Name: Ein Ex-ovo Chicken Embryo Culture-System Geeignet für Imaging und Mikrochirurgie Anwendungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Lernen Sie ein ex-ovo-Kulturensystem für Hühnerembryonen zur Untersuchung der Embryogenese mit vollständiger optischer Zugänglichkeit. Diese Methode ermöglicht Mikroinjektion, Mikrochirurgie und bildgebende Verfahren.

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. 1 Ex-ovo Kultur-Protokoll: <ol><li> Inkubieren befruchtete Hühnereier <ol class="lroman"><li> Befruchtete Hühnereier können bei 13 ° C gelagert werden bis zu 5 Tage vor der Inkubation ohne Einleitung Entwicklung. Ein Rotwein Kühler kann diese Temperatur. </li><li> Inkubieren Eier stumpfe Seite nach oben in eine 60% ige konstante Luftfeuchtigkeit Inkubator mit kontinuierlichem Schütteln bei 37,5 ° C für 72 Stunden. </li></ol></li><li> Bereiten Hängematten (Abbildung 1a) <ol class="lroman"><li> Füllen ¾ 9 Unzen Plastikbecher mit warmem sterilem Wasser. Eine regelmäßige 9 Unzen Tasse hat einen oberen Durchmesser von 8 cm. Wir fanden, dass dieser Größe am besten geeignet für lange Kultur-Anwendung präsentiert hier war. </li><li> Cut ca. 20 cm Frischhaltefolie. Befestigen Sie den Umfang auf der Tasse, indem ein Gummiband herum. Plastic sollte auf der Wasseroberfläche verteilt werden. Schneiden Sie die überschüssige Kunststoff rund um die Band. Wir fanden Frischhaltefolie am geeignetsten für diese Anwendung, da sie die Haftung der Dotter verhindert, was in den Dotter Spaltung während des Transports. </li><li> Wischen Sie die Plastik mit Kimwipes (Kimberly-Clark, Inc.) mit 70% Ethanol benetzt. </li></ol></li><li> Entfernen Sie Eier aus Inkubator nach 72 Stunden Inkubationszeit. </li><li> Sterilisieren Eier durch Abwischen mit 70% Ethanol benetzt Kimwipes. </li><li> Legen Sie die Eier horizontal für 1-2 Minuten für die richtige Positionierung des Embryos (Abb. 1b). Ein Eierkarton kann Eier legen horizontal verwendet werden. Embryonen nach oben nach 1-2 Minuten zu drehen. </li><li> Transfer-Embryonen auf Hängematten aseptisch in einer Sterilbank. <ol class="lroman"><li> Mit einer scharfen Kante (wie die Kante eines Metall-Eimer oder ein Becherglas), tippen Sie auf das Ei vorsichtig, bis es eine kleine Delle an der Unterseite des Eies (Abbildung 1c). Denken Sie daran, den Embryo auf der Oberseite positioniert. </li><li> Legen Sie den Daumen in den gegenüberliegenden Seiten des dent und ziehen die Schalen horizontal auseinander (Abbildung 1d). </li><li> Legen Sie das Eigelb mit Embryo sowie Albumin auf die Hängematte (Abbildung 1e). Albumin wird einen dämpfenden Umgebung rund um das Eigelb geben, Schocks, indem Sie das System sowie die Ernährung bietet, den Embryo für lange Kultur Praktiken induzierte absorbieren. Wasser unter der Hängematte wird dafür sorgen, den Embryo wird parallel bleiben, um den Boden beim Transport und dienen als Wärmeleiter während der Bildgebung, wenn ein Wasserkreislauf Heizung verwendet wird. </li><li> Der Embryo ist bereits oben positioniert werden, wenn die Übertragung korrekt durchgeführt wird. Wenn nicht, verwenden Sie eine unscharfe, sterile Objekt (zB Blunt Spitze geschlossen gebogene Schere) und direktional streicheln das Eigelb, dass der Embryo nach oben dreht. </li><li> Legen Sie eine 10 cm Durchmesser Petrischale auf dem Becher, den Embryo zu versiegeln. </li></ol></li><li> Legen Tasse Kultur in den Inkubator gesetzt bei 37,5 ° C. Wenn ein tragbarer Inkubator verwendet wird, indem 1-2 9 Unzen Becher mit destilliertem Wasser gefüllt hält die Feuchtigkeit auf ~ 60% (Abbildung 1f). </li><li> Wenn Kultivierung Embryonen außerhalb embryonalen Tag 7 sollten zerdrückt Eierschale Stücke rund um die Peripherie des Embryos als Kalzium-Quelle für die Entwicklung der Knochen und die Reifung verstreut werden. </li></ol> Zusatzausrüstung für außerhalb Inkubator Imaging / Manipulation: Ein zirkulierendes Wasserbad wurde im Haus gebaut, um Inkubationstemperaturen zu halten, während Bildgebung oder Manipulation (Abbildung 3). Ein Wasserbad, dass die Tasse passen kann, ist über entsprechende Größe Schlauch an ein Wasser-Reservoir verbunden. A Widerstandsheizung erwärmt das Wasser in das Reservoir, das manuell, indem Sie die Wassertemperatur geregelt. Eine Wasserpumpe sorgt für die Wasserzirkulation. Bildliche Darstellung zeigt Bildgebung bequem über ultrasongraphy / florescent Mikroskopie (Abbildung 3). <img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Vorbereitung der Hängematte und die Übertragung von Hühnerembryonen zu Hängematten. <img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse -. Unterschiedlichen Stadium Hühnerembryonen via ex ovo Kultur Technik gewachsen Embryonen aus HH 17 seit über diese Technik angebaut werden. <img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Schematische und repräsentative Bilder der Wasserkreislauf in Verbindung mit dem ex-ovo Kultur System verwendet, um Embryonen zu idealen Entwicklung Temperatur zu halten. 