Name: Isolierung von Retinal Stammzellen aus der Maus Eye (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung von retinalen Stammzellen aus dem Ziliarepithel des Mäuseauges und deren Kultivierung zu klonalen retinalen Sphären. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Selbsterneuerung und Multipotenzialität für die regenerative Medizin.

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Wir bedanken uns bei Laura Clarke für ihre unschätzbare Hilfe. Stem Cell Network, CIHR und NIH: Diese Arbeit wird von NCE unterstützt.

1. Bereiten Sie die Dissecting Solutions und Enzymlösungen <ol><li> Machen Sie das Künstliche Rückenmarksflüssigkeit (ACSF) und die Serum-freien Medien vor der Zeit und in den Kühlschrank. </li><li> Abwiegen der Kynurensäure (0,2 mg / ml) auflösen und in 10 ml hilo ACSF in einem 37 ° C im Wasserbad vor der Zeit, da es nicht leicht löst. </li><li> Abwiegen der Trypsin (1,33 mg / mL) und Hyaluronidase (0,67 mg / mL) und in einem 15 ml-Röhrchen und bewahren Sie sie bei -20 ° C bis zum Gebrauch. Fügen Sie die Kynurensäure Lösung für dieses Rohr und Filter mit einer 22 um Spritzenfilter kurz vor dem Gebrauch. </li><li> Abwiegen Trypsin Inhibitor (Ovamucoid: 1 mg / mL) und lösen sich in warmen Serum-freien Medien und Filter mit 22μm Spritzenfilter. </li><li> Nehmen Sie die Beschichtung Medien: Serum-freien Medien mit FGF2 (10 ng / mL) und Heparin (2 pg / mL). </li></ol> 2. Isolating Retinal Stammzellen aus der Maus Eye <ol><li> Isolation des retinalen Stammzellen ist in einem bestimmten sterilen Raum gewidmet Primärkultur Experimente durchgeführt. Vor Beginn dieser Prozedur richten Sie die Präpariermikroskop und Kaltlichtquelle, und dann legen die sterile Sezierbesteck. Jeder Kapuze hat eine heiße Perle Sterilisator zum Sterilisieren der Instrumente zwischen den Schritten. </li><li> Wir isolieren retinalen Stammzellen aus Augen, die platziert wurden sofort in eine sterile Petrischale mit Artificial Rückenmarksflüssigkeit (ACSF) nach der Entnahme aus Mäuse getötet nach anerkannten Tierethik Protokolle. </li><li> Unter dem Binokular, reinigen Sie die Augen mit einer Pinzette: loszuwerden, die Haare und das Bindegewebe, das die Hornhaut / Sklera Grenze gebunden ist. Dann übertragen Sie den Blick auf ein neues Gericht mit ACSF. </li><li> Während sanft ausspülen, das Auge stationär mit Wellenschliff Pinzette verwenden abgewinkelt Micro-Präparierscheren die Augenmuskeln zu entfernen. Entfernen Sie den Sehnerv sowie, wenn es noch mit dem Auge angebracht. Versuchen Sie nicht, das Auge während dieses Prozesses squish. Transfer Augen für eine neue Platte mit ACSF. </li><li> Als nächstes verwenden gebogenen Mikro-Präparierscheren für das Auge in zwei Hälften geschnitten: begin am Sehnerv und Schnitt durch die Mitte der Hornhaut, Treffen wieder auf den Sehnerv, wo der Schnitt wurde eingeleitet. Es ist ideal, wenn die beiden Teile des Auges entspricht in etwa der Größe sind, weil das macht den nächsten Schritt zu erleichtern. </li><li> Halten Sie die Hornhaut mit zwei Pinzetten vorsichtig schälen die beiden Augen Hälften auseinander. Entfernen und entsorgen Sie das Objektiv, Eingeweide, und die neuronalen Netzhaut des Auges Muscheln. Übertragen Sie die Muscheln auf ein neues Gericht mit ACSF. </li><li> Jetzt sind wir bereit, die Ciliarepithels isolieren. Um zu beginnen, orientieren Auge Schale, so dass die Hornhaut auf der rechten und der retinalen Pigmentepithel (RPE) ist auf der linken Seite. Gently pin Auge Schale unten mit geraden Pinzette auf die RPE Seite. </li><li> Als Nächstes verwenden Sie ein Skalpell, um die