Name: Isolierung von Valvular Endothelzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung von Herzklappen-Endothelzellen aus Aortenklappen mit Kollagenase und Wattestäbchen. Diese Methode ermöglicht seiten-spezifische Zellgewinnung für kardiovaskuläre Forschung.

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Diese Forschung wird durch die NSF CAREER-Preis, der Hartwell-Stiftung und der American Heart Association (# 0830384N) unterstützt.

1. Vorbereitung <ol><li> Autoclave in einem überdachten Sterilisierkassettensystem die folgenden Punkte: <ol><li> Serrated Gewebe Zange - Für den Umgang mit der Broschüre Gewebe </li><li> Tissue Schere (8 cm) - Zum Beschneiden Merkblatt Gewebe und Höcker </li><li> Wattestäbchen - Zur Isolierung der Endothelschicht aus der Broschüre oder Höcker </li></ol></li><li> Machen Sie sterile Kollagenase-Lösung <ol><li> Add 4,0 g pulverisierte DMEM auf 250 mL von 18 MOhm Wasser. </li><li> Add 1,11 Gramm Natriumbicarbonat. </li><li> Add (600 U / mL) 180.000 Einheiten Kollagenase. </li><li> Add 1% (3 ml) Penicillin / Streptomycin. </li><li> Den pH-Wert der Lösung auf 7,2. </li><li> Bringen Sie die Lösung bis zu 270 mL. </li><li> Sterilisieren Sie die Lösung, indem sie durch einen 0,2 um Filter. </li><li> Fügen Sie 10% (30 ml) steriler Rinderfötenserum. </li></ol></li><li> Machen Sie sterile Endothelzellen Medium <ol><li> Add 6,7 Gramm Pulver DMEM auf 400 mL von 18 MOhm Wasser. </li><li> Add 1,85 Gramm Natriumbicarbonat. </li><li> Add (50 U / mL) 25.000 Einheiten Heparin. </li><li> Add 1% (5 ml) Penicillin / Streptomycin. </li><li> Den pH-Wert der Lösung auf 7,2. </li><li> Bringen Sie die Lösung bis zu 450 mL. </li><li> Sterilisieren Sie die Lösung, indem sie durch einen 0,2 um Filter. </li><li> Fügen Sie 10% (50 ml) steriler Rinderfötenserum. </li></ol></li><li> Machen Sie sterile interstitielle Zellmedium <ol><li> Add 13,37 g pulverisierter DMEM auf 800 mL von 18 MOhm Wasser. </li><li> Add 3,7 g Natriumbicarbonat. </li><li> Add 1% (10 ml) Penicillin / Streptomycin. </li><li> Den pH-Wert der Lösung auf 7,2. </li><li> Bringen Sie die Lösung bis zu 900 mL. </li><li> Sterilisieren Sie die Lösung, indem sie durch einen 0,2 um Filter. </li><li> Fügen Sie 10% (100 ml) steriler Rinderserum. </li></ol></li></ol> 2. Isolierung von Herzklappenflügel <ol><li> Excise der Aortenwurzel sofort und aseptisch aus dem Herzen nach der Tötung. </li><li> Spülen Sie die Aortenwurzel von Blut mit kaltem sterilem DPBS. Es ist zwingend notwendig, um alle Blutbestandteile so schnell wie möglich zu entfernen, um VEC Tod und bakterielle Kontamination zu begrenzen. Antibiotika und Antimykotika sind zu diesem Zeitpunkt nicht empfohlen, da sie potentiell schädlich für die VEC sind. </li><li> Isolieren Klappensegel (3 pro Ventil) direkt von der Wurzel und in eine sterile 15 ml konische Röhrchen mit 12 ml kaltem DPBS gefüllt. Schütteln Sie mehrmals, um Schutt und wieder mit frischer DPBS entfernen. </li><li> Transport ins Labor auf Eis. </li><li> Bei der Ankunft im Labor, den Behälter mit dem Gewebe unter der sterile Haube. </li></ol> 3. Isolierung von Endothel <ol><li> Füllen Sie eine sterile 35mm Teller mit 3 ml kalte Collagenase-Lösung pro Ventil (3 Broschüren). </li><li> Legen Sie alle drei Segel aus dem 15-ml-Tube in die Schale mit der Collagenase-Lösung gefüllt. </li><li> Inkubieren des Gewebes für 5-10 Minuten bei 37 ° C. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Endothel durch Drehen einer trockenen sterilen Tupfer auf die Oberfläche des Blattes. Die Drehrichtung und Höhe der Scher-Anwendung ist entscheidend für die Reinheit Ihrer Probe. Die Rotation der Tupfer sollte in die entgegengesetzte Richtung in eine lineare Bewegung der Hand eine kontrollierte Scher werden. Diese Schere ist das, was hebt die Endothelzellen aus dem Gewebe. Der Betrag der Kraft angewendet werden sollte genug, um den Widerstand des Gewebes fühlen, aber nicht durchdringen die Basalmembran. </li><li> Gelegentlich dab den Tupfer in der Collagenase-Lösung zu verdrängen Zellen von der Spitze Fasern. Nach Abtupfen abgeschlossen ist, sollte die Textur der Endothelschicht fühlen etwas glatter als zuvor. </li><li> Sammeln Sie die Zellsuspension / Kollagenase und Übertragung auf einen neuen sterilen 15 ml Tube. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 1000 rpm für 5 Minuten auf Pellet keine isolierten Zellen und saugen Überstand. Wenn isolieren interstitiellen Zellen sowie, führen das Protokoll, während diese Zellen werden zentrifugiert werden. </li><li> Add 3 mL der endothelialen Schweine Medium, um die 15 ml Röhrchen, Zentrifuge ein zweites Mal, und saugen Medien. Diese zweite Zentrifugation hilft Filter einige der unerwünschten Materialien wie Spitze Fasern. </li><li> Re-suspend der zentrifugierten Endothelzellen in 5 ml Endothelzellen vom Schwein mittel-und Platte die Zellen in einem vorbeschichteten T-25 Kolben mit Kollagen (Einsatz 1 Flasche pro Zentrifugenröhrchen). </li><li> Lassen Sie die Zellen wachsen mindestens 2-3 Tage vor dem Ändern der endothelialen Medium. Dies hilft den Zellen wieder und teilen seit der Trennung Prozess ist ziemlich hart und die Zelle liefern kann niedrig sein. Es ist wichtig, um den Durchgang Zellen in der Nähe Zusammenfluss da der Kontakt Hemmung Zelltransformation führen könnte. </li></ol> 4. Vorbereitung von 60 mm Kulturschale für Side Specific Isolation <ol><li> Linie die 60 mm Petrischalen aus Glas mit Alu-Folie (2 Glasschalen pro leaflet). Die Aluminiumfolie hilft, das Paraffin zu entfernen, so dass das Glas-Petrischale für andere Isolierungen können wiederverwendet werden. </li><li> Legen Paraffin Perlen innerhalb der Gerichte, etwa zur Hälfte gefüllt, und ein Cover für Autoklavieren. </li><li> Nach dem Autoklavieren ist vollständig und Paraffin geschmolzen ist, bewegen Sie die Schüssel Ensemble zu einem kühlen ebene Fläche. Wie das Paraffin kühlt, wird es hart, und erstellen Sie eine Schicht, die Nadelstiche unterstützen wird. </li><li> Nach 30 Minuten kann die sterilisiert Gericht dann als Isolation Kammer verwendet werden, um den Prospekt Gewebe zu fixieren. </li></ol> 5. Isolierung von Side Specific Endothelschicht <ol><li> Entfernen Sie die Blätter aus dem 15mL Rohre und am vorbereitet 60mm Kulturschale für Seite spezifische Isolierung. </li><li> Bearbeiten Sie die Packungsbeilage, so dass die ventricularis Seite nach unten auf das Paraffin Oberfläche Verlassen des fibrosa Seite ausgesetzt. Pin den Rändern des Blattes auf die endotheliale Schicht freizulegen. </li><li> Legen Sie ein paar Tropfen kalten Kollagenase auf jeder (nach oben gerichteten) Endotheloberfläche und inkubieren das Gewebe für 5-10 Minuten bei 37 ° C. </li><li> Wie zuvor entfernen Sie vorsichtig das Endothel durch Drehen einer trockenen sterilen Tupfer auf die Oberfläche des Blattes. Die Drehrichtung und Höhe der Scher-Anwendung ist entscheidend für die Reinheit Ihrer Probe. Die Rotation der Tupfer sollte in die entgegengesetzte Richtung in eine lineare Bewegung der Hand eine kontrollierte Scher werden. Diese Schere ist das, was hebt die Endothelzellen aus dem Gewebe und sonst nichts. Der Betrag der Kraft angewendet werden sollte genug, um den Widerstand des Gewebes fühlen, aber nicht in das Gewebe eindringen. </li><li> Gelegentlich dab den Tupfer in der Collagenase-Lösung zu verdrängen Zellen von der Spitze Fasern. Nach Abtupfen abgeschlossen ist, sollte die Textur der Endothelschicht fühlen etwas glatter als zuvor. </li><li> Sammeln Sie die Zellsuspension / Kollagenase und Übertragung auf einen neuen sterilen 15 ml Tube. Geben Seite Spezifität auf dem Etikett (Flugblätter aus dem gleichen Ventil kann zusammengefasst werden müssen). </li><li> Übertragen Sie die Flugblätter an eine neue Kulturschale, so dass die ventricularis Seite jetzt ausgesetzt ist, und wiederholen Sie die Schritte (5,3-5,6). </li><li> Sobald alle Zellsuspension / Kollagenase gesammelt, zentrifugieren bei 1000 rpm für 5 Minuten auf Pellet keine isolierten Zellen und saugen Überstand. Wenn isolieren interstitiellen Zellen sowie, führen das Protokoll, während diese Zellen werden zentrifugiert werden. </li><li> Add 3 mL der endothelialen Schweine Medium, um die Rohre, Zentrifuge ein zweites Mal, und saugen Medien. Diese zweite Zentrifugation hilft Filter einige der unerwünschten Materialien wie Spitze Fasern. </li><li> Re-suspend der zentrifugierten Endothelzellen in 5 ml Endothelzellen vom Schwein mittel-und Platte die Zellen in einem vorbeschichteten T-25 Kolben mit Collage (Einsatz 1 Flasche pro Zentrifugenröhrchen). </li><li> Lassen Sie die Zellen wachsen mindestens 2-3 Tage vor dem Ändern der endothelialen Medium. Dies hilft den Zellen wieder und teilen seit der Trennung