2. Ausgewählte Anwendungen: I. Mikroinjektion Dieser Embryo Kultur ist geeignet für die Mikroinjektion Anwendungen, bei denen Lösungen müssen injiziert werden, um für den Kontrast für die Bildverarbeitung (zB Fluoreszenz-Mikroskopie, Mikro-Computertomographie etc.) (Abbildung 4) Gefäßsystem werden. Unten ist die Mikroinjektion Protokoll: <ol><li> Bereiten Sie die Injektion apparatus <ol class="lroman"><li> Fashion gezogen 0,75 ID Glaskapillaren in abgeschrägte Spitze Mikronadeln mit einem microforge. Größe der Spitze hängt von Ziel Venendurchmesser / Durchfluss gewünscht. </li><li> Verbinden Sie die Spritze auf 0,03 Zoll ID Silikonschlauch. </li><li> Legen Sie den Schlauch mit der Lösung injiziert werden und verbinden Sie die Mikronadel, um den Schlauch. </li><li> Legen Sie die Mikronadel auf den Mikromanipulator und Spritze zu Spritze Inhaber oder Spritzenpumpe. </li></ol></li><li> Add sterilem Wasser in die Tasse damit erhöhen den Embryo. Wir erfahren, dass für eine ordnungsgemäße Eindringen der Nadel in ein Blutgefäß (dh vitelline Schiff), horizontale Durchdringung notwendig ist. Dies erfordert den Embryo auf der gleichen Ebene wie die Ränder des Bechers sein. <ol class="lroman"><li> Nehmen Sie das Gummiband hält der Kunststoff unter der Embryo. </li><li> Heben Sie die eine Seite der Kunststoff leicht und fügen Sie einige sterilem Wasser in die Tasse. </li><li> Sichern Sie das Gummiband auf den Kunststoff wieder. </li></ol></li><li> Injizieren Sie die Lösung in einen embryonalen Gefäß. In unserer Erfahrung, wenn Lösung für ein vitelline Gefäß injiziert wird, Mikronadeln benötigt, um einer Größe von ungefähr 1 / 10 th der Gefäßdurchmesser, um eine effiziente Perfusion ohne Blutungen zu halten. <ol class="lroman"><li> Pump die Lösung für die Sicherstellung Mikronadel keine Bildung von Luftblasen. </li><li> Richten Sie die Spitze des Mikronadel auf das ausgewählte Schiff. Für vitelline Schiffe wird durch die Auswahl einer Gabel Bereich geben maximale Fläche für das Schiff eindringt. </li><li> Drücken Sie die Nadel in Richtung des Schiffes. Das Schiff wird zuerst eingezogen. Sobald die Nadel eindringt, beginnen Perfusion. Die Farbe des strömenden Blutes sollte mit Perfusion ändern. Wenn Farbwechsel nicht gesehen wird, kann die Nadel aus dem Schiff eingedrungen sind. In diesem Fall langsam einfahren Mikronadel gleichzeitig Pumpenlösung bis Farbwechsel in das Schiff zu sehen ist. Sobald die Durchblutung abgeschlossen ist, zurückziehen Mikronadel aus dem Behälter. </li></ol></li></ol><img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4: Mikroinjektion von einem fluoreszierenden Farbstoff in das Gefäßsystem eines Ex-ovo kultivierten Hühnerembryo. II. Mikrochirurgische Verfahren - linksatrialen Ligation Diese ex-ovo Kultur Setup ist ideal für die Durchführung von chirurgischen Anwendungen zum Hühnerembryonen, da sie volle Zugänglichkeit bietet, um den Embryo. Unten ist das Protokoll für ein Beispiel Technik, linksatrialen Ligation (LAL) (Abbildung 5). Das Verfahren ist etwa 24 Stunden in die Kultur Periode (HH24) durchgeführt: <ol><li> Bereiten overhand Knoten ~ 0,5 mm Durchmesser mit 10-0 Nylon chirurgisches Nahtmaterial. </li><li> Mit feinen Pinzetten, lokal entfernen Sie die Chorion-Allantois-und Membranen über den Embryo und heben den Embryo von der Rückseite zu drehen vertikal, so dass die linke Seite des Embryo sichtbar ist. </li><li> Mit feinen Pinzette entfernen Herzbeutel über den linken Vorhof. </li><li> Richten Sie den Knoten in den linken Vorhof und anziehen. Der Knoten sollte so gebunden werden, da ~ 75% des ursprünglichen Blutflusses auf die linke Seite zu verbieten. Schneiden Sie die Kanten des Knotens mit Mikroschere und vorsichtig entfernen und entsorgen Überschuss Naht. </li><li> Drehen Sie den Embryo wieder in seine ursprüngliche Orientierung (rechts oben). </li><li> Sham Kontrollen beinhalten das gleiche Verfahren, aber der Faden wird nur durchfahren werden, und nicht gebunden. Effektive LAL Behandlung (75% Einschnürung) wird nach 24 Stunden nach der Operation bestätigt werden, und disqualifiziert Embryonen ausgeschlossen wird. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2154/2154fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5:. A-Steuerung und einen linken Vorhof ligiert Hühnerembryo Pfeil zeigt die linken Vorhof, die etwa 75% kleiner in der ligierten Embryo ist.

