Die Beurteilung stomatäre Response to Bakterienzellen Live mit Whole Leaf Imaging
2. Oktober 2010
Wir haben eine einfache und reproduzierbare Protokoll Stomata Reaktion auf lebende Bakterien Zugang entwickelt. Diese Methode minimiert Verwundung und Manipulation des Blattes über die Nutzung von epidermalen schält Vergleich bereits berichtet.
Bei diesem Verfahren wird die Blattbildgebung verwendet, um die Bewegung der Spaltöffnungszellen als Reaktion auf lebende Bakterienzellen zu beurteilen. Zunächst werden die Bakterien aus einer Glycerinlagerkultur angezüchtet und ein Inokulum hergestellt. Anschließend werden junge, gesunde Blätter gesammelt und mit Propidiumiodid angefärbt.
Die gefärbten Blätter werden zugeschnitten und die Blattstücke auf der Oberfläche einer Bakteriensuspension inkubiert. Schließlich wird die Blattoberfläche unter dem Mikroskop untersucht und die Spaltöffnungen der Stomata können gemessen werden. Die mit der Fluoreszenzmikroskopie erhaltenen Ergebnisse zeigen Veränderungen der Stomataöffnungen als Reaktion auf Bakterien.
Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Methoden wie der Verwendung von Epidermisabschnitten besteht darin, dass das Blatt, das mit Bakterien in Kontakt steht, intakt bleibt und somit die natürlichen Bedingungen für das Eindringen von Bakterien in die Blätter nachahmt. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie Arabidopsis-Samen in einem Volumenverhältnis von 1:1:1 aus Anzuchtmedium, Bims und Vermiculit aussäen. Kultivieren Sie die Pflanzen in einer Wachstumskammer bei Beleuchtung und gießen Sie nach Bedarf.
Die Pflanzen sind in vier bis sechs Wochen verwendungsbereit, wenn sie junge, vollständig entfaltete Blätter aufweisen, bevor sie in die Blüte gehen. Zwei Tage vor Beginn des Experiments bereiten Sie die Bakterienkulturabstriche vor. Impfen Sie Pseudomonas ringe aus der Glycerinlagerkultur auf modifiziertem LB-Medium an und inkubieren Sie 24 Stunden bei 28 Grad Celsius.
Verwenden Sie eine frische Kultur zur Herstellung des Inokulums und beginnen Sie Kulturplatten immer mit Glycerin-Stämmen. Da Bakterien nach Subkultur an Virulenz verlieren, verwenden Sie Bakterien, die auf der Platte gewachsen sind, um eine 10 Milliliter flüssige Kultur von Pseudomona singe anzusetzen. Inkubieren Sie die Kultur über Nacht in einem 50 Milliliter Erlenmeyerkolben bei 28 Grad Celsius mit starkem Schütteln, bis eine optische Dichte (OD) bei 600 Nanometern zwischen 0,8 und 1 erreicht ist.
Messen Sie den OD bei 600 und gewinnen Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 1.360 ×g für 10 Minuten. Resuspendieren Sie die Zellen in destilliertem Wasser, sodass der endgültige OD 0,2 beträgt. Dieser OD entspricht 10 hoch 8 koloniebildenden Einheiten pro Milliliter.
Wenn die Bakterien bereit sind, bereiten Sie als Nächstes die Blätter vor und führen Sie den Assay durch, um die Blätter anzufärben. Bereiten Sie zunächst eine 20-Mikromolar-Lösung aus Propidiumiodid (PI) in Wasser vor. 10 Milliliter Lösung reichen aus, um jeweils drei kleine Blätter zu färben.
Entnehmen Sie die Pflanzen aus der Wachstumskammer und lösen Sie mit einer Pinzette drei junge, vollständig entfaltete Blätter ab. Tauchen Sie die ganzen Blätter fünf Minuten lang in die PI-Lösung ein. Anschließend nehmen Sie die Blätter heraus und spülen sie kurz mit destilliertem Wasser ab.
Als Nächstes legen Sie ein Blatt mit der Unterseite nach unten auf einen Objektträger. Schneiden Sie das Blatt mit einer scharfen Rasierklinge in vier Stücke, wobei die Mittelrippe ausgeschlossen wird, damit das Blatt flach auf dem Objektträger liegt, um die Bakterien mit den Blättern zu inkubieren. Geben Sie 300 µL Bakteriensuspension unter die Blattstücke auf den Objektträger und stellen Sie sicher, dass die Unterseite des Blattes mit dem Inokulum in Kontakt ist.
Die Proben unter den gleichen Umweltbedingungen inkubieren, die zur Aufzucht der Pflanzen verwendet wurden. Wenn es Zeit ist, die Blätter unter dem Mikroskop zu beobachten, die Blattstücke auf eine neue Objektträgerplatte übertragen, wobei die Unterseite nach oben zeigt. Beachten Sie, dass beim Präparieren der Objektträger kein Deckglas verwendet wird.
