Die Schätzung Virus Produktionsraten in aquatischen Systemen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Rate zu bestimmen, mit der Viren in aquatischen mikrobiellen Gemeinschaften produziert werden. Dies wird erreicht, indem zunächst die Häufigkeit freier Viren in der Probe von Interesse verringert wird, während die native mikrobielle Gemeinschaft erhalten bleibt. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, Proben unter stimuliierenden Bedingungen zu inkubieren und alle zwei bis drei Stunden bis zu 10 Stunden lang Teilproben zu entnehmen.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Viren in den gesammelten Teilproben jedes Zeitpunkts zu zählen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Bestimmung der Rate, mit der die Anzahl der Viruspartikel in der Probe angestiegen ist, sowie die Ermittlung der Virusproduktionsraten. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Raten zeigen, mit denen Viren innerhalb der mikrobiellen Gemeinschaft produziert werden, basierend auf den Zählungen, wodurch Forscher Rückschlüsse auf die Raten der mikrobiellen Mortalität aufgrund virusbedingter Aktivität ziehen können.

Hallo zusammen. Mein Name ist Audrey Madison, und ich arbeite im Labor von Dr. Steven Milham und der Abteilung für Mikrobiologie an der University of Tennessee. Heute werden wir mit Hilfe von Charles Budoff und Claire Campbell eine Methode zur Analyse der Raten vorstellen, mit denen Viren in aquatischen Systemen produziert werden.

Dazu verringern wir die Anzahl freier Viren in Proben und ermitteln die Rate, mit der sie durch die Lyse virusinfizierter Mikroorganismen erneut auftreten. Wir verwenden dieses Verfahren derzeit in unserem Labor, um die Ökologie von Viren und deren Einfluss auf mikrobielle Gemeinschaften zu untersuchen. Nachdem wir nun die Einführung abgeschlossen haben, können wir nun fortfahren und beginnen.

Bevor dieses Verfahren beginnen kann, sammeln Sie etwa 20 Liter Meerwasser so aseptisch wie möglich. Sobald die Probe gesammelt ist, filtrieren Sie das Wasser zunächst durch einen 0,8-Mikron-Filter mit einem Durchmesser von 142 Millimetern. Bei biologisch produktiven Systemen kann man dies vorab durch eine Filtration durch einen Filter mit größerer Porenweite oder durch einen Glasfaservorfilter ersetzen.

Um ultrafiltriertes Wasser zu erhalten, richten Sie ein Ultrafiltrationssystem wie das AmCon M 12-System mit einer spiralförmig gewickelten Membrankassette ein, um alle Viren auszuschließen. Die Viren in der Probe werden anschließend bei etwa 25 % der maximalen Drehzahl bei einem Gegendruck von 15 bis 16 Kilopascal entfernt und angereichert. Das Filtrat, etwa 500 Milliliter, enthält die nun angereicherte Virusgemeinschaft, die für andere Untersuchungen aufbewahrt werden kann, während das virusfreie Permeat für Virusvermehrungsassays verwendet wird.

Nach jedem Nutzungstag das Omicron M 12-System reinigen, um Schäden an der Membran der Filterpatrone zu vermeiden. Bei Arbeiten mit Meerwasser die Membran mit mindestens sechs Litern Milli-Q-Wasser spülen, gefolgt von einer Reinigung mit 0,1-molarer Natriumhydroxidlösung für 30 bis 45 Minuten. Anschließend die Patrone mit mindestens sechs weiteren Litern Milli-Q-Wasser spülen.

Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, kann die Spiralpatrone in einer 0,05-molaren Phosphorsäurelösung bei vier Grad Celsius gelagert werden. Um die Virusreduktionsmethode zu beginnen, werden 500 Milliliter Meerwasserprobe von derselben Stelle, an der auch das virusfreie Wasser hergestellt wurde, in eine Sterilfiltereinheit mit einem Filter mit einer nominalen Porengröße von 0,2 Mikrometern und geringer Proteinbindung gegeben. An diesem Punkt sollte außerdem eine Teilprobe entnommen werden, um die Gesamtabundanz von Viren und Bakterien im Ausgangswasser zu bestimmen.

Drücken Sie vorsichtig unter Vakuum auf die Probe mit weniger als 200 Millimeter Quecksilber, während Sie die Probe kontinuierlich durch erneutes Aufpipettieren mit einer sterilen Transferpipette resuspendieren, um zu verhindern, dass sich Bakterienzellen auf dem Filter anreichern. Fügen Sie langsam drei Volumina von jeweils 500 Milliliter Ultrafiltrat zur Bakteriensuspension hinzu, um die Häufigkeit freier Viren in der Probe zu verringern, während die Bakterienpopulationen konstant dicht gehalten werden. Verdünnen Sie schließlich den bakteriellen Anteil mit virusfreiem, ultrafiltriertem Wasser wieder auf 500 Milliliter. Teilen Sie die Probe danach in drei Aliquote zu je 150 Milliliter auf und geben Sie diese in klare 250-Milliliter-Polycarbonatflaschen.

Dies stellt Ihre Zeit-Null-Stichprobengruppe dar. Entnehmen Sie Proben zur Bestimmung der bakteriellen und viralen Abundanz aus Ihren Zeit-Null-Proben. Überführen Sie die Proben in Kryoröhrchen mit einer Endkonzentration von 2,0 bis 2,5 % sterilisierter Glutaraldehyd.