<ol><li>Zamir, E. A., Czirok, A., Cui, C., Little, C. D., Rongish, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesodermal+cell+displacements+during+avian+gastrulation+are+due+to+both+individual+cell-autonomous+and+convective+tissue+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mesodermal cell displacements during avian gastrulation are due to both individual cell-autonomous and convective tissue movements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19806-19811 (1980).</li>
<li>Ehrman, L. A., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+regulation+in+the+heart+forming+region+of+avian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Lack of regulation in the heart forming region of avian embryos.</a> Dev Biol. 207, 163-175 (1999).</li>
<li>Clark, E. B., Hu, N., Rosenquist, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+conotruncal+constriction+on+aortic-mitral+valve+continuity+in+the+stage+18%2C+21+and+24+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Effect of conotruncal constriction on aortic-mitral valve continuity in the stage 18, 21 and 24 chick embryo.</a> Am J Cardiol. 53, 324-327 (1984).</li>
<li>deAlmeida, A., McQuinn, T., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+ventricular+preload+is+compensated+by+myocyte+proliferation+in+normal+and+hypoplastic+fetal+chick+left+ventricle%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Increased ventricular preload is compensated by myocyte proliferation in normal and hypoplastic fetal chick left ventricle.</a> Circ Res. 100, 1363-1370 (2007).</li>
<li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Methods. 24, 43-48 (2001).</li>
<li>Butcher, J. T., McQuinn, T. C., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+in+early+embryonic+atrioventricular+valvular+function+correspond+with+changes+in+cushion+biomechanics+that+are+predictable+by+tissue+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition.</a> Circ Res. 100, 1503-1511 (2007).</li>
<li>McQuinn, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+ultrasonographic+imaging+of+avian+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">High-frequency ultrasonographic imaging of avian cardiovascular development.</a> Dev. Dyn. 236, 3503-3513 (2007).</li>
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<li>Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+procedure+for+the+long-term+cultivation+of+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev Biol. 41, 391-394 (1974).</li>
</ol>

Optischer Zugang und Experimentieren in Vogelembryonen ist eine Herausforderung aufgrund von Einschränkungen der Eischale. Windowing deutlich begrenzt die Anzahl der Mikrogefäßen zugänglich für Injektionen und mikrochirurgische Ansätze 8. Als Ergebnis nur frühe Embryonen können manipuliert werden und eine kontinuierliche Beobachtung ist nicht möglich. Frühe ex-ovo Kulturen mit Petrischalen wurden von begrenztem Nutzen, weil unzureichender Kontrolle der Oberflächenspannung auf den Embryo verhindert la...

