Assaying Bewegungsaktivität zu zirkadianen Rhythmen Study and Sleep Parameter in Drosophila

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, circadiane und Schlafphänotypen bei Drosophila durch die Untersuchung täglicher Rhythmen der motorischen Aktivität zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem transgene Fliegen erzeugt, spezifische Mutanten erhalten oder notwendige Kreuzungen durchgeführt werden, um die Versuchstiere vorzubereiten. Als zweiter Schritt müssen Glasaktivitätsröhren, die eine Nahrungsquelle enthalten, hergestellt werden, die während des Experiments als Lebensraum für die Fliegen dienen.

Anschließend werden ein bis fünf Tage alte Fliegen in Aktivitätsröhren gegeben, die in DAM-Aktivitätsmonitoren eingelegt werden, um die Rhythmen der motorischen Aktivität zu überwachen. Mithilfe des DAM-Systems erhält man Ergebnisse, die Defekte und Variationen in zirkadianen und Schlafparametern aufzeigen, basierend auf der Analyse der täglichen motorischen Aktivitätsrhythmen mit Software wie far sex und insomniac. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der zirkadianen Biologie zu beantworten, beispielsweise welche Proteine und regulatorischen Mechanismen an der Erzeugung korrekter Rhythmen beteiligt sind, und wie Umweltfaktoren wie Licht und Temperatur über spezifische molekulare Signalwege das Verhalten beeinflussen.

Das Überwachungssystem für die motorische Aktivität umfasst zahlreiche Geräte wie spezielle Überwachungseinheiten, Umweltinkubatoren mit der Fähigkeit zur kontrollierten Tageslichtregelung, Datensammeleinheiten, Computer und periphere Materialien wie Verkabelung. Wählen Sie einen gut belüfteten, temperaturgeregelten, dunklen Raum zur Unterbringung des Überwachungssystems für die motorische Aktivität, um eine übermäßige Belastung der Inkubatoren zu vermeiden und ein mögliches Versagen bei der Aufrechterhaltung der Temperatur zu verhindern. Dichten Sie den Raum gegenüber äußeren Lichtquellen ab, innerhalb des dunklen Raums. Es ist nicht erforderlich, vollständig im Dunkeln zu arbeiten, da das circadiane System der Taufliegen nicht empfindlich gegenüber Infrarotlicht ist.

Daher verwenden wir in Fällen, in denen wir im Dunkelraum sehen müssen, einfach eine handelsübliche Taschenlampe, die mit einem roten Filter abgedeckt ist, sowie eine unterbrechungsfreie Stromversorgung (Notstromaggregat), die über ausreichende Wattkapazität verfügt, um die Komponenten des Aktivitätsüberwachungssystems zu versorgen. Im Falle eines Spannungsanstiegs oder eines Stromausfalls im Gebäude schließen Sie das USV-Notstromaggregat an den Notstromkreis des Gebäudes an, falls verfügbar. Wenn das System, das die Beleuchtung im Inkubator steuert, nicht direkt durch den Inkubator geregelt wird, genügt es, den Inkubator ohne USV an die Notstromversorgung anzuschließen, da ein Stromausfall von wenigen Sekunden die Kammertemperatur nicht beeinträchtigt.

Als Nächstes richten Sie einen Computer, PC oder Macintosh ein, der ausschließlich der Datensammlung und/oder der Steuerung der Inkubatoren dient. Ordnen Sie das Telefonleitungsnetzwerk manuell ordentlich um die Regale der klimakontrollierten Inkubatoren an, um das Anschließen und Trennen der Aktivitätsmonitore zu erleichtern. Richten Sie mehrere Telefonleitungen so ein, dass sie sich zu einer zentralen Leitung vereinigen und aus dem Inkubator herausgeführt werden, um mit dem Computer verbunden zu werden. Schließen Sie die Überwachungsgeräte innerhalb der Inkubatoren über eine Stromversorgungsschnittstelle an den Computer an, die dazu dient, den Aktivitätsmonitor über die Telefonleitung mit Strom zu versorgen.

Schließlich sollten mögliche Lichtquellen von LEDs elektronischer Geräte oder einer nicht richtig abgedichteten Inkubatortür mit Klebeband oder schwarzen Tüchern abgedeckt werden, um sicherzustellen, dass freilaufende Rhythmen ohne unerwünschtes Licht gemessen werden. Es ist entscheidend, diese Phänotypen unter Verwendung geeigneter Kontrolltiere zu bewerten, die unter denselben Umweltbedingungen aufgezogen und gleich alt sind.