Hornhaut und der Iris weggeschnitten aus dem Ciliarepithels des Auges durch leichtes Drücken auf das Skalpell anstatt Sägen Bewegungen. </li><li> Danach schneiden Sie die Ciliarepithels vom RPE. Verwenden Sie nicht gezahnt Pinzette, um den Streifen von Ciliarepithels zu einem neuen 35-mm-Schale mit ACSF übertragen. </li><li> In gleicher Weise isolieren Ciliarepithel aus dem anderen Auge Shell. </li><li> Sobald beide ciliary epithelialen Streifen gesammelt worden sind, übertragen Sie die Streifen in einen 35-mm-Schale mit 2 ml Dispase. Die Schale mit den Streifen in einem 37 ° C Inkubator für 10 Minuten. </li><li> Nach 10 Minuten, übertragen Sie die Streifen aus dem Dispase in eine Schale mit 2 mL der gefilterten Trypsin, Hyaluronidase und Kynurensäure. Die Schale bei 37 ° C für 10 Minuten. </li><li> Nun zu den Präpariermikroskop zurückzukehren. Halten Sie die Sklera unten mit geraden Zangen, verwenden Sie den unteren Rand des gekrümmten nicht gezahnt Pinzette vorsichtig abkratzen Ciliarepithel weg von der Lederhaut. </li><li> Entfernen Sie die Lederhaut aus der Schüssel. Alles, was in der Schale links sollte nun sind die Zellen von Interesse und der Enzymlösung. </li><li> Mit einem feuerpolierte Baumwolle gesteckt Pipette dieser Lösung in einen 14-ml-Tube. Man reibt diese Lösung 30 mal auseinander zu brechen den Epithelzellen durch vorsichtiges zwingt die Lösung in die und aus der Pipette. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen 5 Minuten bei 1500 RPM. Wenn der Zentrifugation ist, entfernen Sie den Schlauch aus der Zentrifuge vorsichtig erfolgen, da die Zellen anfällig für Fahren von den Boden des Röhrchens in diesem Stadium sind. </li><li> Vorsichtig absaugen die Mehrheit der Überstand mit einer Pipette feuerpolierte, und fügen Sie dann 1 ml Trypsin-Inhibitor in serum-freien Medien zu den Zellen. Verwenden Sie eine kleine Bohrung Baumwolle gesteckt Pipette auf die Probe ungefähr 50-mal verreiben, bis es eine Single-Zellsuspension wird. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen wieder für 5 Minuten bei 1500 RPM. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und ersetzen Sie es mit 1 mL der Beschichtung Medium. Man reibt vorsichtig mit einem feuerpolierte Glaspipette, die ce resuspendierenlls. </li><li> Nach Auszählung der Zellen, Platte sie auf die gewünschte Dichte in einer 24-Well-Platte. Wir in der Regel Platte 10 Zellen / ul, indem jedes Well zunächst mit Medium und dann die Zellsuspension auf ein Endvolumen von 500 ul Medien zu bekommen. </li><li> Die Platte wird in einem 37 ° C CO 2-Inkubator, wo es nicht verschoben wird, bis Sie die Kugeln, die nach 7 Tagen entstehen zu zählen. </li></ol> 3. Die Ergebnisse der Isolating Retinal Stem Cells <ol><li> Wenn diese Prozedur erfolgreich ausgeführt wird, sollte die seziert ciliary Epithelzellen wie diese, nachdem sie dissoziiert und vernickelt bei geringer Dichte (Abbildung 1) zu suchen. </li><li> Nach 7 Tagen in Kultur, sind die retinalen Stammzellen Sphären, die entstehen gezählt. Eine Kugel soll mehr als 75 &amp;mgr; m im Durchmesser und frei schwebende als Stammzellen abgeleitete Kugel gezählt werden. (Abbildung 2). Allerdings werden einige Zellen haben begrenzte Verbreitung und Form Sphäroide, die nicht Größe Kriterium und nicht als Stammzellen abgeleitete Kugeln gezählt werden, ein Beispiel für eine solche Sphäroid ist hier (Abbildung 2) gezeigt. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2209/2209fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. <img src="/files/ftp_upload/2209/2209fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2.

