Die Beurteilung stomatäre Response to Bakterienzellen Live mit Whole Leaf Imaging

Bei diesem Verfahren wird die Bildgebung der who Leaf verwendet, um die Bewegung der Schließzellen als Reaktion auf lebende Bakterienzellen zu beurteilen. Zunächst werden die aus einem Glycerinstamm akkulturierten Bakterien und ein Inokulum hergestellt. Dann werden junge, gesunde Blätter gesammelt und mit Propidiumiodid gefärbt.

Die gefärbten Blätter werden abgeschnitten und die Blattstücke werden auf einer Bakteriensuspension inkubiert. Abschließend wird die Blattoberfläche unter dem Mikroskop betrachtet und es können Stomataöffnungen vermessen werden. Die mit der Fluoreszenzmikroskopie gewonnenen Ergebnisse zeigen Veränderungen der stomatalen Apertur als Reaktion auf Bakterien.

Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Methoden wie der Verwendung von Epidermisschalen besteht darin, dass das Blatt, das mit Bakterien in Kontakt kommt, intakt ist und die natürlichen Bedingungen für das Eindringen von Bakterien in die Blätter nachahmt. Arabidopsis sät also auf einer Eins-zu-Eins-Mischung aus Substrat, zu einer V bis V zu V-Mischung. Finden Sie Vermiculit-Amit-Licht, lassen Sie die Pflanzen in einer Wachstumskammer wachsen und gießen Sie sie nach Bedarf.

Die Pflanzen sind in vier bis sechs Wochen gebrauchsfertig, wenn sie junge, vollständig ausgebreitete Blätter haben, bevor sie ausgetrieben werden. Bereiten Sie zwei Tage vor Beginn des Experiments den Bakterienkulturstreifen vor. Pseudomonas werden aus dem Glycerinstamm auf modifiziertem LB-Medium hergestellt und 24 Stunden lang bei 28 Grad Celsius inkubiert.

Verwenden Sie frische Kulturen, um das Inokulum vorzubereiten, und beginnen Sie die Kulturplatten immer mit Glycerinbeständen. Da Bakterien nach der Subkultur weniger virulent werden, verwenden Sie Bakterien, die auf der Platte gewachsen sind, um eine 10-Milliliter-Flüssigkultur von Pseudomona Singe zu starten. In einem 50-Milliliter-Erlenmeyerkolben wird die Kultur über Nacht bei 28 Grad Celsius unter kräftigem Schütteln inkubiert, bis sie eine optische Dichte oder einen od bei 600 Nanometern zwischen 0,8 und eins erreicht.

Messen Sie den OD bei 600 und ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 1.360 mal G für 10 Minuten. Bei der Reanimation werden die Zellen in destilliertem Wasser suspendiert, so dass der endgültige OD 0,2 beträgt. Dieser od entspricht 10 zu den acht koloniebildenden Einheiten pro Milliliter.

Wenn die Bakterien bereit sind, bereiten Sie die Blätter vor und führen Sie den Test durch, um die Blätter zu färben. Bereiten Sie zunächst 20 mikromolare Propidium-, Jodid- oder PI-Lösung in Wasser vor. 10 Milliliter Lösung reichen aus, um drei kleine Blätter auf einmal zu färben.

Nehmen Sie die Pflanzen aus der Wachstumskammer und lösen Sie mit einer Pinzette drei junge, vollständig ausgebreitete Blätter. Tauchen Sie die ganzen Blätter fünf Minuten lang in die PI-Lösung. Dann die Blätter entfernen und kurz mit destilliertem Wasser abspülen.

Legen Sie als Nächstes ein Blatt mit der Unterseite nach unten auf einen Objektträger. Schneide das Blatt mit einer scharfen Rasierklinge in vier Stücke, wobei die Mittelader ausgenommen ist, so dass das Blatt flach auf dem Objektträger aufliegt, um die Bakterien mit den Blättern auszubrüten. Geben Sie 300 Mikroliter Bakteriensuspension unter die Blattstücke auf dem Objektträger und achten Sie darauf, dass die Unterseite des Blattes mit dem Inokulum in Kontakt kommt.

Inkubieren Sie die Proben unter den gleichen Umgebungsbedingungen, die für den Anbau der Pflanzen verwendet wurden. Wenn es an der Zeit ist, die Blätter unter dem Mikroskop zu betrachten, übertragen Sie die Blattstücke mit der Unterseite nach oben auf einen neuen Objektträger. Beachten Sie, dass bei der Montage der Schienen kein Deckglas verwendet wird.

Dieselbe Blattprobe kann während der Inkubation mehrmals abgebildet werden, und es kann ein Zeitverlauf entsprechend den Forschungszielen eingerichtet werden. Hier wird ein konfokales Laserscanning-Mikroskop verwendet, um die Blätter zu untersuchen, die Unterseite der Blätter zu beobachten, um die Fluoreszenz von PI anhand derselben Blattproben zu erkennen, und Bilder des Stomas im Laufe der Zeit aufzunehmen. Speichern Sie die Bilder, um die Breite der Stomataöffnung zu messen.

Messen Sie die Öffnungsbreite der Stomata von mindestens 60 Stoma für jede Behandlung zu jedem Zeitpunkt. Berechnen Sie mit dem LSM-Bildbrowser den durchschnittlichen und den Standardfehler für die Öffnungsbreite der Spaltöffnung. Die statistische Signifikanz der Ergebnisse kann mit Hilfe von two-tailed Paired Wise Students berechnet werden.

Der T-Test ist hier eine typische mikroskopische Aufnahme einer Arabidopsis-Blattoberfläche unter einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop. In der Hellfeldansicht färbt Propidiumiodid die Zellwand lebensfähiger Zellen, wodurch die Sichtbarkeit von Schließzellen erhöht und die Identifizierung ungeschädigter Zellen ermöglicht wird. In diesen Mikroskopaufnahmen ist eine Reihe von stomatalen PO-Öffnungen zu sehen, vom vollständig geschlossenen Stoma bis zum weit geöffneten Stoma.

Vollständig verschlossene Stoma sind an der Form der Schließzellen zu erkennen. Die Öffnungsbreite wird bei offenem Stoma als null Mikrometer angesehen. Die angegebene Öffnungsbreite wird mit einer geraden Linie gemessen, die über den breitesten Bereich der Stomapore gezogen wird.

Dies sind typische experimentelle Ergebnisse des Lebendblatt-Inokulationsassays. Arabidopsis-Blätter wurden im Dunkeln mit drei verschiedenen Stämmen von Pseudomonas Cy Ringe inkubiert, nur das Bakterium P-S-T-D-C 3000 war in der Lage, dunkle Clo-Stoma zu öffnen, gemessen an der Öffnungsweite von 60 zufällig ausgewählten Stoma pro Bakterienstamm. Diese Technik hat Forschern auf dem Gebiet der geplanten Bakterieninteraktionen den Weg geebnet, die Mechanismen der frühen Reaktion auf Krankheitserreger bei Pflanzenarten zu erforschen.