Außerdem gibt es einen geschlechtsspezifischen Dimorphismus in der circadianen Rhythmik. Üblicherweise verwendet man erwachsene männliche Fliegen für diese Assays, die bei 25 Grad Celsius gezüchtet und ein bis fünf Tage alt sind, da die Eiablageaktivität weiblicher Fliegen die genaue Messung der motorischen Aktivität beeinträchtigen würde. Bei der Untersuchung circadianer und Schlaf-Ruhe-Parameter spezifischer mutanter Fliegen ist es ratsam, den Mutantenstamm mit dem Wildtyp-Stamm desselben genetischen Hintergrunds zu kreuzen.

Beispielsweise W 1118 oder yw. Da es bei männlichen Drosophila zu keinem Crossing-over kommt, ist es besser, die Outcrossing-Kreuzung durchzuführen, indem mutierte Weibchen mit Wildtyp-Männchen gekreuzt werden, wobei sowohl die Wildtyp-Kontrolle als auch die Mutantenfliegen gleichzeitig angelegt werden. Auf standardisiertem Drosophila-Nährmedium für etwa 10 bis 14 Tage vor dem Experiment zum Rhythmus der motorischen Aktivität; nach der Eclosion der Nachkommen sammeln Sie männliche Fliegen im Alter von ein bis fünf Tagen und stellen sie beiseite, um sie für die Experimente zu verwenden.

Aktivitätsröhren stellen den Lebensraum der Fliegen dar. Während des Experiments handelt es sich um dünne Glasröhren mit einem Durchmesser von fünf Millimetern, die an einem Ende mit Nahrungsmittel gefüllt und am anderen Ende mit einem Wattebausch oder einem Kunststoffstopfen verschlossen sind. Es ist ratsam, frisch hergestellte Aktivitätsröhren zu verwenden.

Sie werden im Allgemeinen einige Tage bis eine Woche vor Beginn des Experiments vorbereitet. Da Glasaktivitätsröhrchen mehrfach wiederverwendet werden können, beschreiben die folgenden Vorbereitungsschritte die Verwendung zuvor genutzter und nicht gereinigter Aktivitätsröhrchen als Ausgangspunkt. Wenn Sie neue Aktivitätsröhrchen verwenden, fahren Sie einfach mit der Autoklavierung der Röhrchen fort, wie später gezeigt.

Entfernen Sie die Stopfen aus benutzten Aktivitätsröhrchen und geben Sie diese in einen großen Glasbecher. Die Röhrchen sollten den Becher nur bis zur Hälfte füllen. Füllen Sie den Becher mit Leitungswasser, wobei sichergestellt werden muss, dass die Röhrchen vollständig untergetaucht sind.

Erhitzen Sie den mit Reagenzgläsern gefüllten Becher in der Mikrowelle, bis das Wasser stark und schnell kocht. Achten Sie darauf, dass das Wasser heiß ist, wenn Sie das Wachs und die Agarnahrung schmelzen. Nehmen Sie den Becher aus der Mikrowelle und rühren Sie die Gläser mit einem Spatel oder einem Kunststoffwerkzeug um.

10-mm-Pipette verwenden, damit das eingeschlossene Wachs an die Oberfläche steigen kann. Anschließend den Mikrowellenschritt wiederholen. Den Becher aus der Mikrowelle nehmen und abkühlen lassen.

Das Becherglas in den Kühlraum zu stellen, beschleunigt den Prozess. Während das Wasser abkühlt, sammelt sich das Wachs an der Wasseroberfläche und erstarrt allmählich. Entfernen Sie das erstarrte Wachs von Hand.

Dadurch sollte der größte Teil des Wachses von den Röhrchen entfernt werden. Überführen Sie die Aktivitätsröhrchen in ein neues Becherglas mit frischem Leitungswasser und wiederholen Sie den Vorgang des Mikrowellenerhitzens und Wachsentfernens. Da der größte Teil des Wachses bereits im vorherigen Schritt entfernt wurde, ist es nicht notwendig, auf das Erstarren des Wachses zu warten.

Geben Sie das Wasser einfach aus dem Becher aus und überführen Sie die Röhrchen in einen neuen Becher. Seien Sie vorsichtig, da das Wasser noch heiß ist. Wiederholen Sie den Mikrowellenprozess zum letzten Mal.

