Ein Cell-to-cell Makromolekulare Transport Assay In Planta Verwendung Biolistic Bombardment

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, das Ausmaß der Zell-zu-Zell-Bewegung eines fluoreszenzmarkierten Proteins in der Pflanzenepidermis zu analysieren. Dies wird erreicht, indem DNA-beschichtete Goldpartikel verwendet werden, um das gewünschte Fusionsprotein vorübergehend in der Pflanzenepidermis zu exprimieren. Im zweiten Schritt wird die DNA in die Pflanzenepidermis eingebracht, wodurch die Expression und Bewegung des getesteten Fusionsproteins ermöglicht wird.

Anschließend wird das exprimierte Fusionsprotein unter einem konfokalen Mikroskop beobachtet, um die Expression und Lokalisation der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten getesteten Proteine zu überwachen. Die Ergebnisse zeigen das Ausmaß des Zell-zu-Zell-Transports des fluoreszenzmarkierten Proteins, basierend auf der Analyse der Verteilung des fluoreszierenden Signals mittels konfokaler Mikroskopie. Hallo, ich bin Ben Myers aus dem Labor von KY am Department für Biochemie und Zellbiologie an der State University of New York in Stony Brook.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Analyse des Ausmaßes der Zell-zu-Zell-Bewegung eines fluoreszenzmarkierten Proteins in der Pflanzenepidermis. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um den Zell-zu-Zell-Transport pflanzlicher viraler Bewegungsproteine in verschiedenen pflanzlichen Hintergründen zu untersuchen und die Zell-zu-Zell-Mobilität verschiedener Proteinarten zu vergleichen. Beginnen wir also.

Um dieses Protokoll zu beginnen, ziehen Sie eine Arabidopsis-Pflanze auf Promix bx. Verwenden Sie in einem entsprechend großen Topf eine umweltgeführte Kammer mit kurzer Lichtperiode und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 40 bis 65 % für Nicotiana, Hamana und Tabakpflanzen. Ziehen Sie jede Pflanze auf Promix BX in einem größeren Topf. Stellen Sie erneut eine umweltgeführte Kammer mit langer Lichtperiode und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 40 bis 65 % bereit.

Befruchten Sie die Pflanze gelegentlich mit im Handel erhältlichen Produkten, wie zuvor beschrieben. Nachdem die Opsis-Pflanze sechs bis acht Wochen lang gezüchtet wurde, wählen Sie Blätter für das Experiment aus, die größer als 15 Millimeter mal 35 Millimeter sind, wobei die Längenmessung den Blattstiel für n benanna- und NAC-Pflanzen einschließt; züchten Sie die Pflanzen für sieben bis zehn Wochen. Wählen Sie dann Blätter, die größer als 50 Millimeter mal 70 Millimeter für end benanna und 100 Millimeter mal 125 Millimeter für nac sind.

In diesen Fällen schließen die Längenmessungen die Peole nicht ein. Bevor die BIC-gesteuerte Abgabe von DNA-beschichteten Mikropartikeln beginnen kann, bereiten Sie die Genkanonen-Kassette mit DNA-beschichteten Goldmikropartikeln wie zuvor ausführlich beschrieben vor. Entfernen Sie anschließend die Blätter des gleichen Entwicklungsstadiums mit einer scharfen Rasierklinge und legen Sie sie umgehend mit den AAL-Seiten nach oben auf eine flache Styropor-Oberfläche.

Die ABA-Seite des Blattes stellt aufgrund ihrer geringeren Trichomdichte und dünneren Cuticula ein besseres Substrat für die Beschleunigung dar. Kleine Blätter, wie die von Rapidopsis, können immobilisiert werden, indem sie mit einem Stück Fenstergitter abgedeckt und das Gitter mit Reißzwecken an der Styroporoberfläche befestigt wird. Halten Sie die Blätter flach, um die Effizienz der Partikelabgabe zu erhöhen und Gewebeschäden während der Mikrobeschießung zu minimieren.

Danach die Kartusche mit DNA-beschichteten Mikropartikeln in die Waffe einsetzen. Für ein Kaninchen-Opsin. Den Beschuss mit Drücken von 140 bis 160 PSI für 0,6-Mikron-Mikropartikel durchführen.

