Isolierung von Valvular Endothelzellen

In diesem Video-Protokoll wird die Isolierung ortsansässiger interstitieller und seiten-spezifischer endothelialer Zellen aus einer aortalen Herzklappe demonstriert. Die Klappenblätter werden aus dem Herzen entnommen und in kalte Kochsalzlösung gelegt. Die endotheliale Schicht kann von beiden Seiten des Blättchens entfernt werden, indem das in Kollagenase-Lösung getauchte Gewebe vorsichtig mit einem Wattestäbchen abgeschabt wird. Für die seiten-spezifische Isolierung wird das Klappenblättchen auf ein Paraffinbett gespannt, sodass die endotheliale Oberfläche freiliegt.

Anschließend werden einige Tropfen kalte Kollagenase zum Herzklappenblättchen gegeben, und die Blättchen werden fünf bis zehn Minuten lang inkubiert. Nach der Inkubation mit Kollagenase wird die seitenabhängige endotheliale Schicht durch vorsichtiges Abscheren des Gewebes entfernt. Mit einem Tupfer werden die freigesetzten endothelialen Zellen anschließend gesammelt, gewaschen und ausplattiert.

Die verbleibenden Segel werden anschließend über Nacht verdaut, um die interstitiellen Zellen zu isolieren, die gesammelt und gewaschen werden. Alle isolierten Zellen werden kultiviert und können verwendet werden, um ihre Rolle bei der Reparatur und Umgestaltung von Herzklappen als Reaktion auf lokale mechanische und biologische Signale zu verstehen. Hallo, mein Name ist Russell Gould.

Ich befinde mich hier an der Cornell University in der Abteilung für biomedizinische Technik und arbeite im Butcher-Labor. Heute zeige ich Ihnen, wie man klappenständige endotheliale Zellen isoliert. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis zur Aufklärung, wie residente V-Zellen kontinuierlich Reparatur- und Umbauprozesse als Reaktion auf mechanische und biologische Signale durchführen.

Beginnen wir also. Zunächst beschaffen Sie sich ein Schwein von einem örtlichen Schlachthof und entnehmen unter aseptischen Bedingungen die Aortenwurzel. Spülen Sie die Aortenwurzel gründlich von Blutresten frei.

Mit kaltem, sterilen DPBS ist es unerlässlich, alle Blutbestandteile so schnell wie möglich zu entfernen, um den Tod der valvulären endothelialen Zellen oder VEC sowie bakterielle Kontaminationen zu begrenzen. Antibiotika und Antimykotika werden in diesem Stadium nicht empfohlen, da sie für die ecs potenziell schädlich sein können. Danach direkt von der Wurzel drei isolieren.

Herzklappläppchen von jeder Klappe. Seien Sie vorsichtig bei der Isolierung des Läppchens, da jegliches ringförmige Gewebe die Zellpopulation verunreinigen wird. Legen Sie die isolierten Läppchen in ein steriles kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen, das mit 12 Milliliter kaltem DPBS gefüllt ist.

Mehrmals schütteln, um Ablagerungen zu entfernen, und mit frischem DPBS auffüllen. Schließlich die Herzklappenblätter gekühlt auf Eis zurück ins Labor transportieren. Nach Eintreffen im Labor den Behälter mit dem Gewebe unter die sterile Haube stellen und die Isolierung der endothelialen Schicht vornehmen. Die folgenden Geräte in einer abgedeckten Instrumentenschale autoklavieren: gezahnte Gewebezangen, Gewebescheren und Wattestäbchen.

Bereiten Sie außerdem sterile Kollagenase-Lösung, endotheliales Medium und interstitielles Medium vor, wie in dem begleitenden schriftlichen Protokoll beschrieben. Füllen Sie eine sterile 35-Millimeter-Schale mit drei Milliliter kalter Kollagenase-Lösung pro Klappe und geben Sie alle drei Segel aus dem 15-Milliliter-Röhrchen in die Schale.

Inkubieren Sie das Gewebe fünf bis 10 Minuten bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie anschließend vorsichtig die Endothelschicht von beiden Seiten des Blättchens, indem Sie einen trockenen, sterilen Tupfer über die Oberfläche rotieren lassen. Die Rotationsrichtung und die aufgebrachte Scherkraft sind entscheidend für die Reinheit der Probe.