Gießen Sie das Wasser aus dem Becher und warten Sie, bis die Aktivitätsröhrchen abgekühlt sind. Stellen Sie danach die Aktivitätsröhrchen senkrecht in 250-Milliliter- oder 500-Milliliter-Glaskolben. Achten Sie darauf, dass sie nicht zu dicht gepackt sind.

Sterilisieren Sie sie, indem Sie einen Autoklaven mit Trockenzyklus verwenden, oder trocknen Sie die Röhrchen einfach in einem Trockenschrank, um die Nahrung für die Aktivitätsröhrchen vorzubereiten. Stellen Sie eine Lösung aus 5% Saccharose und 2% Bacto-Agar in destilliertem oder Leitungswasser her und autoklavieren Sie die Lösung. Das autoklavierte Futter kann sofort verwendet oder über einen längeren Zeitraum bei vier Grad Celsius gelagert werden.

Das Futter sollte idealerweise etwa 65 Grad Celsius warm sein, wenn die Aktivitätsröhren befüllt werden. Mit einer 10-Milliliter-Pipette die flüssige Nährlösung entlang der Innenwand des Glasbechers pipettieren und die Röhren von unten her bis zu einem Drittel füllen. Den Becher vorsichtig schwenken, um sicherzustellen, dass alle Röhren gleichmäßig mit der Nährlösung gefüllt sind.

Warten Sie, bis das Futter vollständig entweder bei Raumtemperatur oder vier Grad Celsius erstarrt ist. Sobald die Kondensation innerhalb der Glasröhrchen verschwindet, können die Röhrchen aus dem Becher entfernt werden. Um die Aktivitätsröhrchen aus dem Becher zu nehmen, drücken Sie die Röhrchen gleichzeitig nach unten und drehen sie, sodass sich das erstarrte Futter innerhalb der Röhrchen und der Boden des Bechers voneinander lösen.

Nehmen Sie die Röhrchen aus dem Becher, vorzugsweise als eine einzige Gruppe. Reinigen Sie anschließend die Röhrchen einzeln mit Papiertüchern, um überschüssige Nahrung von der Außenfläche der Röhrchen zu entfernen. Stellen Sie die Röhrchen zur Seite in einen sauberen Behälter.

Nehmen Sie einen allgemeinen Laborblockheizer ohne Probengefäßhalter und decken Sie die Heizmulde sorgfältig ab. Fügen Sie mit mehreren Schichten robustem Aluminiumfolie Paraffinperlen in die mit Aluminium ausgekleidete Heizmulde hinzu, um sie schmelzen zu lassen. Halten Sie die Röhrchen am nicht mit Lebensmittel in Berührung gekommenen Ende fest und tauchen Sie das Lebensmittel-Ende in das geschmolzene Wachs. Tauchen Sie den Wachsüberzug in einen Glasbecher mit kaltem Wasser, um die Erstarrung des Wachses zu beschleunigen. Wiederholen Sie diesen Vorgang.

Wenn man die Wachsröhrchen einmal in Wasser eintaucht, verhindert dies, dass sie zusammenkleben. Die Röhrchen können sofort verwendet oder zur späteren Verwendung in einem luftdichten Behälter bei vier Grad Celsius aufbewahrt werden. Eine längere Lagerung über eine Woche hinaus führt zu einer übermäßigen Austrocknung des Futters.

Wenn die Röhrchen bei vier Grad Celsius gelagert werden, bringen Sie sie vor der Verwendung durch Aufbewahrung auf der Laborbank auf Raumtemperatur. Schalten Sie vor dem Befüllen der Aktivitätsröhrchen mit Fliegen die Inkubatoren ein, in denen die Aktivitätsmonitore untergebracht werden. Stellen Sie die Temperatur mithilfe der Inkubator-Regelung ein und programmieren Sie das Hell-Dunkel-Regime entweder über den Lichtregler des DAM-Systems oder das eigene Beleuchtungssystem des Inkubators gemäß dem gewünschten experimentellen Design.

Als Nächstes betäuben Sie die Fliegen mit Kohlendioxid. Übertragen Sie dann mit einem feinen Pinsel vorsichtig eine einzelne Fliege in ein Aktivitätsröhrchen. Greifen Sie die Mitte eines einzelnen Fadens, der etwa einen halben Zoll lang ist, mit feinen Pinzetten und stecken Sie den Faden in das Ende des Aktivitätsröhrchens ohne Nahrung, um die Öffnung zu verschließen und zu verhindern, dass die Fliege während des Experiments entkommt.