Derselbe Blattproben kann während der Inkubation mehrmals abgebildet werden, und ein Zeitverlauf kann je nach Forschungszielen eingerichtet werden. Hier wird ein Laser-Scanning-Konfokalmikroskop verwendet, um die Blätter zu untersuchen, die Unterseite der Blätter zu beobachten, um die Fluoreszenz von PI mit denselben Blattproben nachzuweisen, und um im Zeitverlauf Bilder der Stomata aufzunehmen. Speichern Sie die Bilder zur Messung der Breite der stomatalen Öffnung.
Messen Sie die Spaltöffnungsbreite von mindestens 60 Spaltöffnungen für jede Behandlung zu jedem Zeitpunkt. Berechnen Sie mithilfe des LSM-Bildbetrachters den Durchschnitt und den Standardfehler der Spaltöffnungsbreite. Die statistische Signifikanz der Ergebnisse kann mit zweiseitigen gepaarten t-Tests berechnet werden.
Der T-Test hier zeigt ein typisches mikroskopisches Bild der Oberfläche eines Arabidopsis-Blattes unter einem Laser-Scanning-Konfokalmikroskop. Im Hellfeldbild färbt Propidiumiodid die Zellwand lebensfähiger Zellen und erhöht dadurch die Sichtbarkeit der Spaltöffnungszellen, zusätzlich zur Identifizierung unbeschädigter Zellen. In diesen Mikroaufnahmen ist eine Bandbreite an stomatären Öffnungen von vollständig geschlossenen bis zu weit geöffneten Stomata zu erkennen.
Vollständig geschlossene Stomata werden an der Form der Schließzellen erkannt. Bei offenen Stomata wird die Spaltbreite als null Mikrometer betrachtet. Die angezeigte Spaltbreite wird gemessen, indem eine gerade Linie über den breitesten Bereich der Stomaspalte gezogen wird.
Dies sind typische experimentelle Ergebnisse des Lebend-Blatt-Inokulationsassays. Arabidopsis-Blätter wurden im Dunkeln mit drei verschiedenen Stämmen von Pseudomonas syringae inkubiert; lediglich der Bakterienstamm Pst DC3000 war in der Lage, die im Dunkeln geschlossenen Stomata zu öffnen, gemessen an der Öffnungsbreite von jeweils 60 zufällig ausgewählten Stomata pro Bakterienstamm. Diese Technik hat Forschern auf dem Gebiet der Pflanze-Bakterium-Interaktionen den Weg geebnet, die Mechanismen der frühen Abwehrreaktion gegen Pathogene in Pflanzenarten zu untersuchen.
Übersicht
Diese Studie stellt ein neuartiges Protokoll zur Beurteilung der Spaltöffnungsreaktionen auf lebende Bakterien unter Verwendung intakter Blätter vor, wodurch im Vergleich zu herkömmlichen Methoden Schäden minimiert werden. Die Technik ermöglicht die Echtzeitbeobachtung der Bewegung der Schließzellen als Reaktion auf die Exposition gegenüber Bakterien.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Pflanzen-Mikroben-Interaktionen
- Stomatale Physiologie
- Fluoreszenzmikroskopie
Hintergrund
- Stomata sind entscheidend für den Gasaustausch in Pflanzen.
- Sperrzellen regulieren die stomatäre Öffnung als Reaktion auf Umweltreize.
- Herkömmliche Methoden beschädigen oft das Blattgewebe, was die Ergebnisse beeinträchtigt.
- Diese Studie zielt darauf ab, die Beurteilung der stomatären Reaktionen auf Pathogene zu verbessern.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer reproduzierbaren Methode zur Untersuchung der Spaltöffnungsreaktionen auf lebende Bakterien.
- Minimierung von Blattverletzungen während der Experimente.
- Beobachtung von Echtzeit-Veränderungen der Spaltöffnungsweite mittels Fluoreszenzmikroskopie.
Verwendete Methoden
- Herstellung bakterieller Kulturen aus Glycerinbeständen.
- Färbung von Blattgeweben mit Propidiumiodid zur Visualisierung.
- Bebrütung von Blattproben mit bakteriellen Suspensionen.
- Mikroskopische Bildgebung zur zeitlichen Messung der Spaltöffnungsweite.
Hauptergebnisse
- Änderungen der Spaltöffnungsweite wurden als Reaktion auf verschiedene Bakterienstämme beobachtet.
- Die Methode mit intakten Blättern ermöglichte genauere Bewertungen des Spaltöffnungsverhaltens.
- Die statistische Analyse bestätigte signifikante Unterschiede in den Öffnungsweiten zwischen den Behandlungen.
- Die Technik erleichtert die Erforschung von Pflanze-Pathogen-Interaktionen.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode bietet einen zuverlässigen Ansatz, um stomatäre Reaktionen auf Pathogene zu untersuchen.
- Sie vertieft das Verständnis der pflanzlichen Abwehrmechanismen gegen bakterielle Infektionen.