<ol><li>Tropepe, V., Coles, B. L., Chiasson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells+in+the+adult+mammalian+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells in the adult mammalian eye.</a> Science. 287, 2032-2036 (2000).</li>
<li>Ahmad, I., Tang, L., Pham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neural+progenitors+in+the+adult+mammalian+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of neural progenitors in the adult mammalian eye.</a> Biochem Biophys Res Commun. 270, 517-521 (2000).</li>
<li>Coles, B. L., Angenieux, B., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+isolation+and+the+characterization+of+human+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Facile isolation and the characterization of human retinal stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15772-15777 (2004).</li>
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<li>Angénieux, B., Schorderet, F. D., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+is+a+neuronal+differentiation+factor+for+retinal+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor is a neuronal differentiation factor for retinal stem cells in vitro.</a> Stem Cells. 24 (3), 696-706 (2006).</li>
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<li>Canola, K., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cells+committed+towards+the+photoreceptor+fate+for+retinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Generation of cells committed towards the photoreceptor fate for retinal transplantation.</a> Neuroreport. 18 (9), 851-855 (2007).</li>
<li>Djojosubroto, M. W., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells%3A+promising+candidates+for+retina+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells: promising candidates for retina transplantation.</a> Cell Tissue Res. 331 (1), 347-357 (2008).</li>
<li>Inoue, T., Coles, B. L., Dorval, K., Bremner, R., Bessho, Y., Kageyama, R., Hino, S., Matsuoka, M., Craft, C. M., McInnes, R. R., Tremblay, F., Prusky, G. T., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+functional+photoreceptor+differentiation+from+adult+human+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Maximizing functional photoreceptor differentiation from adult human retinal stem cells.</a> Stem Cells. 28 (3), 489-500 (2010).</li>
<li>Tropepe, V., Sibilia, M., Ciruna, B. G., Rossant, J., Wagner, E. F., Kooy, D. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+neural+stem+cells+proliferate+in+response+to+EGF+and+FGF+in+the+developing+mouse+telencephalon.+Dev+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev Biol.</a> , 208-201 (1999).</li>
<li>Coles-Takabe, B. L., Brain, I., Purpura, K. A., Karpowicz, P., Zandstra, P. W., Morshead, C. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Don%27t+look%3A+growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li>
</ol>

Dieses Protokoll beschreibt, wie Retina-Stammzellen aus dem Ciliarepithels der Maus Auge 1-3 isolieren. Die Methodik zur Isolierung der Streifen Ciliarepithels kann variieren, aber die Enzyme und die Methodik zur Erzielung einer Single-Zellsuspension wurden in diesem Protokoll optimiert. Es ist auch wichtig, dass die Streifen von Ciliarepithels, die isoliert wurden nicht enthalten große Mengen an RPE oder Hornhaut, da diese offensichtlich einen negativen Einfluss auf die Gesamtzahl der Kugeln, die von jedem Auge isoliert werden müssen. Darüber hinaus wird das Serum-freien Medien, die wir machen, das ursprünglich für die Gehirnentwicklung Neurosphären 13 formuliert, ideal für den Anbau von retinalen Stammzellen Sphären. Man sollte auch darauf achten, dass die Zellen nicht gestört werden, nachdem sie vergoldet worden und in den Inkubator, damit die wachsende Kugeln aggregieren nicht zusammen 14. Sobald die Netzhaut Stammzellen klonale Kugeln gebildet haben, können sie gezählt, um eine prospektive Anzahl der Stammzellen pro Auge zu bekommen. Die Kugeln dann können dann in einzelne Zellen dissoziiert und passagiert, um festzustellen, Selbst-Erneuerung Fähigkeiten oder differenziert in die verschiedenen Zelltypen des neuronalen Netzhaut und RPE durch verschiedene Kombinationen von Wachstumsfaktoren und / oder Proteinen.