Während gleichzeitig Luftzirkulation in das Röhrchen ermöglicht wird, sollte das Röhrchen seitlich liegend belassen werden, bis die Fliege erwacht. Um zu verhindern, dass die Fliege am Nährboden hängen bleibt, werden die Röhrchen in die Aktivitätsmonitore eingesetzt. Bei neueren, kompakteren Modellen der Tri Kinetics-Monitore ist es notwendig, die Röhrchen mit Gummibändern zu fixieren, um sicherzustellen, dass der Infrarotstrahl das Röhrchen in zentraler Position durchquert. Abschließend werden die Aktivitätsmonitore in die Inkubatoren gestellt und über Telefonkabel an das Datensammlungssystem angeschlossen.

Überprüfen Sie mit der DAM-System-Sammlungssoftware, dass alle Monitore ordnungsgemäß angeschlossen sind und Daten von jedem einzelnen erfasst werden. Da die Fliegen nun in die Aktivitätsröhren eingebracht wurden und das Bewegungsaktivitätsüberwachungssystem bereit ist, können die Daten nun aufgezeichnet werden. Die Fliegen werden synchronisiert und angepasst, indem sie zwei bis fünf volle Tage lang dem gewünschten Hell-Dunkel- oder LD-Zyklus sowie Temperaturregime ausgesetzt werden.

Die am häufigsten verwendete Eingliederungsbedingung ist ein Hell-Dunkel-Wechsel von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit bei 25 Grad Celsius. Für die Untersuchung zirkadianer Rhythmen in Bezug auf dieses Protokoll wird der Zeitpunkt, zu dem das Licht im Inkubator eingeschaltet wird, als Zeke-GABA-Zeit null definiert, und alle anderen Zeiten beziehen sich auf diesen Wert. Unter standardmäßigen 12:12-LD-Bedingungen zeigen typischerweise getypte Roso-Melano-Gasta in der Regel zwei Aktivitätsphasen, eine um ZT null, die als Morgenhöhe bezeichnet wird, und eine weitere um ZT 12, die als Abendhöhe bezeichnet wird. Freilaufende motorische Aktivitätsrhythmen werden unter konstanten Dunkelheits- und Temperaturbedingungen gemessen, nachdem die Eingliederungsphase abgeschlossen ist.

Die Einstellung für den Lichtzyklus kann jederzeit in der Dunkelphase am letzten Tag von LD geändert werden, sodass der folgende Tag des Experiments den ersten Tag von DD darstellt. Eine Datenerfassung über sieben Tage im DD-Modus ist ausreichend, um die circadiane Periode sowie die Amplitude oder Stärke des Rhythmus der Fliegen zu berechnen. Im Allgemeinen ist eine Stichprobengröße von mindestens 16 Fliegen erforderlich, um zuverlässige freilaufende Perioden für ein bestimmtes Genotyp zu erhalten.

Am Ende des Experiments werden die mithilfe der DAM-Systemsoftware erfassten Rohbilddaten auf ein tragbares Datenspeichergerät heruntergeladen, beispielsweise einen USB-Stick. Die Rohbilddaten werden mit DAM File Scan 1 0 2 x verarbeitet und bei der Analyse zirkadianer Parameter in 15- und 30-Minuten-Intervalle zusammengefasst oder in Ein- bis Fünf-Minuten-Intervalle, wenn der Schlaf analysiert wird.

Restparameter. Derzeit ist eine ununterbrochene Inaktivitätsphase von fünf Minuten die Standarddefinition für Schlafruhe bei Drosophila. Nach Abschluss dieses Protokolls kann man denselben Datensatz verwenden, um die zirkadianen und Schlafparameter der experimentellen und Kontrolltiere hinsichtlich der zirkadianen Parameter zu vergleichen.

Aktivitätsdiagramme, die die täglichen Bewegungsaktivitäten oder durchschnittlichen Aktivitäten von Fliegen über mehrere Tage unter LD- oder DD-Bedingungen veranschaulichen, können mithilfe von Fast X erstellt werden. Drosophila melanogaster zeigen im Allgemeinen zwei Aktivitätsphasen, eine um ZT 0, die als Morgenmaximum bezeichnet wird, und eine weitere um ZT 12, die als Abendmaximum bezeichnet wird. Diese beiden Aktivitätsphasen werden durch die endogene Uhr gesteuert und sind auch unter freilaufenden DD-Bedingungen beobachtbar. Änderungen im Zeitpunkt dieser Aktivitätsmaxima können leicht in Aktivitätsdiagrammen erkannt werden und deuten möglicherweise auf eine Veränderung der Eigenschaften der endogenen Uhr hin.