Prozess ist ziemlich hart. Wenn Sie die Ausbeute sehr gering zu sein Hinweis, in Erwägung ziehen, auf einen kleineren Kolben oder Well-Platte seit Zell-Zell-Adhäsion fördert das Zellwachstum. Denken Sie daran, um den Durchgang in der Nähe Zusammenfluss da der Kontakt Hemmung Zelltransformation führen könnte. </li></ol> 6. Isolation der interstitiellen Zellen <ol><li> Füllen Sie eine sterile 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 10 ml Kollagenase-Lösung pro Ventil (3 Broschüren). </li><li> Nach Abtupfen die Flugblätter von Endothelzellen sollten sofort in den entsprechenden 15mL Rohr mit der Collagenase-Lösung. </li><li> Inkubieren für ca. 12 bis 18 Stunden (leicht bewegen, wenn gewünscht). </li><li> Mix der abgebauten Gewebe vorsichtig mit einer serologischen Pipette bis Zellsuspension / Kollagenase wird homogenisiert. Diese Homogenisierung hilft brechen das Gewebe und lassen Sie die interstitiellen Zellen. </li><li> Centrifuge der verdauten Gewebe 5 Minuten bei 1000 rpm und saugen Sie den Überstand. </li><li> Add 5 mL interstitielle Schweine Medium, um die 15 ml Zentrifugenröhrchen, Zentrifuge ein zweites Mal, und saugen Überstand. </li><li> Re-suspend der zentrifugierten Endothelzellen in 5 ml interstitiellen Schwein mittel-und Platte die Zellen in einem T-75-Kolben (Einsatz 1 Flasche pro Zentrifugenröhrchen). </li><li> Lassen Sie die Zellen wachsen mindestens 1-2 Tage vor dem Ändern der interstitiellen Zellmedium. Es wird viel mehr Gewebereste, als mit den Endothelzellen, aber das ist zu erwarten. Die Zellen sollten auch zur Konfluenz schneller als die Endothelzellen, weil der Zelle Ertrag und ihrer Natur wachsen. </li></ol> 7. Vertreter Images <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Die Morphologie der isolierten Zellen auf 2-3 Tage nach der Trennung. (A) VEC weisen eine typische endotheliale Morphologie und Cluster bilden, um Wachstum zu fördern. (B) VIC Morphologie ähnelt Myofibroblasten, die im Allgemeinen spindelförmig und gleichmäßig über den Kolben zu verbreiten. <pclass src="/files/ftp_upload/2158/2158fig2.jpg" alt="Abbildung 2"></pclass> Abbildung 2. Die Morphologie der isolierten Zellen bei Konfluenz. (A) VEC weisen eine typische endotheliale Morphologie, die im Allgemeinen mit Kopfsteinpflaster und Wachstum Kontakt gehemmt. (B) VIC Morphologie ähnelt Myofibroblasten, die im Allgemeinen spindelförmig und nicht Wachstum Kontakt gehemmt. <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Die Funktion Eigenschaften der isolierten Zellen 6. (A) VEC sind mit hoher acetylierte LDL-Aufnahme (rot) verbunden. (B) VIC sind mit niedrigem acetyliertes LDL-Aufnahme verbunden sind. <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Cellular Marker isoliert Zellen 6. (A) VEC-Phänotyp ist eine positive Färbung für Von-Willebrand-Faktor (grün), blau (Kernen) beigetragen. (B) VIC Phänotyp ist, negative Färbung für Von-Willebrand-Faktor beigetragen. <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Cellular Marker der isolierten Zellen. (A) VEC-Phänotyp ist, negative Färbung für alpha SMA (grün), blau (Kernen) beigetragen. (B) VIC Phänotyp ist eine positive Färbung für alpha SMA beigetragen. <table border="1"><tbody><tr><td> Dissoziation Agenten </td><td> Dissoziation Technik </td><td> Zell-Sammlung </td><td> Zellmenge </td><td> Zelle Reinheit </td><td> Kontamination </td></tr><tr><td> EDTA (3mm) ohne CaCl 2 </td><td> 5, 20, 60 min. vor CaCl 2-Zugabe </td><td> 20, 60, 120 min. vor Abholung </td><td> - </td><td> + / - </td><td> + + + </td></tr><tr><td> EDTA (6mm), ohne CaCl 2 </td><td> 5, 20, 60 min. vor CaCl 2-Zugabe </td><td> 20, 60, 120 min. vor Abholung </td><td> + / - </td><td> + </td><td> + + + </td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA (0,5 g / L) </td><td> 5, 10, 15 min. vor Deaktivierung </td><td> Medium gesammelt sofort </td><td> + </td><td> + </td><td> + + </td></tr><tr><td> Collagenase II (300 U / mL) </td><td> 5, 10, 15 min. vor Deaktivierung </td><td> Medium gesammelt sofort </td><td> -, +, + + </td><td> -, + +, + </td><td> + </td></tr><tr><td> Collagenase II (600 U / mL) </td><td> 5, 10, 15 min. vor Deaktivierung </td><td> Medium gesammelt sofort </td><td> + + + + + + </td><td> + +, + +, - </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Ergebnisse der vorläufigen valvular Endothelzellen isoliert Protokolle.