<table><tbody><tr><td>Stemi 2000 Mikroskop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaltlichtquelle</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>KL1500</td><td>doppelter optischer Lichtarm</td></tr><tr><td>Gekrümmte Mini-Vannas-Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>Winkel-Vannas-Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15005-08</td><td></td></tr><tr><td>#7 Dumont-Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-30</td><td>nicht gezahnt</td></tr><tr><td>#5 Dumont-Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>gerade</td></tr><tr><td>Feine Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td>gezahnt, gekrümmt</td></tr><tr><td>#3 Skalpellgriff</td><td>Almedic</td><td>2586-M36-10</td><td></td></tr><tr><td>#10 Skalpellklingen</td><td>Almedic</td><td>2580-M90-10</td><td></td></tr><tr><td>Heißperlen-Sterilisator</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>VWR international</td><td>CACB354235</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1005</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>Kynurensäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3375</td><td>1000 IE</td></tr><tr><td>Trypsininhibitor</td><td>Roche Group</td><td>10109878001</td><td></td></tr><tr><td>35-mm-Schalen</td><td>VWR international</td><td>CA354235</td><td></td></tr><tr><td>24-Loch-Platte</td><td>VWR international</td><td>CA73521-004</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten mit Wattestopfen</td><td>VWR international</td><td>14672-400</td><td>feuerpoliert</td></tr><tr><td>14-mL-Röhrchen</td><td>Falcon BD</td><td>352057</td><td>Polystyrol</td></tr><tr><td>Serumfreies Medium</td><td></td><td></td><td>Ref# 13 für die Zusammensetzung</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td>100 IE</td></tr></tbody></table>

isolierung von retinal stammzellen aus der maus eye

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Die erwachsenen Maus retinalen Stammzellen (RSC) ist eine seltene Ruhe Zelle innerhalb der Ciliarepithels (CE) der Säugetier Auge 1,2,3 gefunden. Die CE besteht aus nicht-pigmentierten inneren und pigmentierten äußeren Zellschichten gemacht, und die klonale RSC Kolonien, die aus einem einzigen pigmentierten Zellen aus dem CE entstehen bestehen sowohl aus pigmentierten und nicht pigmentierten Zellen, die unterschieden werden können an alle die Form Zelltypen des neuronalen Netzhaut und des RPE. Es gibt eine Kontroverse darüber, ob alle Zellen innerhalb der Sphären enthalten alle zumindest einige Pigment 4, allerdings sind die Zellen noch in der Lage der Bildung der verschiedenen Zelltypen innerhalb der neuronalen Retina 1-3 gefunden. Bei einigen Arten, wie Amphibien und Fischen sind die Augen der Lage, die Regeneration nach Verletzungen 5 jedoch, das Auge der Säugetiere zeigt keine solche regenerative Eigenschaften. Wir versuchen, die Stammzellen in vivo zu identifizieren und die Mechanismen, die den Säugetieren retinalen Stammzellen Ruhestrom 6-8 zu halten verstehen, auch nach Verletzungen sowie ihre Verwendung als eine potenzielle Quelle von Zellen zu reparieren körperliche oder genetische Modelle von Augenverletzungen Hilfe durch die Transplantation 9-12. Hier beschreiben wir, wie man den Ciliar Epithelzellen aus der Maus Auge zu isolieren und zu wachsen sie in der Kultur, um die klonale retinalen Stammzellen Kugeln zu bilden. Da es keine bekannten Markern der Stammzellen in vivo, sind diese Kugeln die einzige bekannte Möglichkeit, prospektiv identifizieren die Stammzell-Population innerhalb der Ciliarepithels des Auges.

In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie Sie retinalen Stammzellen aus dem Ciliarepithels der Maus Auge zu isolieren und zu wachsen sie in Kultur zu klonalen Netzhaut Kugeln zu bilden. Die Kugeln, die isoliert besitzen den Kardinal Eigenschaften von Stammzellen: Selbsterneuerung und multipotentiality.

