Name: Herstellung von hoch Coupled Rat-Mitochondrien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-23T17:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung hoch gekoppelter Rattenherz-Mitochondrien durch mechanische und enzymatische Gewebeverarbeitung sowie differentielle Zentrifugation. Diese Methode liefert 10–15 mg mitochondriales Protein pro Herz für zelluläre Bioenergetik-Studien.

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Wir danken Prof. A. Vinogradov und Dr. Vera Grivennikova für die Einführung der Autoren auf dem Gebiet der mitochondrialen Biologie und viele nützliche Einsichten und Ratschläge in diesem Verfahren. Die Autoren bedanken sich bei Frau Amanda McKintock von der Queens University Medien Büro für die Hilfe bei der Video-Vorbereitung.

Einführung Mitochondrien aus Ratten-Herz ist eine der häufigsten Vorbereitungen für vergangene und aktuelle Studien des Zellstoffwechsels. Sie können schnell und zuverlässig in großen Mengen gewonnen werden aus Wildtyp-oder Knock-out-Tiere. Das allgemeine Verfahren besteht aus Gewebe durch Trypsin, Fraktionierung und differentielle Zentrifugation. Es gibt verschiedene Bedingungen, die bei der Isolierung von Mitochondrien aus verschiedenen Geweben gehalten werden, einschließlich des Herzens (Abb. 1). <ul><li> Das Gewebe muss gründlich zerkleinert werden, da sie direkten Einfluss auf die Ausbeute der erhaltenen Mitochondrien. Herzgewebe ist am besten mit kleinen gebogenen Schere Hackfleisch und kann durch einen Latapie Gewebe Mühle verfolgt werden oder, wenn ein Gewebe Mahlwerk nicht verfügbar ist, eine Knoblauchpresse mit Austrittslöchern Durchmesser von etwa 1,0 mm Durchmesser. </li><li> Es ist notwendig, um die Temperatur der Lösungen bei jedem Schritt zu halten. Deshalb ist die gesamte Verfahren muss in einem kalten Raum und alle Instrumente durchgeführt werden und Lösungen bereit und gekühlt werden im Voraus. Wenn die Temperaturen nicht stabil gehalten werden mehrere Eigenschaften der Zubereitung verloren gehen kann. Mitochondriale Struktur ist sehr frostempfindlich so overfreezing der Suspension (zum Beispiel während der Zentrifugation) ist nicht zulässig, vor allem, wenn das Studium der aktiven Transport wichtig sind. </li><li> Ein wichtiger Parameter ist die Zeit-Dauer des Verfahrens, die Trennung sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden und das erhaltene Präparat muss sofort verwendet werden. Deshalb haben chirurgische Instrumente, Lösungen und Appliances im Voraus vorbereitet werden. </li></ul> Materialien und Instrumente Instruments <ol><li> Gerade Betriebssystem Schere, scharfe Spitze </li><li> Gebogene Schere </li><li> Zange </li><li> Petrischale </li><li> Kleine Trichter + Stück Nylon-Filter (vorgewaschen) </li><li> 6 Bechergläser 50 ml </li><li> Zwei Magnetrührer und zwei Eisbäder </li><li> Ein großer Eisbad </li><li> 2 kleine magnetische Stäbe </li><li> Spatel für Pellet Schaben </li><li> Zentrifugenröhrchen </li><li> Latapie Gewebe drücken (mit Knoblauchpresse ersetzt werden) </li><li> Teflon-Glas-Homogenisatoren 20ml und 1-2ml </li><li> Waste Becher </li><li> Eppendorf-Röhrchen für die endgültige mitochondrialen Federung und Proben für die Proteinbestimmung </li><li> Ice Bäder </li></ol> Solutions (berechnet pro 2 Ratten): <ol><li> Waschpuffer: 0,3 M Sucrose, 10 mM HEPES (pH = 7,2), 0,2 mM EDTA (1000 ml) </li><li> Isolation Puffer: 0,3 M Sucrose, 10 mM HEPES (pH = 7,4), 0,2 mM EDTA, 1 mg / ml BSA (Sigma a6003) (100ml hergestellt aus den Waschpuffer). Rinderserumalbumin durch weniger teure Fettsäure-freien Analoga ersetzt werden. Die gleichen Puffer oder seine isotonische Varianten können als Resuspendieren Puffer verwendet werden. </li><li> Trypsin (Sigma T8003) Lösung: 2.5mg/ml in 1mM HCl (0,5 ml) </li><li> Trypsin-Inhibitor aus Sojabohnen (Sigma T9128) 6,5 mg/10 ml Isolation Puffer </li></ol> Protokoll Das allgemeine Schema des Verfahrens ist in Abb. dargestellt. 