<ol><li>Thompson, R. P., Fitzharris, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+truncus+arteriosus+of+the+chick+embryo+heart%3A+the+formation+and+migration+of+mesenchymal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the truncus arteriosus of the chick embryo heart: the formation and migration of mesenchymal tissue.</a> Am J Anat. 154, 545-556 (1979).</li>
<li>Johnson, C. M., Fass, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+cardiac+valvular+endothelial+cells+in+culture%3A+A+relative+deficiency+of+fibronectin+synthesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Porcine cardiac valvular endothelial cells in culture: A relative deficiency of fibronectin synthesis in vitro.</a> Lab Invest. 49 (5), 589-598 (1983).</li>
<li>Manduteanu, I., Popov, D., Radu, A., Simionescu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calf+cardiac+valvular+endothelial+cells+in+culture%3A+production+of+glycosaminoglycans%2C+prostacyclin+and+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Calf cardiac valvular endothelial cells in culture: production of glycosaminoglycans, prostacyclin and fibronectin.</a> J Mol Cell Cardiol. 20 (2), 103-118 (1988).</li>
<li>Cheunyg, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+isolating+and+purifying+porcine+aortic+valve+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JHVD%22%5BJournal%5D)">Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells.</a> JHVD. 17 (6), 674-681 (2008).</li>
<li>Paranya, G., Vineberg, S., Dvorin, E., Kaushal, S., Roth, S. J., Rabkin, E., Schoen, F. J., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+valve+endothelial+cells+undergo+transforming+growth+factor-beta-mediated+and+non-transforming+growth+factor-beta-mediated+transdifferentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro.</a> Am J Pathol. 159 (4), 1335-1343 (2001).</li>
<li>Butcher, J. T., Penrod, A., Garcia, A. J. M., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+morphology+and+focal+adhesion+development+of+valvular+endothelial+cells+in+static+and+fluid+flow+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Bio%22%5BJournal%5D)">Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments.</a> Arterioscler Thromb Vasc Bio. 24 (1), 1429-1434 (2004).</li>
<li>Simmons, C. A., Grant, G. R., Manduchi, E., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+heterogeneity+of+endothelial+phenotypes+correlates+with+side-specific+vulnerability+to+calcification+in+normal+porcine+aortic+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial heterogeneity of endothelial phenotypes correlates with side-specific vulnerability to calcification in normal porcine aortic valves.</a> Circ Res. 96, 792-799 (2005).</li>
<li>Butcher, J. T., Tressel, S., Johnson, T., Turner, D., Sorescu, G., Jo, H., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Profiles+of+Valvular+and+Vascular+Endothelial+Cells+Reveal+Phenotypic+Differences%3A+Influence+of+Shear+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Profiles of Valvular and Vascular Endothelial Cells Reveal Phenotypic Differences: Influence of Shear Stress.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 69-69 (2006).</li>
<li>Parachuri, S., Yang, J. H., Aikawa, E., Melero-Martin, J. M., Khan, Z. A., Loukogeorgakis, S., Schoen, F. J., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pulmonary+Valve+Progenitor+Cells+Exhibit+Endothelial%2FMesenchymal+Plasticity+in+Response+to+Vascular+Endothelial+Growth+Factor-A+and+Transforming+Growth+Factor-%CE%B22%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Human Pulmonary Valve Progenitor Cells Exhibit Endothelial/Mesenchymal Plasticity in Response to Vascular Endothelial Growth Factor-A and Transforming Growth Factor-β2.</a> Circ Res. 99 (8), 861-869 (2006).</li>
<li>Shi, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+circulating+bone+marrow-derived+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells.</a> Blood. 92, 362-367 (1998).</li>
<li>Rehman, J., Li, J., Orschell, C. M., March, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+endothelial+progenitor+cells+are+derived+from+monocyte%2Fmacrophages+and+secrete+angiogenic+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood endothelial progenitor cells are derived from monocyte/macrophages and secrete angiogenic growth factors.</a> Circulation. 107, 1164-1169 (2003).</li>
</ol>