<table><tbody><tr><td>Fertile weiße Leghorn-Hühnereier</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modell GB1, Avery Incubators, Hugo CO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saran Wrap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gummibänder</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Warme sterile Wasser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>9-Unzen-Kunststoffbecher</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100-mm-Durchmesser-Petri-Schale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1602N Wärmelufteinheit</td><td>GQF Manufacturing</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-konjugiertes Dextran (2 MDa, 1 % m/V in phosphatgepufferter Salzlösung)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroforge</td><td>Glassworx, Inc, St. Louis MO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glas-Kapillarrohre (0,75 mm Innendurchmesser)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Modell M3301L</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskopie</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Z20</td><td></td></tr><tr><td>Feine 55-Pinzette</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10-0 Nylon-Chirurgiefaden</td><td>Ethicon Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schlauch</td><td>VWR international</td><td></td><td>1 mm Außendurchmesser</td></tr><tr><td>3-mL-Spritze</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L-Pipette und Pipettenspitzen</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ein ex-ovo chicken embryo culture-system geeignet für imaging und mikrochirurgie anwendungen

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Das Verständnis der Zusammenhänge zwischen genetischen und Mikroumgebung Faktoren, die normale und fehlerhafte embryonale Entwicklung Laufwerk ist von grundlegender Bedeutung für die Entdeckung neuer therapeutischer Strategien. Fortschritte in der Imaging-Technologie haben die quantitative Untersuchung der Organisation und Reifung des Körpers Plan aktiviert, aber später embryonalen Morphogenese ist weniger klar. Hühnerembryonen sind eine attraktive Wirbeltier-Modellsystem für diese Anwendung wegen seiner Leichtigkeit von Kultur und chirurgische Manipulation. Frühe Embryonen können für eine kurze Zeit auf Filterpapier Ringe, die komplette optische Zugang für die Zell-Strukturierung und Schicksal Studien 1,2 ermöglicht kultiviert werden. Studieren fortgeschrittenen Entwicklungsprozessen, wie Herz-Morphogenese sind traditionell durch ein Fenster der Eischale 3-5 durchgeführt, aber diese Technik Grenzen optischer Zugang durch Fenstergröße. Wir zuvor entwickelte eine einfache Methode zur Kultur ganzen Embryonen ex-ovo auf sechseckigen wiegen Boote für bis zu 10 Tage, die hochauflösende Bildgebung mittels Ultraschall 6,7 aktiviert. Diese Kulturen wurden schwer zu transportieren, wodurch die Arten von Imaging-Tools für Live-Experimente. Wir stellen hier eine verbesserte Shell-less Kultur mit einem kostengünstigen, tragbaren Klimakammer. Die Eier wurden auf einer Hängematte mit einem Polyurethan-Membran (Frischhaltefolie) ringförmig an einem Plastikbecher teilweise mit sterilem Wasser gefüllt angebracht erstellt geknackt. Die Abmessungen des Umfangs und der Tiefe der Hängematte waren beide entscheidend für die Oberflächenspannung zu halten, während die Mechanik der Hängematte und Wasser unter geholfen dämpfen Vibrationen, die durch den Transport induziert. Eine kleine Stellfläche zirkulierenden Wasserbad wurde auch entwickelt, um kontinuierliche Temperaturkontrolle während der Experimente zu ermöglichen. Wir zeigen die Fähigkeit, Kultur Embryonen auf diese Weise für mindestens 14 Tage ohne morphogenic Defekt oder Verzögerung und beschäftigen dieses System in mehreren mikrochirurgischen und Imaging-Anwendungen.

In diesem Artikel präsentieren wir Ihnen eine einfache Methode, um langfristig zu ermöglichen<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Vogelembryo Kultur. Diese Technik ist ideal für die Längs-Experimente erfordern komplette optische Zugänglichkeit und / oder sterilen Transport in Vogelembryonen.