Die Drehung des Tupfers erfolgt in entgegengesetzter Richtung zur linearen Bewegung der Hand, die den Wattestäbchen hält. Dadurch entsteht eine kontrollierte Scherkraft, die die endothelialen Zellen vom Gewebe löst. Die aufgebrachte Kraftmenge ist ausreichend, um den Widerstand des Gewebes zu spüren, jedoch ohne die Basalmembran zu durchdringen. Tupfen Sie den Stäbchen gelegentlich in die Kollagenase-Lösung, um die Zellen von den Fasern der Spitze zu lösen.

Nach Abschluss des Abstrichs sollte sich die Textur der endothelialen Schicht etwas glatter anfühlen als zuvor. Sammeln Sie die in der Kollagenase-Lösung suspendierten Zellen und überführen Sie sie in ein neues steriles 15-Liter-Gefäß. Nachdem die endothelialen Zellen von den Segeln abgestrichen wurden, legen Sie die Segel unverzüglich in ein 15-Milliliter-Gefäß, das 10 Milliliter Kollagenase-Lösung zur Isolierung interstitieller Zellen enthält.

Zentrifugieren Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei 1000 U/min und Raumtemperatur, um eventuell isolierte Zellen zu pelletieren, und aspirieren Sie das Überstand. Geben Sie drei Milliliter endotheliales Medium zu den 15-Milliliter-Röhrchen hinzu. Zentrifugieren Sie ein zweites Mal wie zuvor und aspirieren Sie das Medium.

Diese zweite Zentrifugation hilft dabei, unerwünschte Materialien wie Tippfasern zu entfernen. Überführen Sie die endothelialen Zellen erneut in fünf Milliliter endotheliales Medium und säen Sie die Zellen in einem mit Kollagen präkodierten T-25-Fläschchen aus. Unter Verwendung eines Fläschchens pro Zentrifugenröhrchen lassen Sie die Zellen mindestens zwei bis drei Tage lang wachsen, bevor Sie das endotheliale Medium wechseln.

Dies hilft den Zellen, sich zu erholen und zu teilen. Da der Isolationsprozess ziemlich anspruchsvoll ist und die Zellausbeute gering sein kann, ist es entscheidend, die Zellen kurz vor Konfluenz weiterzupassen. Da Kontaktinhibition zu einer Zelltransformation führen könnte, können endotheliale Zellen auch von einer bestimmten Seite isoliert werden.

Um dies zu tun, bereiten Sie zuerst eine Petrischale mit einer Paraffinschicht vor. 60 Millimeter große Glas-Petrischalen mit Aluminiumfolie. Berechnen Sie zwei Glas-Schalen pro Blättchen.

Die Aluminiumfolie hilft dabei, das Paraffin zu entfernen, um die Petrischale wiederverwenden zu können. Danach Paraffinkügelchen etwa zur Hälfte in die Schalen geben und verschließen, um sie zu autoklavieren. Sobald das Autoklavieren abgeschlossen ist und das Paraffin geschmolzen ist, das Schalenset auf eine kühle, ebene Oberfläche stellen.

Während das Paraffin abkühlt, verhärtet es und bildet eine Schicht, die Nadelpunktionen trägt. Nach 60 Minuten kann die sterilisierte Schale verwendet werden, um das Klappensegel-Gewebe zu fixieren. Entfernen Sie die aus der Klappe isolierten Segel aus den 15-Milliliter-Röhrchen und legen Sie sie auf das Paraffinbett.

Positionieren Sie die Segel so, dass die ventrikuläre Seite nach unten auf der Paraffinfläche liegt und die fibrotische Seite freiliegt. Befestigen Sie die Ränder des Segels mit Nadeln, um die endotheliale Schicht freizulegen. Geben Sie anschließend einige Tropfen kalte Kollagenase auf jede nach oben zeigende endotheliale Oberfläche und inkubieren Sie das Gewebe fünf bis zehn Minuten bei 37 Grad Celsius.

Nach Beendigung der Inkubation die Endothelschicht vorsichtig wie zuvor durch Drehen eines trockenen, sterilen Tupfers auf der Oberfläche des Segments entfernen. Gelegentlich den Tupfer in der Kollagenase-Lösung abstreifen, um Zellen von den Spitzenfasern zu lösen. Nach Abschluss des Abtupfens sollte sich die Textur der Endothelschicht etwas glatter anfühlen als zuvor.

Sammeln Sie die Zellsuspension und überführen Sie sie in ein neues steriles 15-Milliliter-Röhrchen. Die Seiten-Spezifität auf den Etikett-Blättchen zeigt an, dass Klappen aus derselben Klappe zusammengefasst werden können. Spülen Sie die fixierte Klappe mit einigen Tropfen kaltem DPBS, um verbleibende Zellen oder Rückstände zu entfernen.