Beschießen Sie die Probe mit einer Kartusche pro Blatt, um die Mikropartikel über eine Fläche von 10 bis 12 Millimetern Durchmesser zu verteilen. Für end benanna und end baum. Führen Sie das Beschleunigen bei Drücken von 160 bis 180 PSI für 0,6-Mikrometer-Mikropartikel mit größeren end benanna- und end-tabakblättern durch.

Mehrere Bombardierungen desselben Blattes sind möglich; sie müssen jedoch an symmetrischen Positionen auf jeder Seite der Mittelrippe durchgeführt werden, um Blattbereiche im gleichen Entwicklungsstadium anzusteuern. Das fluoreszierende Signal der transient exprimierten markierten Proteine wird mittels konfokaler Mikroskopie sichtbar gemacht. Es ist darauf zu achten, optimale Einstellungen für die Mikroskopie zur Detektion jedes getesteten Proteins zu finden.

Verwenden Sie ein 40x-Objektiv, um Proteine zu beobachten, die eine begrenzte intrazelluläre Akkumulation mit schwachen Signalintensitäten aufweisen, wie beispielsweise die Plasmadesal-Lokalisation des Tabakmosaikvirus-Bewegungsproteins oder T-M-V-M-P. Dies ermöglicht eine höhere Auflösung und verbesserte Empfindlichkeit. Für eine schnellere Bildgebung von Proteinen, die eine zytoplasmatische Verteilung mit starken Signalintensitäten zeigen, wie beispielsweise freies gelbes fluoreszierendes Protein oder YFP, kann jedoch ein 10x-Objektiv mit einer konfokalen Zoombewegung verwendet werden. Einfacher Transport wird aus dem Auftreten mehrzelliger Zellverbände geschlossen, die das fluoreszierende Signal enthalten.

Die Anzahl solcher Zellverbände und die Zahl der Zellen in jedem Verbund geben Aufschluss über das Ausmaß des Zell-zu-Zell-Transports. Um verlässliche Daten zu erhalten, erfassen Sie mindestens 100 Expressionsverbände pro experimentellem System und achten Sie darauf, die Experimente gleichzeitig durchzuführen.

Wann Vergleiche durchgeführt werden. Hier wurde der vereinfachte Transport fluoreszenzmarkierter Proteine nachgewiesen. Typische konfokale Bilder, die nach der Mikro-Bombardierung eines Endhamana-Blattes mit einem A-TMV-mp-YFP-exprimierenden Konstrukt erhalten werden, sind dargestellt.

Einfache Bewegung des TMV MP YFP wird basierend auf dem Auftreten mehrzelliger Cluster des YFP-Signals beobachtet. Allerdings ist nicht der gesamte transient exprimierte TMV MP YFP in der Lage, sich zu bewegen, wie durch Einzelzellensignale belegt wird. Bei einigen Mikro-Bombardements.

Statistisch gesehen ist TMV-MP-YFP in weniger als 40 % der gezählten Signalcluster nicht in der Lage, zwischen Zellen zu wandern. Hingegen bewegt sich das Protein in mehr als 60 % der Cluster zwischen zwei und fünf Zellen weiter. Die Ausbreitung auf zwei Zellen ist dabei am häufigsten. Proteine mit relativ geringer Molekülgröße, die keine intrinsische Bewegungsaktivität besitzen, können durch die Plasmamembran diffundieren, um von Zelle zu Zelle zu gelangen.

Beispielsweise breitet sich freies YFP oder ein XYFP zwischen mehreren Zellen aus und liegt in über 30 % der gezählten Cluster vor. Umgekehrt tritt diese unspezifische Diffusion bei einem translationalen YFP-Dimer oder zwei XYFP nicht auf, das vergleichbar groß ist mit dem TMV-MP-YFP-Fusionsprotein und vollständig zellautonom ist. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man die Zell-zu-Zell-Bewegung fluoreszenzmarkierter Proteine mittels transienter Expression durch ein Genkanonensystem in der Pflanzenepidermis analysiert.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, gesunde, vitale Pflanzen sowie hochwertige, mit DNA beschichtete Goldpartikel für die DNA-Übertragung vorzubereiten und ausreichend Expressionscluster zu analysieren, um statistisch zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.