Ein Verständnis der Herzklappen Biologie hat durch technische Schwierigkeiten Isolierung und Kultivierung reine Populationen valvular Endothelzellen beeinträchtigt wurde. Typische Isolierung Techniken beinhalten enzymatische Verdauung der zugrunde liegenden basalen Matrix oder chemische Spaltung von Endothelzellen Klebeverbindungen 2,3. Vorläufige Isolation Experimente wurden qualitativ durch unterschiedliche Dissoziation Agenten und Inkubationszeiten untersucht. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigten, das...

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modifiziertes Eagle-Medium</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>50-103-PB</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsin-EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Natriumheparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784-1G</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ 2</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21300-058</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen aus Rattenschwanz</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Kritische Tupfer</td><td>VWR international</td><td>89031-270</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>55761</td><td></td></tr><tr><td>T25-Flaschen</td><td>BD Biosciences</td><td>353018</td><td></td></tr><tr><td>T75-Flaschen</td><td>BD Biosciences</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>24-Loch-Platte</td><td>Falcon BD</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>60×15 mm-Schalen</td><td>VWR international</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>60×15 mm Glas-Schalen</td><td>VWR international</td><td>89000-310</td><td></td></tr><tr><td>Paraffineinbettungswachs</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19304-01</td><td></td></tr><tr><td>Precision-Glide-Nadeln</td><td>BD Biosciences</td><td>305165</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Nalgene-Filter</td><td>VWR international</td><td>73520-985</td><td></td></tr><tr><td>1 L Nalgene-Filter</td><td>VWR international</td><td>73520-986</td><td></td></tr><tr><td>Gewebepinzetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>11023-15</td><td></td></tr><tr><td>FSC-Pinzette Nr. 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-00</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von valvular endothelzellen