Ein Ex-ovo Chicken Embryo Culture-System Geeignet für Imaging und Mikrochirurgie Anwendungen

Das Verständnis der Beziehungen zwischen genetischen und mikroumweltbedingten Faktoren, die eine normale sowie eine fehlgebildete embryonale Entwicklung steuern, ist grundlegend für ...

Im X-ovo-Hühnerembryokultursystem ermöglicht die Herstellung von Schalenplättchen-Hühnerembryokulturen die Untersuchung der Embryogenese. Das Verfahren beginnt mit dem Beschaffen und Inkubieren befruchteter Hühnereier bei 37,5 Grad Celsius für 72 Stunden. Hängematten zur Aufnahme der Eigelbe mit den wachsenden Embryonen werden vorbereitet.Anschließend können die Eigelbe auf Hängematten übertragen werden, und die Embryogenese setzt außerhalb der Schale fort. Diese Technik kann für Mikroinjektionen in das Gefäßsystem, Ultraschalluntersuchungen und Mikrochirurgie angewendet werden, und die Ergebnisse können zeigen, wie sich Embryonen unter normalen und gestörten Bedingungen entwickeln. Hallo, mein Name ist Akshay Shaker und ich bin Masterstudent im Labor für kardiovaskuläre entwicklungsbiotechnische Ingenieurwissenschaften, das von Jonathan Butcher am Fachbereich Biomedizinische Technik der Cornell University geleitet wird.Und der Hauptvorteil unserer Technik gegenüber früheren Methoden, wie der In-ovo-Eikultur, besteht darin, dass sie einen vollständigen optischen Zugang zum Embryo bietet sowie eine einfache, schadlose Transportierbarkeit ermöglicht. Hallo, mein Name ist Char Hin. Ich bin Postdoktorand am Labor für kardiovaskuläre entwicklungsbiotechnische Ingenieurwissenschaften, Jonathan Chu Lab, am Department für Biomedizinische Technik der Cornell University.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Entwicklungsbiologie zu beantworten, beispielsweise wie Herzfehler während der Embryogenese entstehen. Vor Beginn des Verfahrens alle Materialien durch Abwischen mit 70 %igem Ethanol sterilisieren. Um das Verfahren zu beginnen, einen neun Unzen fassenden Plastikbecher zu drei Vierteln mit warmem sterilen Wasser füllen.Wiederholen Sie dies für so viele Becher, wie erforderlich. Ein üblicher Becher mit einem Fassungsvermögen von neun Unzen hat einen oberen Durchmesser von acht Zentimetern, was die für die hier dargestellte Anwendung der verlängerten Kultur am besten geeignete Größe ist. Schneiden Sie anschließend ein 20 Zentimeter langes Stück Frischhaltefolie ab.Bedecken Sie die Oberseite des mit warmer steriler Wasser gefüllten 270-ml-Plastikbechers mit einer Schicht Frischhaltefolie und befestigen Sie die Folie mit einem Gummiband. Frischhaltefolie eignet sich am besten für diese Anwendung, da sie verhindert, dass das Eigelb anhaftet, was zu einer Aufspaltung des Eigelbs führen könnte. Während des Transports sollte die Folie so ausgebreitet werden, dass sie die Wasseroberfläche berührt.Schneiden Sie den überschüssigen Kunststoff um das Band herum ab und wischen Sie den Kunststoff ab. Mit Kim-Tüchern, die mit 70 % Ethanol angefeuchtet sind, sind die Hängematten nun bereit, die Embryonen zu tragen. Befruchtete Hühnereier können vor der Inkubation bis zu fünf Tage bei 13 Grad Celsius gelagert werden.Ohne die Entwicklung zu aktivieren, kann ein Rotweinkühler diese Temperatur beibehalten, um die Eier zur Kultivierung vorzubereiten. Aktivieren Sie die Entwicklung des Embryos, indem Sie die Eier 72 Stunden lang in einem Inkubator mit 60 % konstanter Luftfeuchtigkeit und kontinuierlichem Schaukeln bei 37,5 Grad Celsius eine Stufe höher inkubieren. Wenn die Eier bereit sind, nehmen Sie sie aus dem Inkubator heraus. Desinfizieren Sie die Eier, indem Sie sie mit mit 70 % Ethanol befeuchteten Kim-Tüchern abwischen. Legen Sie die Eier zur richtigen Positionierung