Überführen Sie die Segel in eine neue Kulturschale, sodass nun die ventrikuläre Seite freiliegt, und sammeln Sie die Endothelzellen wie gerade gezeigt. Sobald das Abwischen der Endothelzellen vom G-Segel abgeschlossen ist, legen Sie die Segel unverzüglich in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das 10 Milliliter Kollagenase-Lösung enthält. Waschen Sie die Zellen resus, suspendieren und kultivieren Sie sie wie für die nicht seiten-spezifische Isolierung der Endothelzellen gezeigt.

Wenn die Zellausbeute sehr gering ist, erwägen Sie einen Wechsel zu einem kleineren Kolben oder die Verwendung einer Mehrwellplatte. Da die Zell-Zell-Adhäsion das Zellwachstum fördert, sollten Sie die Zellen nahe der Konfluenz passagieren. Da Kontaktinhibition zu einer Zelltransformation führen könnte, beginnen Sie die Isolierung der Interstitialzellen, während die endothelialen Zellen zentrifugiert werden, und inkubieren Sie die Röhrchen mit den Segeln etwa 12 bis 18 Stunden lang.

In Kollagenase-Lösung unter gegebenenfalls sanftem Schütteln. Am Ende der Inkubationszeit die digerierende Gewebeprobe mit einer serologischen Pipette vorsichtig mischen, bis die Zellsuspension homogenisiert ist. Diese Homogenisierung trägt dazu bei, das Gewebe aufzulösen und die Interstitialzellen freizusetzen; anschließend die Zellen zentrifugieren und waschen, wie zuvor für die endothelialen Zellen beschrieben.

Verwenden Sie stattdessen fünf Milliliter Interstitiellmedium resus, suspendieren Sie die Zellen aus der Zentrifuge in 15 Milliliter Interstitiellmedium und säen Sie die Zellen in einen T-75-Flasche ab, wobei eine Flasche pro Zentrifugenröhrchen verwendet wird. Lassen Sie die Zellen mindestens ein bis zwei Tage wachsen, bevor Sie das Interstitiellmedium wechseln; rechnen Sie mit mehr Gewebetrümmern als bei den endothelialen Zellen. Außerdem wachsen die interstitiellen Zellen von Natur aus schneller bis zur Konfluenz und liefern höhere Zellausbeuten, wie in diesen repräsentativen Bildern gezeigt.

Die Morphologie von kultivierten V-Klappenendothelzellen und vs. Klappeinterstitiellen Zellen wird nach zwei bis drei Tagen gezeigt. BECs weisen eine typische endotheliale Morphologie auf, bei der die Zellen ein gepflastertes Muster aufweisen und mit der Clusterbildung beginnen.

Die VS. zeigen eine Morphologie, die Myofibroblasten ähnelt, wobei die Zellen im Allgemeinen spindelförmig sind und bei Kultivierung bis zur Konfluenz spärlich besiedelt sind; ECS zeigen eine typische endotheliale Morphologie, bei der die Zellen ein kopfsteinartiges Muster bilden und das Wachstum kontaktinhibiert ist. Die VI-CS zeigen eine Morphologie, die Myofibroblasten ähnelt, wobei die Zellen im Allgemeinen spindelförmig sind und keine Kontaktinhibition des Wachstums aufweisen. Funktionelle Eigenschaften sowohl von VEC als auch von VIC können aus Färbungen abgeleitet werden. Für eine markierte LDL-Aufnahme.

VEC-Zellen weisen hohe Aufnahmeraten von acetyliertem LDL auf. Während VIC-Zellen mit geringen Aufnahmeraten von acetyliertem LDL assoziiert sind, werden hier Zellmarker für VEC und VIC gezeigt. ECS färben positiv für von-Willebrand-Faktor, während vs.

Zeigen keine von-Willebrand-Faktor-Färbung. Außerdem färben sich VCS negativ für alpha glatte Muskelaktin, während sich VCS positiv für alpha glatte Muskelaktin färben. Nun, ich hoffe, Sie haben heute viel von unseren Isolationen gelernt.

Es ist jedoch wichtig zu bedenken, dass die Basalmembran der endothelialen Zelle sehr empfindlich ist und jede Störung der darunterliegenden Matrix häufig kontaminierende Zellen aus dem übrigen Gewebe freisetzt. Zur Bestätigung einer erfolgreichen Isolierung ist die Charakterisierung entscheidend, um die Reinheit Ihrer Isolate zu bewerten. Also viel Erfolg.