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Herzklappen sind allein verantwortlich für unidirektionale Blutfluss durch das Herz-Kreislauf-System. Diese dünne, faserige Gewebe zu erheblichen mechanischen Belastungen, wie sie öffnen und schließen mehrere Milliarden Mal im Lauf ihres Lebens ausgesetzt. Die unglaubliche Ausdauer dieser Gewebe ist aufgrund der ansässigen valvular Endothelzellen (VEC) und interstitiellen Zellen (VIC), die ständig repariert und neu zu gestalten als Reaktion auf lokale mechanische und biologische Signale. Erst vor kurzem haben wir begonnen, das einzigartige Verhalten dieser Zellen, für die in vitro Experimente eine wichtige Rolle gespielt hat, zu verstehen. Besonders herausfordernd ist die Isolierung und Kultivierung von VEC. Besondere Sorgfalt verwendet ab dem Zeitpunkt der Gewebe vom Host bis zur endgültigen Beschichtung entfernt werden. Hier präsentieren wir Protokolle zur direkten Isolierung, Seite spezifische Isolierung, Kultur, und die Überprüfung der reinen Populationen von VEC. Wir verwenden enzymatische Verdauung durch eine sanfte Tupfer Schabetechnik nur oberflächlichen Zellen verdrängen gefolgt. Diese Zellen werden dann in ein Röhrchen gesammelt und zentrifugiert zu einem Pellet. Das Pellet wird dann resuspendiert und in Kulturflaschen vorbeschichtet mit Kollagen I-Matrix. VEC-Phänotyp wird durch den Kontakt bestätigt gehemmt Wachstum und die Expression von endothelialen spezifische Marker wie PECAM1 (CD31), Von-Willebrand-Faktor (vWF) und negative Expression von alpha-smooth muscle actin (α-SMA). Die funktionellen Eigenschaften von VEC sind mit hoher acetylierte LDL assoziiert. Im Gegensatz zu vaskulären Endothelzellen, haben VEC die einzigartige Fähigkeit, sich in Mesenchym, was normalerweise während der Embryonalentwicklung Ventil Formation 1 zu transformieren. Dies kann auch während der deutlich längeren Beitrag konfluent in vitro-Kultur auftreten, so ist darauf zu, um den Durchgang an oder nahe Einmündung erfolgen. Nach VEC Isolation, können reine Populationen von VIC dann leicht erworben werden.