des Embryos ein bis zwei Minuten lang horizontal auf die Seite in ein Eierkarton. Bearbeiten Sie jeweils höchstens sechs Eier gleichzeitig, da das gleichzeitige Aufschlagen von mehr als sechs Eiern schwierig ist.Kann dazu führen, dass die Embryonen zu lange bei Raumtemperatur verbleiben, was die Vitalität beeinträchtigen kann. Am Ende von einer bis zwei Minuten ist der Embryo an die Oberseite des Eies gerutscht. Um jeden Embryo in eine Schlinge zu überführen, arbeiten Sie aseptisch in einer laminaren Luftströmungshaube. Zuerst vorsichtig die Unterseite des Eies mit einer scharfen Kante, beispielsweise der eines Metalleimers oder eines Glasbechers, anritzen. Beachten Sie, dass sich das Embryo an der Oberseite befindet. Die beiden Hälften der Eierschale vorsichtig auseinanderziehen, indem man mit den beiden Daumen zur Seite zieht.Bringen Sie dann das Embryo, das Eigelb und das Albumin auf die Hängematte. Das Albumin schafft eine dämpfende Umgebung um das Eigelb herum, die Stöße absorbiert, die durch das Bewegen des Systems entstehen. Das Albumin versorgt das Embryo während der langen Kultivierungszeit zudem mit Nährstoffen.Wenn die Übertragung des Embryos ordnungsgemäß durchgeführt wird, sollte sich der Embryo bereits an der Oberseite befinden. Befindet sich der Embryo am Boden, verwenden Sie eine geschlossene, kleine Schere oder ein anderes ähnliches stumpfes Instrument, um das Eigelb so zu reiben, dass es sich um sich selbst dreht und der Embryo an die Oberseite gelangt. Wenn Embryos über den siebten embryonalen Tag hinaus kultiviert werden, streuen Sie zerkleinerte Eierschalenstücke um den Rand des Embryos herum, um als Kalziumquelle für die Knochenentwicklung und -reifung zu dienen.Nachdem die Übertragung des Embryos abgeschlossen ist, stellen Sie eine Petrischale mit einem Durchmesser von 10 Zentimetern auf die Tasse, um den Embryo abzudichten. Legen Sie die Hängematte in den auf 37,5 Grad Celsius eingestellten Inkubator. Wenn ein tragbarer Inkubator verwendet wird, stellen Sie zusätzlich ein bis zwei neun-Unzen-Becher, die mit Wasser gefüllt sind, in den Inkubator.Um die Luftfeuchtigkeit bei etwa 60 % zu halten, entwickeln sich die Embryonen weiter und können für Mikroinjektionen in mikrochirurgischen Anwendungen verwendet werden. Diese Embryokultur eignet sich für Mikroinjektionsanwendungen, bei denen Lösungen in das Gefäßsystem injiziert werden müssen. Bereiten Sie zunächst die Injektionsapparatur vor, beginnend mit den Nadeln, indem Sie mit einer Mikroschleuder gezogene Glas-Kapillarrohre zu mikroskopischen Nadeln mit abgeschrägter Spitze formen.Die Größe der Spitze hängt von der gewünschten Durchflussrate ab. Verbinden Sie die Mikronadel-Spritze mit Silikon-Schlauch mit einem Innendurchmesser von 0,03 Zoll. Füllen Sie den Spritzen-Schlauch mit der zu injizierenden Lösung und verbinden Sie die Mikronadel-Spritze mit dem Schlauch.Platzieren Sie die Mikronadel auf dem Mikromanipulator und der Spritze im Spritzenhalter oder an der Spritzenpumpe. Sobald die Injektionsvorrichtung bereit ist, holen Sie die Embryonen ab. Für einen korrekten Einstich der Nadel in ein Blutgefäß, beispielsweise ein lebenswichtiges Gefäß, ist ein horizontaler Nadeleindringwinkel erforderlich.Der Embryo muss sich daher auf derselben Höhe wie die Ränder der Halterung befinden, in der er liegt. Um den Embryo anzuheben, entfernen Sie das Gummiband, das die Plastikfolie hält, auf der der Embryo liegt. Heben Sie vorsichtig eine Seite der Plastikfolie an und fügen Sie etwas Wasser in die Halterung ein, ohne den Embryo allzu sehr zu bewegen.Dann legen Sie das Gummiband erneut auf den Kunststoff. Da der Embryo nun angehoben ist, kann die Lösung in ein