Als Fixierungsmittel sofortige Schockgefrierung dieser Proben mit flüssigem Stickstoff durchführen und bei minus 80 Grad Celsius lagern, bis sie verarbeitet werden. Alternativ kann ein Tangentialfluss-System verwendet werden, um marine Mikroben anzureichern. Um die TFF-Methode anzuwenden, etwa 500 Milliliter der natürlichen Probe gewinnen.

Konzentrieren Sie diese Probe mithilfe eines Tangentialfluss-Filtrationssystems mit einer nominellen Porengröße von 0,2 Mikrometern, bis die bakterielle Fraktion auf etwa 10 bis 15 Milliliter mit ultrafiltriertem, virusfreiem Wasser reduziert ist, wie unter der Methode zur Virusreduktion beschrieben, und inkubieren Sie die resultierenden Replikatflaschen unter angeregten Bedingungen. Mithilfe von Umweltkammern auf See verwenden wir Durchfluss-See­wasser-Inkubatoren, die an eine Oberflächenwasserzufuhr angeschlossen sind und die Umgebungstemperaturen aufrechterhalten. Lichtintensitäten können durch Verwendung von blau getöntem Acryl oder einem Neutraldichteschutznetz an die Oberflächenbedingungen angepasst werden, um die Lichtintensität zu verringern.

Wenn man von einer Außenstelle oder einem Labor aus arbeitet oder wenn Meerwasser nicht verfügbar ist, kann ein beleuchteter Wachstumsinkubator verwendet werden. Setzen Sie die Entnahme von Teilproben alle 2,5 Stunden über einen Zeitraum von mindestens 10 Stunden fort, und zwar nach der für die Probe zum Zeitpunkt null angewendeten Methode. Zusätzlich zu den Mikroskopieproben möchten einige Forscher Wasser für eine quantitative PCR-Analyse spezifischer Viren sammeln.

Für QPCR-Proben geben Sie fünf Milliliter der Probe in ein Kryoröhrchen ohne Fixiermittel und gefrieren Sie die Probe sofort in flüssigem Stickstoff ein, um die Vorbereitung für die Virusproduktionsmikroskopie vorzunehmen. Tauen Sie die gefrorenen Proben auf Eis auf und bereiten Sie frische Lösungen gemäß dem schriftlichen Protokoll vor. Anschließend setzen Sie eine 25-Millimeter-Filtermembran mit einer Porengröße von 0,02 Mikron auf einen zellulosischen Trägerfilter mit einer Porengröße von 0,45 Mikron. Danach geben Sie 850 Mikroliter der fixierten Probe auf die Oberseite des Anadi-Filters und filtrieren unter Vakuum bei weniger als 20 Kilopascal, bis der Filter vollständig trocken ist.

Sobald der Ano-Scheibenfilter trocken ist, pipettieren Sie 100 Mikroliter Cyber-Green-Arbeitslösung in eine sterile Petrischale. Entfernen Sie unter weiterhin bestehendem Vakuum vorsichtig die Ano-Scheibe aus dem Filterturm und legen Sie sie auf die Cyber-Green-Lösung. Inkubieren Sie die Proben 20 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.

Entfernen Sie vorsichtig den Filter aus der Cyber-Green-Lösung und tupfen Sie die Rückseite des Filters mit einem Kim-Tuch ab, um sämtlichen restlichen Farbstoff zu entfernen. Geben Sie anschließend einen kleinen Tropfen Antifa-Lösung auf einen Objektträger und legen Sie ein Deckglas darauf. Nehmen Sie das Deckglas ab und geben Sie den getrockneten Filter auf den Objektträger.

Geben Sie erneut eine kleine Menge Antifa-Lösung auf die Deckglasabdeckung und platzieren Sie diese langsam auf dem Filter, wobei sichergestellt werden muss, dass alle eventuell entstehenden Blasen entfernt werden. Zählen Sie Viren mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie mit einem breiten blauen Filter; erfassen Sie mindestens 20 Einzelbilder pro Filter und stellen Sie sicher, dass die Gesamtanzahl der Viren aus jedem Feld des Rasters quantifiziert wird, um eine gleichmäßige Verteilung der Viren über die Filtermembran zu gewährleisten. Berechnen Sie die gemittelten Werte der Virusrekurrenz aus den drei unabhängigen Replikaten und ermitteln Sie die Standardabweichung der Produktionsraten. Korrigieren Sie abschließend diese Raten hinsichtlich der Verdünnung der Mikroorganismen von der Ausgangsabundanz auf die verdünnte Abundanz in der virusreduzierten Probe.

Der primäre Datensatz, der aus dieser Studie resultiert, sind die Wiederkehrfrequenzen der Virusanzahl in den Teilproben aus den Inkubationen. Diese Ergebnisse bilden unabhängige Regressionen der Virusanzahl über die Zeit für jede der Proben. Die Produktion virusähnlicher Partikel wurde über eine 10-stündige Inkubation unter durchsichtigen Bedingungen mittels Epifluoreszenzmikroskopie überwacht.

Diese Proben wurden während einer Phytoplanktonblüte vor der Küste Neuseelands im September 2008 gesammelt. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Virusproduktionsraten schätzt. Dies beinhaltet die Verwendung verschiedener Ultrafiltrationssysteme und die Durchführung von Experimenten zur Messung der Virusproduktionsraten.

Außerdem haben wir Ihnen gezeigt, wie man diese Viren mittels Epifluoreszenzmikroskopie zählt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, saubere Geräte zu verwenden, die angefärbten Viren sorgfältig zu handhaben, die Lichteinwirkung zu minimieren, die Proben zügig zu verarbeiten und die Ultrafiltrationskartuschen nach jedem Gebrauch ordnungsgemäß zu reinigen. Das war’s also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.