1. Herz sollte gekühlt und gewaschen werden in Waschpuffer, ventrikuläre Gewebe herausgeschnitten, zerkleinert und homogenisiert während photolytische Behandlung mit Trypsin. Die Suspension wird bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert und der erhaltene Überstand wird erneut mit einer höheren Geschwindigkeit zentrifugiert, um zu sammeln Mitochondrien. Abhängig von der geplanten Experimente der Resuspendieren Puffer kann von keinem anderen isotonischen Lösung ersetzt werden. Die Tiere wurden in Übereinstimmung mit den britischen beendet "Animals (Scientific Procedures) Act." durch Genickbruch durch Enthauptung folgten. Es ist notwendig, das Herz sofort nach der Enthauptung des Tieres zu extrahieren, so dass es keine Verzögerung zwischen Tier Kündigung und Herz-Extraktion. Wenn die parallele Isolierung von Mitochondrien wird erwartet, dass die Ratten sollte über Nacht vor dem Experiment gefastet werden. <ol><li> Drei Becher vorbereiten mit 40 ml Waschpuffer. Coole sie in das Eis-Salz-Bad für 3 bis 5 min, bevor Sie den nächsten Schritt. Achten Sie darauf, nicht zu ihnen overfreeze und sofort verwenden kurz nach Wolken aus Eiskristallen zu erscheinen beginnen. </li><li> Öffnen Sie den Brustkorb des enthaupteten Ratte und extrahieren Sie die Herzen. Machen Sie kleine Schnitte und dann sofort in die Herzen der eiskalten Lösung in den ersten Becher. Squeeze des Herzens, Blut zu entfernen und steckte es in das zweite Becherglas. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Herz. </li><li> Trocknen Sie die Herzen auf dem Filterpapier. Entfernen Sie alle Fett, geronnenes Blut, Ohrmuscheln und Faszien und Pool der ventrikulären Gewebe. </li><li> Mince der gepoolten Gewebe mit kleinen gebogenen Schere auf der Petrischale auf Eis für etwa 5 min bis die Größe der Partikel ist ca. 1-2 mm. </li><li> Legen Sie die zerkleinerten Gewebes in das Gewebe drücken und passes durch. Seien Sie sich bewusst, dass eine erhebliche Menge des Materials kann in der Presse bleiben so sammeln alle Herzgewebe von den Wänden und Boden der Presse. </li><li> Übertragung des Materials in das Becherglas mit 50 ml Waschpuffer und umrühren. Dann filtern Sie die Suspension durch einen Nylon-Filter. Waschen Sie die zerkleinerten Gewebes auf dem Filter 3 mal mit Waschpuffer und entsorgen das Filtrat. </li><li> Übertragen Sie die gewaschenen Gewebe in 20 ml Waschpuffer und legen Sie sie in das Eisbad auf den Magnetrührer. 0,5 ml Trypsin-Lösung unter ständigem Rühren und den Timer zu starten. Bereiten Sie eine andere Magnetrührer, Eisbad und einem zweiten 50-ml-Becher. </li><li> Am 4. Minute kurz homogenisieren die Aussetzung portionsweise mit einem kleinen locker montiert Glas-Teflon-Homogenisator (10-15ml) mit mehreren und Abschlagen der Suspension zu verteilen. Nach der Homogenisierung Transfer der Suspension in das zweite Becherglas. Wiederholen Sie den Vorgang am 9. Minute, so dass Sie die Homogenisierung der Suspension zweimal durchführen insgesamt. Nach 15 min Inkubation mit 10 ml isolieren Puffer mit Trypsin-Inhibitor und inkubieren für 1 min. </li><li> Filtern Sie die Suspension wieder durch einen Nylon-Filter, und speichern Sie das Filtrat. Sammeln Sie die Partikel-Fraktion auf einem Filter und homogenisieren für 1 min in 15-20 ml Waschpuffer links. </li><li> Kombinieren Sie das Homogenat mit dem Filtrat und Zentrifuge für 15 min bei 600g. </li><li> Sorgfältig Filter der resultierende Überstand in ein neues Zentrifugenröhrchen. Vermeiden Sie die Kontamination durch die Pellet-und Zentrifuge wieder für 15 min bei 8500G. </li><li> Nach Hochgeschwindigkeitszentrifugation den Überstand verwerfen und spülen Sie das Pellet 2-3 mal mit 1 ml des Puffers Verwerfen der flauschigen weißen Außenrand Schicht. Break up das Pellet mit dem Spatel, sondern um die roten Fleck der Erythrozyten an der Unterseite. Wenn die Blutzellen hat Loos, entfernen Sie die rote Bits aus der Suspension vor der Homogenisierung. </li><li> Das Pellet mit einem kleinen Homogenisator oder alternativ durch vorsichtiges Pipettieren. Die Suspension mit mehr Isolationbuffer und Zentrifuge wieder für 15 min bei 8500G. </li><li> Überstand verwerfen, das Pellet in Resuspendieren Buffer (einem isotonischen Puffer der Wahl) und Zentrifuge wieder. </li><li> Die resultierende braune Pellet enthält gewaschen intakten Mitochondrien. Das Pellet in einem sehr kleinen Volumen von isotonischen Puffer Ihrer Wahl. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2202/2202fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Schritt für Schritt Verfahren der Isolierung von Ratten-Herzen Mitochondrien. Top Teil, Stages 1-9: Gewebeaufschluss, Trypsin-Behandlung und Homogenisierung; Unterteil, Stufen 10-15: differentielle Zentrifugation.