embryonales Gefäß injiziert werden. Beachten Sie, dass bei der Injektion in ein lebenswichtiges Gefäß der Durchmesser der Mikronadel etwa ein Zehntel des Gefäßdurchmessers betragen sollte.Um eine effiziente Perfusion aufrechtzuerhalten, ohne Blutungen zu verursachen, pumpen Sie zuerst die Lösung in die Mikronadel, sodass sich keine Luft darin einschließt. Danach richten Sie die Spitze der Mikronadel mit einem ausgewählten Gefäß für lebenswichtige Gefäße aus. Die Auswahl eines Bereichs bietet die maximale Fläche zur gezielten Ansteuerung des Gefäßes.Sobald der Injektionsbereich definiert ist, schieben Sie die Nadel in Richtung des Gefäßes. Das Gefäß zieht sich zunächst zurück. Sobald die Nadel eindringt und die Perfusion beginnt, verändert sich die Farbe des fließenden Blutes mit der Perfusion.Wenn keine Farbänderung zu sehen ist, könnte die Nadel durch das Gefäß gestoßen sein. In diesem Fall die Mikronadel langsam zurückziehen, während gleichzeitig Lösung injiziert wird, bis eine Farbänderung im Gefäß sichtbar ist. Sobald die Perfusion abgeschlossen ist, die Mikronadel vorsichtig aus dem Gefäß ziehen. Diese Embryokultur eignet sich ebenfalls für mikrochirurgische Anwendungen wie die Ligatur des linken Atriums, die am vierten Inkubationstag durchgeführt wird.Bereiten Sie zunächst die Knoten vor, die aus 10-0-Nylonschirrutfaden mit einem Durchmesser von 0,5 Millimetern hergestellt werden. Entfernen Sie mithilfe feiner Pinzetten die chorionischen und LAN-toischen Membranen vom Embryo. Heben Sie den Embryo von der Rückseite an und drehen Sie ihn vertikal, sodass die linke Seite des Embryos nun oben liegt und zugänglich ist.Anschließend wird das Perikard über dem linken Vorhof entfernt. Der Knoten wird über dem linken Vorhof ausgerichtet und durch Halten und Ziehen an den Seiten mit einer Pinzette festgezogen. Der Knoten sollte so gesetzt werden, dass etwa 75 % des ursprünglichen Blutflusses zur linken Seite unterbunden werden. Die Enden des Knotens werden mit einer Mikroschere abgeschnitten und überschüssige Naht vorsichtig entfernt und entsorgt.Schließlich drehen Sie das Embryo in seine ursprüngliche Orientierung zurück, sodass die rechte Seite oben liegt. Hier sind Embryonen in verschiedenen Stadien gezeigt, die wie gerade demonstriert *in ovo* kultiviert wurden; ein Wasserumwälzheizer kann die Umgebungsbedingungen über längere Zeiträume aufrechterhalten, was möglicherweise erforderlich ist, während der Bildgebung und mikrochirurgischen Anwendungen.Die in X ovo kultivierten Hühnerembryonen eignen sich für die Mikroinjektion. In diesem Experiment wurde ein fluoreszierender Farbstoff in das Gefäßsystem eines in X ovo kultivierten Hühnerembryos injiziert. Die in X ovo kultivierten Hühnerembryonen eignen sich für mikrochirurgische Eingriffe.In diesem Experiment wurde an einem in ovo kultivierten Hühnerembryo ein Verschluss des linken Atriums durchgeführt. Sobald die Technik beherrscht ist, kann die in-ovo-Kultivierung von Hühnerembryonen innerhalb von etwa fünf Minuten pro Embryo durchgeführt werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollte man gut verstehen, wie man Hühnerembryokulturen herstellt, die für bildgebende Verfahren und mikrochirurgische Anwendungen geeignet sind und bei denen ein Transport der Kulturen erforderlich ist.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt neue Kultur, eine Methode, durch die Hühnerembryonen außerhalb der Eizelle bis zu 24 h kultiviert. Diese Methode ermöglicht ein bis frühen Entwicklung (Primitivstreifens bis 14 som.), Ein Zeitraum entsprechend E7-9 in der Maus zu studieren. Anwendungen dieser Technik sind die Elektroporation, in situ Hybridisierung und Immunhistochemie.

