Ein Cell-to-cell Makromolekulare Transport Assay In Planta Verwendung Biolistic Bombardment

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, das Ausmaß der Zell-zu-Zell-Bewegung von fluoreszenzmarkierten Proteinen in der pflanzlichen Epidermis zu analysieren. Dies wird durch die Gewinnung von DNA-beschichteten Goldpartikeln erreicht, um das interessierende Fusionsprotein vorübergehend in der pflanzlichen Epidermis zu exprimieren. In einem zweiten Schritt wird die DNA in die pflanzliche Epidermis eingebracht, was die Expression und Bewegung des getesteten Fusionsproteins ermöglicht.

Anschließend wird das exprimierte Fusionsprotein unter einem konfokalen Mikroskop beobachtet, um die Expression und Lokalisation von fluoreszenzmarkierten getesteten Proteinen zu überwachen. Es werden Ergebnisse erhalten, die das Ausmaß des Zell-zu-Zell-Transports des fluoreszenzmarkierten Proteins auf der Grundlage der Analyse der Verteilung des Fluoreszenzsignals mittels konfokaler Mikroskopie zeigen. Hallo, ich bin Ben Myers vom Labor von KY in der Abteilung für Biochemie und Zellbiologie an der State University of New York in Stony Brook.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Analyse des Ausmaßes der Zell-zu-Zell-Bewegung oder von fluoreszenzmarkierten Proteinen in pflanzlichen Epidermis. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um den Zell-zu-Zell-Transport von pflanzlichen viralen Bewegungsproteinen in verschiedenen pflanzlichen Hintergründen zu untersuchen und die Zell-zu-Zell-Mobilität verschiedener Arten von Proteinen zu vergleichen. Also lasst uns loslegen.

Um dieses Protokoll zu beginnen, züchten Sie eine Arabidopsis-Pflanze auf Promix bx. Verwenden Sie in einem entsprechend großen Topf eine klimatisierte Kammer mit einer kurzen Fotoperiode und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 40 bis 65 % für Nicotiana-, Hamana- und Nicotiana-Tabakpflanzen. Bauen Sie jede Pflanze auf Promix BX in einem größeren Topf an. Stellen Sie auch hier eine umgebungskontrollierte Kammer mit einer langen Fotoperiode und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 40 bis 65 % bereit.

Düngen Sie die Pflanze gelegentlich mit handelsüblichen Produkten, wie zuvor beschrieben. Nachdem Sie die Opsis-Pflanze sechs bis acht Wochen lang gezüchtet haben, wählen Sie für das Experiment Blätter aus, die größer als 15 Millimeter x 35 Millimeter groß sind, wobei die Längenmessung die Peole für n Benanna und NAC-Pflanzen umfasst. Die Pflanzen wachsen sieben bis 10 Wochen lang. Wählen Sie dann Blätter aus, die größer als 50 Millimeter x 70 Millimeter für das Endbenanna und 100 Millimeter x 125 Millimeter für Nac sind.

In diesen Fällen ist in den Längenmessungen die Peole nicht enthalten. Bevor die BIC-Auslieferung von DNA-beschichteten Mikropartikeln beginnen kann, bereiten Sie die Genpistolenpatrone mit DNA-beschichteten Goldmikropartikeln vor, wie zuvor ausführlich beschrieben. Entfernen Sie dann die Blätter des gleichen Entwicklungsstadiums mit einer scharfen Rasierklinge und legen Sie sie sofort mit der AAL-Seite nach oben auf eine ebene Styroporfläche.

Die ABA-Seite des Blattes stellt aufgrund ihrer geringeren Trick-Home-Dichte und der dünneren Kutikula ein besseres Substrat für das Bombardement dar. Kleine Blätter, wie z. B. ein Rapid Opsis, können ruhiggestellt werden, indem man sie mit einem Stück Fenstergitternetz abdeckt und das Netz mit Stecknadeln an der Styroporoberfläche befestigt. Halten Sie die Blätter flach, um die Effizienz der Partikelabgabe zu erhöhen und die Schädigung des Gewebes während des Mikrobeschusses zu minimieren.

Setzen Sie dann die Kartusche mit DNA-beschichteten Mikropartikeln in die Pistole ein. Für eine Kaninchen-Opsis. Führen Sie die Aufnahme bei Drücken von 140 bis 160 PSI für 0,6 Mikrometer Mikropartikel durch.