<ol><li>Jacobus, W. E., Saks, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creatine+kinase+of+heart+mitochondria%3A+changes+in+its+kinetic+properties+induced+by+coupling+to+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Creatine kinase of heart mitochondria: changes in its kinetic properties induced by coupling to oxidative phosphorylation.</a> Arch. Biochem. Biophys. 219, 167-178 (1982).</li>
<li>Gostimskaya, I. S., Grivennikova, V. G., Zharova, T. V., Bakeeva, L. E., Vinogradov, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+assay+of+the+intramitochondrial+enzymes%3A+use+of+alamethicin+for+permeabilization+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">In situ assay of the intramitochondrial enzymes: use of alamethicin for permeabilization of mitochondria.</a> Anal. Biochem. 313, 46-52 (2003).</li>
</ol>

Detaillierte schnelle Protokoll zur Isolierung von intakten Mitochondrien mit einem hohen Grad der Kopplung beschrieben. Erhalten Vorbereitung für eine funktionale oder strukturelle Forschung über zelluläre Bioenergetik, Proteom-Studien oder Analysen der mitochondrialen DNA und Lipid-Gehalt verwendet werden. Biophysikalische Untersuchungen von aktiven Transport von Ionen und Stoffwechsel-Zwischenprodukte können auch durchgeführt werden. Es ist möglich, weitere Prozess der mitochondrialen Vorbereitung, um submitochondrialen Partikeln, äußere Membran oder Reinigung einzelnen Komponenten der oxidativen Phosphorylierung zu isolieren. Das beschriebene Verfahren ist eine Modifikation des Standard-Protokoll der Isolation von Jacobus und Saks 1. Die erwartete Rendite des präparierten Mitochondrien beträgt ca. 10-15 mg der mitochondrialen Protein pro Herzens und der Atmung kontrollieren Verhältnis auf Malat / Glutamat für diese Zubereitung variiert zwischen 8 bis 12 mit der staatlichen IV Atmung von rund 0,12 mmol O 2 xmin -1 XMG Protein -1 bei 23 ° C in das Medium mit 0,25 M Saccharose, 10 mM KCl, 0,2 mM EDTA, 5 mM Kaliumphosphat (pH 8,0) mit 150 uM ADP für die Einleitung Staat III Atmung (für die genauen experimentellen Bedingungen und Ergänzungen, siehe Lit. . 2). Besonderes Augenmerk sollte auf einige technische Details vor Beginn der Isolierung Verfahren gegeben werden. Es ist wichtig zu reinigen Polycarbonat oder Polypropylen-Zentrifugenröhrchen verwenden, also Röhren sollten gründlich mit einem sauberen Bürste und heißem Wasser, aber das Waschmittel sollte die Behandlung mit dem Minimum gehalten werden gewaschen werden. Außerdem ist es besser, alle notwendigen Glaswaren und Instrumente in den kalten Raum zu sammeln einen Tag vor der Isolation. Während der Isolation bei der Übertragung von Puffern aus Flaschen zu Bechern, sollte а besonderes Augenmerk auf die Tropfen Eiswasser in die Lösungen zu verhindern. Beim Umgang mit Geweben es sollte betont werden, dass Herz-Extraktion sollte so bald wie möglich, da selbst kurze Zeitverzögerung zwischen Enthauptung des Tieres und Kühlung des Gewebes würde in teilweise abgekoppelt Mitochondrien Ergebnis durchgeführt werden. Schnelle Kühlung und gründliches Waschen der entfernt Herz ist von wesentlicher Bedeutung, um Standard-Vorbereitung, frei von Hämoglobin und Erythrozyten NADase erhalten. Trypsin ist für Binde-Proteine ​​Abbau verwendet werden, um die Anfälligkeit des Gewebes auf Scherkraft Anstieg während der Homogenisierung. Längere Exposition des Gewebes Protease sollte vermieden werden, da es in den Mitochondrien von minderer Qualität führt werden. Nach High-Speed-Zentrifugationen den Wänden der Röhrchen sollten mit Seidenpapier abgewischt werden, um Ablagerungen von Fett Material an den Wänden angesammelt entfernen. Für die endgültige Resuspension ist es besser, ein geringes Volumen des fertigen Puffer zu nutzen, um Verluste zu minimieren der mitochondrialen Funktionen während der Lagerung (150 bis 200 ul des Puffers pro Herz). Für Untersuchungen der Transport von zweiwertigen Kationen keine Chelatbildner vorhanden sein muss in den letzten Vorbereitungen so Mitochondrien sollte mehrmals mit EGTA-freiem Medium gewaschen und verwendet werden, innerhalb der ersten Stunden nach der Trennung.