Method for Culture of Early Hühnerembryonen ex vivo (New Culture)

Das Küken Chorioallantoismembran (CAM) ist eine einzigartige, natürlich immundefizienten unterstützende Kultur Umwelt, die Angiogenese und Tumorentstehung zu untersuchen. Dieses Video Artikel zeigt die verschiedenen Schritte in...

Küken Ex ovo Kultur und Ex ovo CAM-Assay: Wie es wirklich funktioniert

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist zu zeigen, wie die gezielte Injektion Netzhaut führen...

In ovo Elektroporation in embryonalen Hühnchenretina

Scheibe Kulturen ermöglichen die Manipulation der Embryonalentwicklung durch Gen-und pharmakologische Störungen. Allerdings müssen Kulturbedingungen sicherzustellen, dass eine normale Entwicklung innerhalb der reduzierten Umfeld der Scheibe gehen. Wir stellen ein Protokoll, das normale Entwicklung Rückenmarks erleichtert, um für wenigstens 24 Stunden fort.

Hühnerembryo Spinal Cord Scheibe Kultur Protocol

Den Hühnerembryo während der Entwicklung zu betrachten und darauf zuzugreifen, kann eine Herausforderung sein. Wir haben eine Ex-Ovo-Methode entwickelt, die einfach und kostengünstig ist und problemlos in einem Klassenzimmer oder in der Forschung eingesetzt werden kann. Diese Methode ermöglicht den Zugang zum Embryo bis in die späten Stadien der Embryonalentwicklung (HH 40).

Optimierte Ex-ovo Züchtung von Hühnerembryonen zu fortgeschrittenen Entwicklungsstadium

Hier stellen wir eine neue Technik vor, um Hühnerembryonen ex ovo für die Zeitrafferbildgebung mittels Durchlicht- und Fluoreszenzmikroskopie zu kultivieren. Das getauchte Filterpapiersandwich ist eine Variante der etablierten Filterpapierträgertechnik1, die die Kultivierung von Hühnerembryonen ermöglicht, die vollständig in ein flüssiges Kulturmedium getaucht sind.

Ein Abgetaucht Filterpapier Sandwich für Langzeit Ex Ovo Zeitraffer-Imaging von frühen Hühnerembryonen

Dieses Protokoll beschreibt drei Methoden zur Gewinnung und Verwendung von 5 bis 8 Tage alten Hühnerembryonen und ihrer Chorioallanto-Membran (CAM) als In-vivo-Modell zur Untersuchung der kontrastverstärkten Ultraschallbildgebung und der Mikroblasen-vermittelten Wirkstoffabgabe.

Die Herstellung von Hühner-Ex-Ovo-Embryonen und chorioallantoischen Membrangefäßen als In-vivo-Modell für kontrastmittelverstärkte Ultraschallbildgebung und Mikroblasen-vermittelte Arzneimittelabgabestudien

Das übergeordnete Ziel dieses Papiers ist es, zu beschreiben, wie bei der intrazellulären Injektion von exogenen Materialien in Hühnerembryonen durchgeführt werden kann. Dieser Ansatz ist sehr nützlich, um die Entwicklungsbiologie von Hühnerembryonen zu untersuchen.

In Ovo Intravaskuläre Injektion in Hühnerembryonen

Das Küken ist ein kostengünstiger, zugänglicher und weit verbreiteter Modellorganismus für eine Vielzahl von Studien. Hier wird eine Reihe von Protokollen detailliert beschrieben, um die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der Entwicklung und Regeneration des Vogelinnenohrs zugrunde liegen.

In Ovo und Ex Ovo Methoden zur Untersuchung der Entwicklung des Vogelinnenohrs

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die mechanischen Eigenschaften des Neuralplattengewebes während der Neurulation des Hühnerembryos im Längsschnitt zu überwachen. Es basiert auf der Integration eines Brillouin-Mikroskops und eines Inkubationssystems auf der Bühne und ermöglicht die mechanische Live-Bildgebung von Neuralplattengewebe in Ex-Ovo-kultivierten Kükenembryonen.

Überwachung der mechanischen Entwicklung von Gewebe während des Neuralrohrverschlusses des Kükenembryos

Lernen Sie ein ex-ovo-Kulturensystem für Hühnerembryonen zur Untersuchung der Embryogenese mit vollständiger optischer Zugänglichkeit. Diese Methode ermöglicht Mikroinjektion, Mikrochirurgie und bildgebende Verfahren.

Ein Ex-ovo Chicken Embryo Culture-System Geeignet für Imaging und Mikrochirurgie Anwendungen

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