängt von der gewünschten Durchflussmenge ab. Verbinden Sie die Mikronadelspritze mit einem Silikonschlauch mit einem Innendurchmesser von 0,03 Zoll. Füllen Sie den Spritzenschlauch mit einer zu injizierenden Lösung und verbinden Sie die Mikronadel der Spritze mit dem Schlauch.

Setzen Sie die Mikronadel auf den Mikromanipulator und die Spritze auf den Spritzenhalter oder die Spritzenpumpe. Sobald die Injektionseinheit fertig ist, entnehmen Sie die Embryonen. Eine horizontale Eindringtiefe der Nadel ist erforderlich, um die Nadel ordnungsgemäß in ein Blutgefäß wie ein lebenswichtiges Gefäß einzuführen.

Der Embryo muss sich daher auf der gleichen Höhe wie die Ränder der Schale befinden, in der er gehalten wird. Um den Embryo aufzuziehen, nehmen Sie das Gummiband ab, das die Plastikfolie hält, die den Embryo stützt. Hebe eine Seite des Plastiks vorsichtig an und gib etwas Wasser in den Becher, ohne den Embryo zu sehr zu bewegen.

Lege dann das Gummiband wieder auf den Kunststoff. Nachdem der Embryo aufgezogen ist, kann die Lösung in ein embryonales Gefäß injiziert werden. Beachten Sie, dass bei der Injektion eines lebenswichtigen Gefäßes die Größe der Mikronadel etwa ein Zehntel der Größe des Gefäßdurchmessers betragen muss.

Um eine effiziente Durchblutung zu gewährleisten, ohne Blutungen zu verursachen, pumpen Sie die Lösung zunächst in die Mikronadel, damit keine Luft im Inneren eingeschlossen wird. Richten Sie anschließend die Spitze der Mikronadel auf ein ausgewähltes Gefäß für lebenswichtige Gefäße aus. Wenn Sie einen for-Bereich auswählen, erhalten Sie den maximalen Bereich für das Anvisieren des Schiffes.

Sobald der Injektionsbereich definiert ist, schieben Sie die Nadel in Richtung des Gefäßes. Das Schiff zieht sich zunächst zurück. Sobald die Nadel in die Perfusion eindringt, ändert sich die Farbe des fließenden Blutes mit der Perfusion.

Wenn die Farbänderung nicht zu sehen ist, wurde die Nadel möglicherweise durch das Gefäß geschoben. In diesem Fall ziehen Sie die Mikronadel langsam zurück, während Sie gleichzeitig die Lösung pumpen, bis eine Farbänderung im Gefäß sichtbar ist. Wenn die Infusion abgeschlossen ist, ziehen Sie die Mikronadel vorsichtig aus dem Gefäß. Diese Embryokultur eignet sich auch für mikrochirurgische Anwendungen wie die linksatriale Ligatur, die am vierten Tag der Inkubation durchgeführt wird.

Bereiten Sie zunächst die Knoten vor, die mit einem Durchmesser von 0,5 Millimetern aus 10 x Nylon chirurgischer Naht verwendet werden sollen. Entfernen Sie mit einer feinen Pinzette die Chorion- und LAN-toischen Membranen aus dem Embryo. Heben Sie den Embryo von hinten an und drehen Sie ihn vertikal, so dass die linke Seite des Embryos nun oben liegt und zugänglich ist.

Entfernen Sie danach das Perikard über dem linken Vorhof. Richten Sie den Knoten über dem linken Atri aus und ziehen Sie ihn fest, indem Sie ihn von den Seiten halten und ziehen. Mit einer Pinzette sollte der Knoten so gebunden werden, dass etwa 75% des ursprünglichen Blutflusses auf die linke Seite verhindert werden. Schneiden Sie die Ränder des Knotens mit einer Mikroschere ab und entfernen und entsorgen Sie vorsichtig überschüssiges Naht.

Drehen Sie den Embryo schließlich mit der rechten Seite nach oben zurück in seine ursprüngliche Ausrichtung. Hier sind Embryonen in verschiedenen Stadien zu sehen, die mit X ovo kultiviert wurden, wie gerade gezeigt wurde, kann eine Wasserzirkulationsheizung die Umgebungsbedingungen über längere Zeiträume aufrechterhalten, was möglicherweise erforderlich sein kann. Bei bildgebenden und mikrochirurgischen Anwendungen.

Die Kükenembryonen in Kultur X Ovo sind für die Mikroinjektion geeignet. In diesem Experiment wurde ein Fluoreszenzfarbstoff in das Gefäßsystem eines mit X Ovo kultivierten Kükenembryos injiziert. Die Kükenembryonen in Kultur X ovo sind für die Mikrochirurgie geeignet.

In diesem Experiment wurde eine linksatriale Ligatur an einem X-Ovo-kultivierten Hühnerembryo durchgeführt. Sobald die Kultivierung von X-Ovo-Küken-Embryonen gemeistert ist, können sie in etwa fünf Minuten pro Embryo durchgeführt werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollte es ein gutes Verständnis dafür haben, wie man XO-Hühnerembryokulturen herstellt, die für bildgebende und mikrochirurgische Anwendungen geeignet sind, und wo der Transport von Kulturen erforderlich ist.