herstellung von hoch coupled rat-mitochondrien

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

Die Funktion der Mitochondrien bei der Erzeugung von zellulären ATP in den Prozess der oxidativen Phosphorylierung wird allgemein anerkannt. In den vergangenen Jahrzehnten gab es bedeutende Fortschritte in unserem Verständnis der Funktionen der Mitochondrien anderes als die Erzeugung von Energie worden. Dazu gehören ihre Rolle bei der Apoptose, als Signalisierung Organellen, Säugetieren und des Alterns sowie deren Beitrag zur Koordination zwischen den Zellstoffwechsel und die Zellproliferation. Unser Verständnis von biologischen Prozessen moduliert durch Mitochondrien ist auf robuste Methoden zur Isolierung und Behandlung von intakten Mitochondrien aus dem Gewebe der Versuchstiere auf. Mitochondrien aus Ratten-Herz ist eine der häufigsten Vorbereitungen für vergangene und aktuelle Studien des Zellstoffwechsels, einschließlich Studien zur Knock-out-Tiere. Hier beschreiben wir eine detaillierte schnelle Methode zur Isolierung von intakten Mitochondrien mit einem hohen Grad der Kopplung. Eine solche Vorbereitung von Ratten-Mitochondrien ist ein hervorragendes Objekt für funktionelle und strukturelle Forschung über zelluläre Bioenergetik, Transport von Biomolekülen, Proteom-Studien und Analysen der mitochondrialen DNA, Proteine ​​und Lipide.

Wir beschreiben а Protokoll für die Isolierung von reinen, stark gekoppelte Ratte-Mitochondrien für funktionelle oder strukturelle Untersuchungen der zellulären Bioenergetik, biophysikalische Messungen, Proteomik oder mitochondriale DNA und Lipiden Analyse.

Herstellung von hoch Coupled Rat-Mitochondrien

Die Funktion der Mitochondrien bei der Erzeugung von zellulärem ATP im Prozess der oxidativen Phosphorylierung ist weithin anerkannt. In den letzten Jahrzehnten gab es ...

