Spezielle Kennzeichnung von HIV-1 positiven Zellen mit Hilfe eines Rev-abhängigen Lentivirale Vector mit dem Ausdruck des Green Fluorescent Protein
23. September 2010
Wir haben einen lentiviralen Vektor, besitzt neben dem Tat-responsive LTR entwickelt, das Rev-Response-Element (RRE), dass die Expression des Reportergens in einer HIV-1 Tat-und Rev-abhängigen Weise regulieren können. Der Vektor erlaubt den spezifischen Nachweis von HIV Replikation in lebenden Zellen über die Expression von GFP.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, HIV-positive Zellen mithilfe eines HIV-1-rev-abhängigen Lentiviralvektors nachzuweisen, der das grün fluoreszierende Protein trägt. Dies wird erreicht, indem zunächst durch Cotransfektion rev-abhängige Lentiviralpartikel hergestellt werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, humane CD4-T-Zellen mit HIV-1 zu infizieren.
Anschließend werden die HIV-positiven menschlichen CD4-T-Zellen mit Lentiviren, die das GFP-Gen tragen, superinfiziert. Im letzten Schritt erfolgt die Identifizierung der HIV-positiven Zellen durch Bestimmung der GFP-positiven Zellen mittels Durchflusszytometrie. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die den Prozentsatz der GFP-positiven Zellen mittels Durchflusszytometrie anzeigen.
Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Therapie einer HIV-Infektion, da der rev-abhängige Vektor ebenfalls therapeutische Gene in HIV-infizierten Zellen liefern und selektiv exprimieren kann, um die Abtötung HIV-positiver Zellen auszulösen. Die Demonstration des Verfahrens wird gi, eine wissenschaftliche Assistentin unseres Labors, durchführen. Um rev-abhängige lentivirale Partikel herzustellen, werden HEK 293T-Zellen mit drei Plasmiden transfiziert: dem rev-abhängigen GFP-lentiviralen Vektor, dem HIV-1-Packkonstrukt und einem Plasmid, das das VSV-G-Glykoprotein trägt. Einen Tag vor der Plasmidtransfektion werden zwei mal 10 hoch sechs HEK 293T-Zellen in 10 Milliliter Medium ausgesät.
In einer 100 Millimeter Petrischale. Kultivieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Ersetzen Sie am folgenden Tag das Überstandmedium der Zellen durch fünf Milliliter frisches Medium.
Kultivieren Sie die Zellen anschließend vier Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid weiter. Bereiten Sie die Transfektionsreagenzien vor dem Ende der vierstündigen Inkubation vor. Die HEK 293T-Zellen werden mit den drei Plasmiden im Verhältnis von 10 Mikrogramm rev-abhängigem GFP-Lentiviralvektor, 7,5 Mikrogramm HIV-1-Packkonstrukt und 2,5 Mikrogramm VSVG-Glykoprotein transfiziert.
Mischen Sie zunächst die drei Plasmid-DNAs im gewünschten Verhältnis vor. Bereiten Sie dann zwei Polystyrolröhrchen mit je fünf Milliliter Volumen vor. Geben Sie 480 Mikroliter zweifach konzentrierter HBS-Puffer in das erste Röhrchen und in das zweite Röhrchen.
Fügen Sie 60 Mikroliter zweimolares Calciumchlorid-Puffer zu den Plasmabestandteilen der DNA und dem Transfektionspuffer hinzu, um ein Gesamtvolumen von 480 Mikrolitern zu erreichen. Anschließend geben Sie die Plasmabestandteile-DNA-Calciumchlorid-Mischung tropfenweise in das zweifache HPS-Röhrchen und inkubieren es 30 Minuten bei Raumtemperatur.
Es bildet sich allmählich ein feiner Niederschlag. Geben Sie nun alle 960 µL der Mischung tropfenweise mittels Pipette zu den HEK 2 9 3 T-Zellen. Inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid.
Am nächsten Tag das Überstand-Supernatant entfernen und 10 Milliliter frisches Medium hinzufügen. Die Zellen erneut über Nacht bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid inkubieren. 48 Stunden nach der Transfektion das Virus gewinnen, indem das Überstand-Supernatant entfernt und in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen überführt wird.