Eine weitere Eigenschaft, die auf eine korrekte Uhrfunktion hinweist, ist der vorhersagende Anstieg der motorischen Aktivität, der in Hell-Dunkel-Zyklen beobachtet wird und vor den eigentlichen Übergängen von Dunkelheit zu Licht oder von Licht zu Dunkelheit auftritt. Dieses Verhalten ist bei Wildtyp-Fliegen deutlich erkennbar, fehlt jedoch bei arrhythmischen per-zero-Mutanten. Bei diesem Mutanten.

Die beobachteten morgendlichen und abendlichen Aktivitätsspitzen bei LD sind rein Schreckreaktionen auf plötzliche Änderungen der Hell-Dunkel-Bedingungen. Die uhrenlosen Fliegen antizipieren Umweltveränderungen nicht, sondern reagieren lediglich darauf. Der Verlust der Verhaltensrhythmik ist im DD viel stärker ausgeprägt und manifestiert sich im Allgemeinen in einem vollständigen Verlust der morgendlichen oder abendlichen Aktivitätsspitzen der Lokomotorik, wie man sie bei per-null-Fliegen beobachtet.

Neben Induktionsgraphen können Daten zur motorischen Aktivität auch als Doppel-Aktogramm für jede einzelne Fliege oder Fliegen-Genotyp dargestellt werden, wobei zwei Tage Daten pro Zeile nacheinander aufgetragen werden, der Profilverlauf des letzten Tages jedoch die nächste Zeile mit zwei Tagen Aktivitätsdaten beginnt. Zum Beispiel werden LD eins und zwei in der ersten Zeile des ACTO-Gramms aufgetragen. Die nächste Zeile beginnt mit einer Wiederholung von LD zwei, gefolgt von LD drei und so weiter.

In diesem Format wird die Daten zum Bewegungsverhalten, die den gesamten Versuch umfassen, im ACTO-Gramm veranschaulicht. Ein Vorteil von ACTO-Grammen gegenüber Reduktionsgraphen besteht darin, dass eine Änderung der Periodenlänge der täglichen Aktivität leicht beobachtbar ist. Rhythmen sind neben der Erstellung von Induktionsgraphen und ACTO-Grammen gut erkennbar.

Daten zur motorischen Aktivität aus der DD-Bedingung können an weit X gesendet werden, um die Periodenlänge mithilfe verschiedener Programme zu berechnen, darunter cycle P zur Analyse von Schlaf- und Ruheparametern, wobei Ruhe als fünf aufeinanderfolgende Minuten Inaktivität definiert ist. Man kann Daten, die aus den Assays zur motorischen Aktivität aufgezeichnet wurden, analysieren und mehrere Schlafparameter mithilfe von insomniac, einem auf MATLAB basierenden Programm, untersuchen; der Prozentsatz der Zeit, die Fliegen mit Schlaf verbringen, kann in unterschiedlichen Zeitintervallen berechnet werden. Beispielsweise der Schlafprozentsatz pro Stunde oder alle 12 Stunden.

Weitere häufig untersuchte Schlafparameter sind beispielsweise die mittlere Dauer der Ruhephasen, ein Maß dafür, wie konsolidiert der Schlaf ist und das die Schlafqualität veranschaulichen kann. Ein weiterer Parameter ist die Aktivitätsanzahl während des Wachzustands, die die Aktivitätsrate der Fliegen im wachen Zustand widerspiegelt. Dieser Parameter hilft dabei, Fliegen, die tatsächlich im Schlaf- oder Ruheverhalten beeinträchtigt sind, von solchen zu unterscheiden, die krank oder hyperaktiv sind.

Zum Beispiel scheinen kranke Fliegen möglicherweise mehr zu schlafen, da sie weniger beweglich sind. Bei diesen Fliegen ist ihre Wachaktivität im Vergleich zu Kontrolltieren geringer. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man circadiane und Schlafphänotypen in Drosophila mittels Assay charakterisiert. Tägliche Rhythmen der motorischen Aktivität.