Ich bin Dr. Ska. Heute zeige ich Ihnen, wie man Mitochondrien aus rotem Herzmuskelgewebe isoliert. Die entscheidenden Schritte bei der Isolierung von Mitochondrien aus Geweben sind zunächst die Zerstörung des Gewebes und der Zellen durch mechanische oder enzymatische Behandlung.Zweitens Differentialzentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, um Ablagerungen sowie gebrochene Zellen und Zellkerne zu entfernen. Und drittens Zentrifugation bei höherer Geschwindigkeit, um die Mitochondrien zu pelletieren. Die Geräte und Lösungen wurden im Voraus vorbereitet und in der Kühlkammer gelagert.Bei der Isolierung müssen mehrere Bedingungen eingehalten werden. Erstens eine gründliche Gewebezerstörung, da dies die Ausbeute an Mitochondrien direkt beeinflusst. Zweitens muss während aller Schritte eine niedrige Temperatur aufrechterhalten werden, wobei jedoch darauf geachtet werden muss, dass die Lösungen nicht zu stark einfrieren, insbesondere während der Zentrifugation.Drittens gilt: Je schneller Sie arbeiten, desto besser ist die Qualität der gewonnenen Mitochondrien. Die Tiere wurden gemäß dem britischen Gesetz über tierversuchstechnische Verfahren getötet, und alle nachfolgenden Arbeitsschritte wurden im Kühlschrank durchgeführt. Bereiten Sie drei Becher mit jeweils 40 mil Waschpuffer vor.Kühlen Sie dies in einem Eisbad für drei bis fünf Minuten, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Achten Sie darauf, dass die Probe nicht zu stark einfriert, und verwenden Sie sie unmittelbar danach, sobald sich Wolken aus Eiskristallen bilden. Öffnen Sie rasch den Thorax der abgetrennten Rote und entnehmen Sie das Herz. Führen Sie kleine Einschnitte durch und überführen Sie das Herz anschließend sofort in die eiskalte Lösung.In dem ersten Becher das Herz zusammendrücken, um das Blut zu entfernen, und es in den zweiten Becher geben. Diesen Vorgang für jedes Herz wiederholen. Ein schnelles Abkühlen und Waschen der entnommenen Herzen ist entscheidend, um eine standardisierte Präparation zu erhalten, die frei von Hämoglobin, Erythrozyten und adas ist.Trocknen Sie die Herzen auf dem Filterpapier ab. Entfernen Sie gesamtes Fett, geronnenes Blut sowie die Arterie. Ziehen Sie dann das ventrikuläre Gewebe heraus.Dann bedeutet das, das Gewebe mit kleinen gebogenen Scheren auf der Petrischale zu ziehen. Legen Sie das MIT-Gewebe fünf Minuten lang in das Gewebe, drücken Sie es fest und führen Sie es hindurch. Überführen Sie nach dem Gewebepressen das Material in den Becher mit 50 ml Waschpuffer und rühren Sie um.Danach die Suspension durch einen Insel-Filter filtrieren. Das Gewebe auf dem Filter dreimal mit dem Waschpuffer waschen und den Filter entsorgen. Das gewaschene Gewebe in 20 ml Waschpuffer überführen und in das Eisbad