Beschießen Sie die Probe mit einer Kartusche pro Blatt, um die Mikropartikel auf einer Oberfläche von 10 bis 12 Millimetern Durchmesser zu verteilen. Für Ende Benanna und Ende Baum. Führen Sie die Aufnahme bei einem Druck von 160 bis 180 PSI für 0,6-Mikron-Mikropartikel mit größeren End-Benanna und Endtabakblättern durch.

Mehrfacher Beschuss desselben Blattes ist möglich, muss jedoch an symmetrischen Positionen auf jeder Seite der Mittelrippe erfolgen, um die Blattbereiche im gleichen Entwicklungsstadium zu treffen. Das Fluoreszenzsignal der transient exprimierten markierten Proteine wird konfokal visualisiert. Bei der Mikroskopie sollte darauf geachtet werden, optimale Mikroskopieeinstellungen für den Nachweis jedes getesteten Proteins zu finden.

Verwenden Sie eine 40-fache Objektivlinse, um Proteine zu beobachten, die eine begrenzte intrazelluläre Akkumulation mit schwachen Signalintensitäten aufweisen, wie z. B. die Plasma-Desal-Lokalisation des Tabakmosaikvirus, des Bewegungsproteins oder T-M-V-M-P. Dies ermöglicht eine höhere Auflösung und eine höhere Empfindlichkeit. Eine 10-fache Objektivlinse mit konfokaler Zoomfunktion kann jedoch für eine schnellere Abbildung von Proteinen verwendet werden, die eine zytoplasmatische Verteilung mit starken Signalintensitäten aufweisen, wie z. B. freies gelb fluoreszierendes Protein oder YFP. Vereinfachter Transport wird aus dem Auftreten von Mehrzellclustern abgeleitet, die das Fluoreszenzsignal enthalten.

Die Anzahl solcher Cluster und die Anzahl der Zellen in jedem Cluster ist ein Hinweis auf das Ausmaß des Zelltransports. Um einen zuverlässigen Datensatz von mindestens 100 Ausdrücken zu erhalten. Cluster pro Experimentiersystem, achten Sie darauf, dass die Experimente gleichzeitig durchgeführt werden.

Wann Vergleiche angestellt werden. Hier wurde der vereinfachte Transport von fluoreszenzmarkierten Proteinen nachgewiesen. Gezeigt werden typische konfokale Bilder, die nach Mikrobeschuss eines Endhamana-Blattes mit einem TMV mp YFP exprimierenden Konstrukt erhalten wurden.

Eine vereinfachte Bewegung des TMV MP YFP wird basierend auf dem Auftreten von mehrzelligen Clustern des YFP-Signals beobachtet. Allerdings sind nicht alle transient exprimierten TMV MP YFP in der Lage, sich zu bewegen, wie das Einzelzellsignal zeigt. In einigen Mikrobombardements.

Statistisch gesehen ist TMV MP YFP in weniger als 40% der gezählten Signalcluster nicht in der Lage, sich zwischen den Zellen zu bewegen. In mehr als 60 % der Cluster bewegt sich das Protein zwischen zwei und fünf Zellen. Da die Ausbreitung in zwei Zellen am häufigsten ist, können die Proteine mit relativ kleiner Molekülgröße ohne angeborene Bewegungsaktivität durch Plasma-SMA diffundieren, um sich von Zelle zu Zelle zu bewegen.

Zum Beispiel verteilt sich freies YFP oder ein XYFP auf mehrere Zellen und mehr als 30 % der gezählten Cluster. Umgekehrt tritt diese unspezifische Diffusion nicht für ein translationales YFP-Dimer oder zwei XYFP auf, die in ihrer Größe mit dem TMV MP YFP-Fusionsprotein vergleichbar und vollständig zellautonom sind. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie die Zell-zu-Zell-Bewegung von fluoreszenzmarkierten Proteinen mithilfe der transienten Expression durch ein Genkanonensystem in der pflanzlichen Epidermis analysieren können.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, gesunde, robuste Pflanzen, hochwertige DNA-beschichtete Goldpartikel für die Abgabe von DNA vorzubereiten und genügend Expressionscluster zu analysieren, um statistisch zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.