Geben Sie 10 Milliliter frisches Medium in die Petrischale und kultivieren Sie über Nacht weiter. Lagern Sie das Virus supinat bei vier Grad Celsius. Fahren Sie 72 Stunden nach der Transfektion mit der Gewinnung fort, indem Sie das SUP-Überstandsmaterial sammeln und mit dem zuvor gewonnenen sup-Überstandsmaterial kombinieren.
Anschließend wird das S-Supernatant bei 500 × g 15 Minuten lang zentrifugiert, um Zelltrümmer zu pelletieren und zu entfernen. Nach der Zentrifugation wird das S-Supernatant gesammelt und in ein neues Gefäß überführt. Danach wird das Supernatant durch einen 0,22 µm Millipore-Filter filtriert.
Das Virus wird anschließend mithilfe einer Größenausschluss-Säule weiter angereichert, was im Folgenden zur Konzentrierung der viralen Partikel gezeigt wird. Geben Sie das virale Überstandsgemisch in eine Größenausschluss-Säule und zentrifugieren Sie 15 Minuten lang bei 6.000 × g und vier Grad Celsius. Sammeln Sie den konzentrierten viralen Überstand und heben Sie etwa 100 Mikroliter zur Bestimmung der Virus-Titer beiseite.
Portionieren Sie den Rest und lagern Sie ihn bei minus 80 Grad Celsius. Die Bestimmung der Virus-Titer ist einer der kritischsten Aspekte dieses Verfahrens. Für eine Superinfektion von Zellen mit dem GFP-VIR-Vektor ist eine höhere Multiplizität der Infektion erforderlich.
Um einen Prozentsatz an GFP-positiven Zellen zu erhalten, der mittels Durchflusszytometrie detektiert werden kann, um die Virus-Titer zu bestimmen. Eine mit TNF behandelte HIV-V1-positive Jurkat-Zelllinie wird mit dem viralen Überstand infiziert. Diese HIV-V1-positiven Zellen werden kultiviert.
In einer 96-Well-Platte bei 2,5 × 10⁵ Zellen pro Milliliter in einem Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern. Bereiten Sie sechs serielle zehnfache Verdünnungen der rev-abhängigen Lentivirenpartikel zur Infektion der HIV-1-positiven Zellen vor und geben Sie jeweils 100 Mikroliter jeder seriellen Virusverdünnung in jedes Zell-Well. Inkubieren Sie sieben Tage lang in einem CO₂-Inkubator bei 37 °C.
Die Partikel-Titerung erfolgt durch Beobachtung von GFP-positiven Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop. Die Berechnungen werden nach der Methode von Reid und MU durchgeführt, und der Titer wird als der Verdünnungspunkt bestimmt, bei dem GFP-positive Vertiefungen entstehen. In 50 % der mit rev-abhängigen Lentiviren infizierten Vertiefungen bis Stufe IV finden sich positive Zellen.
Eine humane CD4-T-Zelllinie wird zunächst mit HIV-1 infiziert. Wir verwenden zwei mal 10 hoch fünf Zellen für jede Infektion. Zwei Stunden vor der Infektion.
Geben Sie Poly-Brain zu den Zellen, um eine Endkonzentration von vier Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden. Infizieren Sie anschließend die Zellen, indem Sie die HIV-Lösung in eines der Fünf-Milliliter-Röhrchen pipettieren.
Die anderen beiden Röhrchen mit Zellen werden nicht infiziert und dienen als Kontrollen. Inkubieren Sie alle Zellen bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden. Nach zwei Stunden zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 × g für 10 Minuten, entfernen das virusfreie Überstandsmaterial durch Verwerfen des Überstandes und resuspendieren die Zellen in frischem Medium bei einer Konzentration von 2 × 10⁵ Zellen pro Milliliter Kultur bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden.
Nach 48 Stunden sind die mit HIV infizierten Zellen bereit für die Infektion. Verwenden Sie für die infektiösen, rev-abhängigen Lentiviren zwei mal zehn hoch fünf Zellen, die mit 100 Mikroliter Lentiviruspartikeln infiziert werden, um die mit HIV V1 infizierten Zellen als Kontrolle zu erhalten. Zusätzlich werden nicht infizierte humane CD4-T-Zellen mit 100 Mikroliter Lentiviruspartikeln infiziert. Inkubieren Sie die Zellen am folgenden Tag über Nacht bei 37 Grad Celsius.