auf dem magnetischen Außengerät stellen.Geben Sie die Tripssolution unter ständigem Rühren hinzu und starten Sie die Stoppuhr in der vierten Minute der Inkubation. Homogenisieren Sie die Suspension portionenweise kurz und nach und nach mit einem kleinen, locker sitzenden Glas-Teflon-Homogenisator. Überführen Sie die Suspension nach der Homogenisierung in ein anderes Becherglas auf einem zweiten Rührer.Wiederholen Sie den Vorgang in der neunten Minute, sodass Sie die Homogenisierung insgesamt zweimal nach der zweiten Homogenisierung durchführen. Fügen Sie in der 15. Minute der Inkubation 10 ml Puffer zur Isolierung, der Trypsininhibitor enthält, hinzu und inkubieren Sie weitere eine Minute. Filtern Sie die Suspension erneut durch einen Nylonsieb. Behalten Sie in diesem Fall jedoch das Filtrat, überführen Sie den restlichen Gewebeteil in den Homogenisator und homogenisieren Sie erneut.Verbinden Sie das Homogenat weitere eine Minute mit dem Filtrat im Zentrifugenröhrchen. Stellen Sie sicher, dass die Röhrchen gleichmäßig ausbalanciert sind, und führen Sie eine Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit für 15 Minuten durch. Filtern Sie das resultierende Überstand vorsichtig bei 600 G in ein neues Zentrifugenröhrchen.Vermeiden Sie eine Kontamination durch das Pellet und zentrifugieren Sie erneut 15 Minuten bei 8.500 ×g. Nach der Hochgeschwindigkeitszentrifugation entsorgen Sie den Überstand und spülen das Pellet mit einem Puffer, wobei Sie versuchen, die weiße, flaumige äußere Schicht zu entfernen. Geben Sie einen männlichen Teil Isolationspuffer hinzu. Kippen Sie das Röhrchen von Seite zu Seite und entfernen Sie den restlichen Puffer.Lösen Sie das Pellet mit der Pipette auf, wobei die rote Stelle der Erythrozyten am Boden vermieden werden sollte; alternativ suspendieren Sie das Pellet mit einem kleinen Homogenisator oder vorsichtig durch Pipettieren, verdünnen die Suspension mit weiterem Isolierpuffer und zentrifugieren erneut 15 Minuten bei 8.500 × g. Entsorgen Sie den Überstand. Suspendieren Sie das Pellet in Resus-Suspendierpuffer und zentrifugieren Sie erneut bei 8.500 × g. Das resultierende braune Pellet enthält gewaschene, intakte Mitochondrien. Suspendieren Sie das Pellet in einem sehr geringen Volumen an Resus-Suspendierpuffer.Je geringer das verwendete Volumen ist, desto stabiler wird die Präparation der Mitochondrien sein. Üblicherweise reichen 200 µL Puffer pro Herz aus. Die erwartete Ausbeute an präparierten Mitochondrien beträgt etwa 10 bis 15 mg mitochondriales Protein pro Herz. Und das Atmungskontrollverhältnis bei Substraten des Komplexes I einer solchen Präparation sollte zwischen acht und 12 liegen. Viel Erfolg bei Ihrer Präparation.

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