Wir stellen eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von reinen Populationen von Herzklappen-Endothelzellen (VEC). VEC von beiden Seiten der Höcker oder Prospekt isoliert werden können und unmittelbar nach ist zugrundeliegenden interstitiellen Zellen (VIC) Isolierung einfach.

Isolierung von Valvular Endothelzellen

Herzklappen sind allein für die Aufrechterhaltung eines unidirektionalen Blutflusses durch das Herz-Kreislauf-System verantwortlich. Diese dünnen, faserigen Gewebe sind ...

In diesem Video-Protokoll wird die Isolierung ortsansässiger interstitieller und seiten-spezifischer endothelialer Zellen aus einer aortalen Herzklappe demonstriert. Die Klappenblätter werden aus dem Herzen entnommen und in kalte Kochsalzlösung gelegt. Die endotheliale Schicht kann von beiden Seiten des Blättchens entfernt werden, indem das in Kollagenase-Lösung getauchte Gewebe vorsichtig mit einem Wattestäbchen abgeschabt wird. Für die seiten-spezifische Isolierung wird das Klappenblättchen auf ein Paraffinbett gespannt, sodass die endotheliale Oberfläche freiliegt.Anschließend werden einige Tropfen kalte Kollagenase zum Herzklappenblättchen gegeben, und die Blättchen werden fünf bis zehn Minuten lang inkubiert. Nach der Inkubation mit Kollagenase wird die seitenabhängige endotheliale Schicht durch vorsichtiges Abscheren des Gewebes entfernt. Mit einem Tupfer werden die freigesetzten endothelialen Zellen anschließend gesammelt, gewaschen und ausplattiert.Die verbleibenden Segel werden anschließend über Nacht verdaut, um die interstitiellen Zellen zu isolieren, die gesammelt und gewaschen werden. Alle isolierten Zellen werden kultiviert und können verwendet werden, um ihre Rolle b

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video-Protokoll zeigt die Isolierung und Kultivierung der menschlichen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) aus humanen Nabelschnur. Nach der Isolierung dieser Zellen in vitro Angiogenese-Assays, wie die optimierte Fibringel Bead Assay auch durch die Hughes-Labor nachgewiesen werden kann, verwendet werden.

Isolierung humaner Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC)

In diesem Video demonstrieren wir die Isolierung von interstitiellen Zellen der Aortenklappe aus dem Herzen einer erwachsenen Maus mit einem zweistufigen Kollagenase-Verfahren und deren anschließende Kultivierung in einem geringen Volumen an Wachstumsmedien.

Isolierung von interstitiellen Zellen der Mausklappe: Eine enzymatische Methode zur Isolierung und Kultivierung von VICs aus der Aortenklappe der Maus

Primäre Zellkultur ist eine nützliche Technik für die Analyse von spezifischen Populationen von Zellen, insbesondere von transgenen Maus-Embryonen in bestimmten Entwicklungsstadien. Hierin werden embryonalen Ventrikel seziert und distanziert, und Antikörper-konjugierten Perlen erkennen und trennen die Endothelzellen für die weitere Analyse.