Ersetzen Sie das verbrauchte Medium durch frisches Medium und resuspendieren Sie die Zellen in einer Konzentration von zwei mal 10 hoch fünf Zellen pro Milliliter. 48 Stunden nach der Infektion pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren sie anschließend in 500 Mikrolitern 1 % Paraformaldehyd. Überführen Sie die resuspendierten Zellen in ein Durchflusszytometrie-Röhrchen zur Analyse per Durchflusszytometrie. Nach einer 20-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur können die Zellen auf einem FACS-Scan-Analysator auf GFP-Positivität untersucht werden.
Wenn die Experimente erfolgreich durchgeführt werden, ermöglicht der rev-abhängige lentivirale Vektor V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A den hochspezifischen Nachweis replizierenden HIV in lebenden Zellpopulationen durch Messung der Expression des grün fluoreszierenden Proteins GFP. In diesem Beispiel wurden geerntete C-E-M-S-S-Zellen mit einem mit PE markierten monoklonalen Rattenantikörper gegen murines CD 24 HSA gefärbt und anschließend mittels Durchflusszytometrie sowohl auf HSA- als auch auf GFP-Expression analysiert, wie hier gezeigt. Eine beträchtliche GFP-positive Population wurde in mit HIV-1 infizierten Zellen nach Superinfektion mit V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A detektiert.
Dagegen wurden GFP-positive Zellen weder in HIV-V-1-ungeinfizierten C-E-M-S-S-Zellen ohne lentivirale Superinfektion noch in HIV-1-ungeinfizierten Zellen mit lentiviraler Superinfektion nachgewiesen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit HIV äußerst gefährlich sein kann, und beachten Sie stets entsprechende Vorsichtsmaßnahmen wie Biosicherheitsstufen gemäß den gängigen Praktiken, während Sie dieses Verfahren durchführen.
Übersicht
Diese Studie stellt einen neuartigen lentiviralen Vektor vor, der darauf ausgelegt ist, HIV-positive Zellen durch die Expression von GFP in einer HIV-1-Tat- und Rev-abhängigen Weise nachzuweisen. Die Methode ermöglicht die Identifizierung replizierenden HIVs in lebenden Zellen, was bedeutende Implikationen für therapeutische Anwendungen hat.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Virologie
- Gen-Therapie
Hintergrund
- Die HIV-Infektion bleibt ein weltweites Gesundheitsproblem von großer Bedeutung.
- Die derzeitigen Methoden zum Nachweis HIV-positiver Zellen sind begrenzt.
- Lentivirale Vektoren können für eine spezifische Genexpression konstruiert werden.
- Das Rev-Antwort-Element (RRE) erhöht die Spezifität des Nachweises.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines lentiviralen Vektors zur Detektion von HIV-positiven Zellen.
- Nutzung der GFP-Expression als Marker zur Identifizierung infizierter Zellen.
- Untersuchung der therapeutischen Implikationen des Vektors in der HIV-Behandlung.
Verwendete Methoden
- Kotransfektion von HEK 293T-Zellen zur Herstellung lentiviraler Partikel.
- Infektion menschlicher CD4-T-Zellen mit HIV-1, gefolgt von einer Superinfektion mit dem lentiviralen Vektor.
- Durchflusszytometrie zur Messung von GFP-positiven Zellen.
- Bestimmung der viralen Titer durch serielle Verdünnungen und Beobachtung von GFP.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Produktion von Rev-abhängigen lentiviralen Partikeln.
- Identifizierung von HIV-positiven Zellen mittels GFP-Expression.
- Die Durchflusszytometrie-Ergebnisse zeigten einen quantifizierbaren Prozentsatz infizierter Zellen.
- Der Vektor zeigte ein Potenzial für die Abgabe therapeutischer Gene.
Schlussfolgerungen
- Der entwickelte lentivirale Vektor ist wirksam zur Detektion HIV-positiver Zellen.
- Diese Methode könnte therapeutische Strategien bei HIV-Infektion verbessern.