- Das Protokoll kann auf verschiedene Pflanzenarten angewendet werden, was weiterreichende Forschungsmöglichkeiten eröffnet.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Beurteilung der Spaltöffnungsdynamik als Reaktion auf lebende bakterielle Stimuli ohne Zerstörung der Probe und unterstützt so die mechanistische Risikominderung bei Untersuchungen zur Pflanze-Pathogen-Interaktion. Durch die Erhaltung der Blattintegrität und die Nachbildung natürlicher Infektionsbedingungen wird das Vorhersagevertrauen bei der frühen Zielvalidierung für die Entwicklung von Agrochemikalien oder Biopestiziden erhöht. Der Ansatz adressiert einen entscheidenden Wendepunkt in der Forschung: die Unterscheidung direkter bakterieller Effekte auf die Wirtsphysiologie von sekundären Stressantworten.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem stomatäre Öffnungsänderungen als funktioneller Endpunkt der bakteriellen Virulenz oder der Aktivierung der Wirtsabwehr quantifiziert werden.
- Operativer Wert: Ermöglicht die biologische Ent风险bewertung durch reproduzierbare, quantitative Messungen der Bewegung von Schließzellen unter kontrollierten Koinkubationsbedingungen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem bakterielle Stämme oder Verbindungen identifiziert werden, die das stomatäre Verhalten signifikant verändern und damit potenzielle pathogene oder immunmodulatorische Aktivität anzeigen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt validierte biologische Systeme (intakte Blätter mit angefärbten Schließzellen), die für nachgeschaltete Screening-Kampagnen mit Verbindungen oder Stämmen geeignet sind.
- Quantitative Ausgabe: Erzeugt messbare, zeitlich aufgelöste Daten zur Spaltöffnungsweite, die Dosis-Wirkungs- und kinetische Analysen ermöglichen.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die wiederholte Abbildung derselben Blattprobe über die Zeit, wodurch der Durchsatz erhöht und die biologische Variabilität verringert wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Modelliert natürliche Eintrittspunkte von Pathogenen und bietet damit ein krankheitsrelevantes System zur Bewertung von Interventionen, die die bakterielle Invasion blockieren oder die Wirtsimmunität modulieren.
- Translationale Kontinuität: Verbindet mechanistische Erkenntnisse aus der Entdeckungsphase mit der präklinischen Validierung, indem der physiologische Kontext während der gesamten Experimentation erhalten bleibt.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Ermöglicht eine frühzeitige Beurteilung, ob eine Kandidatenverbindung die durch Pathogene induzierte Stomataöffnung verhindert, und liefert damit Grundlagen für Go/No-Go-Entscheidungen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den frühen Entdeckungsprozess ein, unterstützt die Hypothesenprüfung bei der Zielvalidierung und ermöglicht die Entwicklung reproduzierbarer Assays für Screening-Kampagnen, die auf Pflanzenimmunmodulatoren oder Anti-Virulenzmittel ausgerichtet sind.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die mechanistische Entlastung von Risiken, indem die Spaltöffnungsreaktion als abhängige Variable in Untersuchungen zur Wirt-Pathogen-Interaktion isoliert wird.
- Screening: Liefert standardisierte, quantitative Messungen der Spaltöffnungsweite, die eine zuverlässige Bewertung von Substanzen unter verschiedenen Bedingungen unterstützen.
- Analytik: Stellt Werte für die Spaltöffnungsweite und statistische Ergebnisse (Mittelwert, Standardfehler, t-Test-Signifikanz) bereit, die einen Vergleich zwischen Bedingungen und die Bestimmung der Effektgröße ermöglichen.
- Translationale Forschung: Erhält die Lebensfähigkeit der Blätter und die natürliche Oberflächentopographie aufrecht, wodurch Beobachtungen das physiologisch relevanten Verhalten der Schließzellen widerspiegeln.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare, bildbasierte Plattform, die auf verschiedene Bakterienstämme, Pflanzenarten oder chemische Bibliotheken anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem die bakterielle Exposition direkt mit der Spaltöffnungsdynamik in intaktem Gewebe verknüpft wird.
- Operativer Wert: Stellt Standardisierung und Reproduzierbarkeit sicher, indem Blattverletzungen minimiert und konstante Umweltbedingungen gewährleistet werden.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem frühzeitige, physiologisch relevante Wirksamkeitssignale bereitgestellt werden, wodurch das Risiko spätzeitiger Fehlschläge sinkt.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Kandidaten basierend auf ihrer Fähigkeit, immunologische Reaktionen der Spaltöffnungen zu modulieren.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Pflanzengeweben, in der Vorbereitung bakterieller Kulturen und in der konfokalen Mikroskopie.
- Setzt den Zugang zu einer Laser-Scanning-Konfokalmikroskopie und Bildanalysewerkzeugen für die stomatäre Morphometrie voraus.
- Erfordert eine Standardisierung der Inkubationsbedingungen (Licht, Luftfeuchtigkeit, Temperatur), um die Reproduzierbarkeit zwischen den Versuchsreihen sicherzustellen.
- Die Anpassung an andere Pflanzenarten kann eine Optimierung der Färbedauer und der Bakterienkonzentration erfordern.
- Praktische Einschränkung: Längere Bildaufnahmesitzungen können Blattstress verursachen, was eine Überwachung der Probenvitalität im Zeitverlauf notwendig macht.