Isolierung von embryonalen ventrikuläre Endothelzellen

Die Fähigkeit, Herzklappen-Endothelzellen (VECs) zu isolieren, ist entscheidend für das Verständnis der Mechanismen der Klappenentwicklung, -erhaltung und -erkrankung.  Hier beschreiben wir die Isolierung von VECs aus embryonalen und adulten Tie2-GFP-Mäusen mittels FACS, die Studien zur Bestimmung des Beitrags von VECs zu Entwicklungs- und Krankheitsprozessen ermöglichen wird.

Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

Dieses Protokoll wurde erstellt, um unsere Methode zur Isolierung von koronaren Endothelzellen von Mäusen zum Zwecke der Bildgebung oder zur Durchführung molekularbiologischer Experimente zu teilen.

Isolierung von Maus-Koronar-Endothelzellen

Wir präsentieren ein Protokoll zur Isolierung von endokardialen und koronaren Endothelzellen aus Rattenherzen durch sequentielle Gewebeverdauung in einem Verdauungspuffer, Zellsammlung aus rezidivierenden Zentrifugenzyklen und Zellreinigung mit rattenfeindlichen CD31-Mikroperlen.

Isolierung von Endokardialen und koronaren Endothelzellen aus der ventrikulären freien Wand des Rattenherzes

Dieser Artikel beschreibt die Isolierung von Aortenklappenzellen der Maus durch ein zweistufiges Kollagenase-Verfahren. Isolierte Mausklappenzellen sind wichtig für die Durchführung verschiedener Assays, wie diesen In-vitro-Verkalkungsassay, und für die Untersuchung der molekularen Wege, die zur Aortenklappenmineralisierung führen.

Isolierung von interstitiellen Klappenzellen der Maus zur Untersuchung der Verkalkung der Aortenklappe in vitro

Dieses Protokoll beschreibt die Entnahme menschlicher Aortenklappen, die während chirurgischer Aortenklappenersatzverfahren oder aus Leichengewebe extrahiert werden, und die anschließende Isolierung, Expansion und Charakterisierung patientenspezifischer primärer Klappenendothel- und interstitieller Zellen. Enthalten sind wichtige Details zu den Prozessen, die erforderlich sind, um die Zelllebensfähigkeit und Phänotypspezifität sicherzustellen.

Isolierung humaner primärer Klappenzellen für die In-vitro-Krankheitsmodellierung

Wir stellen eine Methode zur Isolierung von Endothelzellen und -kernen aus dem Lumen von Maus-Halsschlagadern vor, die stabilen oder gestörten Strömungsbedingungen ausgesetzt sind, um Einzelzell-Omics-Experimente durchzuführen.

Isolierung von Endothelzellen aus dem Lumen von Maus-Halsschlagadern für Einzelzell-Multi-Omics-Experimente

Obwohl die Isolierung von pulmonalen Endothelzellen eine Herausforderung darstellt, ist sie für Studien zur Lungenentzündung unerlässlich. Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur hochwirksamen, hochreinen Isolierung von makrovaskulären und mikrovaskulären Endothelzellen.

Mikrovaskuläre und makrovaskuläre Endothelzellisolierung und -reinigung aus Lungenproben

In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur magnetischen Bead-basierten Isolierung von murinen Endothelzellen aus dermalen lymphatischen Kapillaren beschrieben. Die isolierten lymphatischen Endothelzellen können für nachgelagerte In-vitro-Experimente und Proteinexpressionsanalysen verwendet werden.

Isolierung von dermalen lymphatischen Endothelzellen der Maus

Erfahren Sie die Isolierung von Herzklappen-Endothelzellen aus Aortenklappen mit Kollagenase und Wattestäbchen. Diese Methode ermöglicht seiten-spezifische Zellgewinnung für kardiovaskuläre Forschung.

Isolierung von Valvular Endothelzellen

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