- Zukünftige Studien könnten sich auf die Optimierung des Vektors für Anwendungen in der Gentherapie konzentrieren.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht den hochspezifischen Nachweis replizierenden HIV in lebenden Zellpopulationen und löst damit eine zentrale Herausforderung bei der Validierung antiviraler Zielstrukturen, bei der unspezifische Reporteraktivität die mechanistische Interpretation erschwert. Durch die Kopplung der GFP-Expression an sowohl Tat- als auch Rev-Abhängigkeiten verringert der Vektor falsch-positive Signale aufgrund zellulärer Aktivierungszustände und verbessert so die Vorhersagesicherheit bei der frühen Therapeutikascreening-Phase gegen HIV. Der Ansatz unterstützt die mechanistische Ent风险bewertung, indem er einen quantifizierbaren, fluoreszenzbasierten Endpunkt zur Beurteilung der Wirkstoffeffekte auf den viralen Replikationszyklus bereitstellt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung HIV-spezifischer transkriptioneller und posttranskriptioneller Regulation durch dualen, von Tat und Rev abhängigen Reporterausdruck.
- Operationaler Wert: Verringert Hintergrundrauschen von allein durch das LTR angetriebenen Vektoren und erhöht so die Assayspezifität für Zielvalidierungskampagnen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Priorisierung von Substanzen, die den Rev-abhängigen Export oder die späte virale Replikation stören.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet einen quantitativen, mit der Durchflusszytometrie kompatiblen Endpunkt zur Messung von GFP-positiven Zellen als Indikator für replizierendes HIV.
- Operativer Wert: Ermöglicht standardisierte und reproduzierbare Infektions- und Superinfektionsabläufe in CD4+-T-Zell-Modellen.
- Skalierbarkeit: Die Bestimmung der Virus-Titer mittels serieller Verdünnung unterstützt die Normalisierung des Assays über verschiedene Screening-Platten hinweg.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verknüpft den frühen Nachweis HIV-positiver Zellen mit der nachgeschalteten therapeutischen Genabgabe im selben Vektorsystem.
- Mechanistische Entlastung: Ermöglicht die Beurteilung, ob Kandidatenverbindungen das GFP-Signal durch Hemmung der Replikation und nicht durch Zytotoxizität reduzieren.
- Krankheitsrelevante Systematik: Verwendet superinfizierte humane CD4+-T-Zellen, um physiologisch relevante Kontexte der HIV-Replikation abzubilden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur Lead-Identifizierung ein, wobei der spezifische Nachweis von replizierendem Virus Wirkmechanismus-Studien unterstützt und Go/No-Go-Entscheidungen auf Grundlage der Reduktion des GFP-Signals ermöglicht.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von HIV-Wirtsfaktor-Interaktionen und viraler Genfunktion durch regulierte Reporterexpression.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft des Assays durch quantifizierbare GFP-Expression, die mittels Durchflusszytometrie nach Superinfektion nachweisbar ist.
- Analytik: Erzeugt prozentuale GFP-positive Messwerte, die Vergleiche zwischen Behandlungsbedingungen und viralen Titern ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet Nachweismöglichkeiten mit therapeutischem Potenzial durch die Verabreichung von Effektorgenen im selben Vektor.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Die Plattform kann für andere RNA-Viren angepasst werden, indem regulatorische Elemente ausgetauscht werden, während das Design mit doppelter Abhängigkeit beibehalten wird.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vertrauen in die Zielvalidierung, indem echte HIV-abhängige Signale von zellulären Aktivierungsartefakten unterschieden werden.
- Operativer Wert: Standardisiert den Nachweisablauf unter Verwendung der lentiviralen Produktion, Titration und Durchflusszytometrie-Analyse.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem falsch-positive Kandidaten in antiviralen Screening-Stufen reduziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung basierend auf einer messbaren Verringerung des replizierenden Virussignals.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Herstellung von lentiviralen Vektoren, HIV-Biosicherheitsprotokollen und der Bedienung der Durchflusszytometrie.
- Hängt von dem Zugang zu HEK 293T-Zellen für die virale Verpackung und menschlichen CD4+-T-Zell-Modellen für die Infektion ab.
- Erfordert die Standardisierung des Zeitpunkts der Superinfektion sowie der Quantifizierung der Virus-Titer über verschiedene Labore hinweg.
- Die Anpassung an Primärzellen oder alternative Modelle könnte eine Optimierung der Infektionsrate und Promotoraktivität erfordern.
- Praktische Einschränkung: Das Signal hängt von der aktiven Expression von Rev ab, wodurch latente oder frühe postintegrale Stadien möglicherweise nicht erfasst werden.