Isolierung von Retinal Stammzellen aus der Maus Eye

Die adulte Netzhautstammzelle (RSC) der Maus ist eine seltene, ruhende Zelle, die im Zilienepithel (CE) des Auges von Säugetieren vorkommt1,2,3. Das CE besteht aus ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, retinale Stammzellen aus dem Ziliarepithel des Auges zu isolieren. Dies wird erreicht, indem das Auge zunächst gereinigt und entlang einer Linie halbiert wird, die am Sehnerv beginnt, durch die Hornhaut verläuft und wieder am Sehnerv endet. Anschließend werden die Netzhaut und die Linse entfernt. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das Ziliarepithel auszuschneiden, indem Hornhaut, Iris und retikuläres pigmentiertes Epithel abgetrennt werden.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, das Ziliarepithel enzymatisch zu behandeln, die Sklera zu entfernen und das Epithel mechanisch in Einzelzellen zu dissoziieren. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Zellen in serumfreiem Medium erneut in Suspension zu bringen und sie in Zellkulturplatten mit serumfreiem Medium, das Wachstumsfaktoren enthält, auszuplatzieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die prospektiv die Anzahl der im Ziliarepithel des Auges vorhandenen Stammzellen durch die Bildung klonaler Sphäroide in vitro zeigen.Hallo, mein Name ist Brenda Coles. Unsere Arbeitsgruppe entwickelte diese Methode erstmals, als wir Arbeiten über die regenerativen Fähigkeiten von Amphibien und Fischen in ihren Augen erforschten und die Hypothese aufstellten, dass es möglicherweise eine Zelle im Säugetierauge mit denselben Fähigkeiten geben könnte. Die Isolierung der retinalen Stammzellen erfolgt in einem spezifischen sterilen Raum, der primären Kultivierungsversuchen vorbehalten ist.Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, richten Sie das Stereomikroskop und die Kaltlichtquelle ein und legen Sie die sterilen dissezierenden Instrumente bereit. Jeder Abzug verfügt über einen heißen Sterilisator zur Sterilisation der Instrumente zwischen den Arbeitsschritten. Wir isolieren retinale Stammzellen aus Augen, die unmittelbar nach der Entnahme aus nach genehmigten Tierversuchsethikprotokollen getöteten Mäusen in eine sterile Petrischale mit künstlichem zerebrospinalen Flüssigkeit gegeben werden. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens besteht darin, ein rundes Objekt unter dem Mikroskop zu dissezieren.Es ist äußerste Sorgfalt erforderlich, um das Gewebe von Interesse nicht zu beschädigen. Unter dem Stereomikroskop reinigen Sie das Auge mit einer Pinzette. Entfernen Sie die Haare und das verbundene Gewebe, das am Übergang von Hornhaut zu Sklera anhaftet. Überführen Sie das Auge anschließend in eine neue Schale mit aCSF, wobei Sie das Auge mit einer gezahnten Pinzette fixieren.Entfernen Sie die Augenmuskeln mit schrägen mikrochirurgischen Scheren. Entfernen Sie ebenfalls den Sehnerv, falls er noch am Auge befestigt ist; vermeiden Sie dabei, das Auge zu zerquetschen. Überführen Sie die Augen in eine neue Schale mit einer CSF. Als Nächstes wurden gebogene mikrochirurgische Scheren verwendet, um das Auge zu halbieren. Beginnen Sie am Sehnerv und schneiden Sie durch die Mitte der Hornhaut, bis Sie wieder am Sehnerv an der Stelle ankommen, an der der Schnitt begonnen wurde. Es ist ideal, wenn die beiden Augenhälften ungefähr gleich groß sind, da dies den nächsten Schritt vereinfacht.Halten Sie die Hornhäute mit zwei Pinzetten fest und trennen Sie vorsichtig die beiden Augenhälften. Entfernen und entsorgen Sie die Linsenviscera und die neurale Netzhaut aus den Augenschalen. Überführen Sie die Schalen in eine neue Schale mit A-CSF.Jetzt sind wir bereit, das Ziliarepithel zu isolieren. Orientieren Sie zunächst die Augenschale so, dass sich die Hornhaut rechts und das retinale Pigmentepithel links befindet. Befestigen Sie die Augenschale vorsichtig mit einer geraden Pinzette auf der RPE-Seite.Als Nächstes das Skalpell verwenden, um die Cornea und die Iris durch vorsichtiges Andrücken des Skalpells – statt durch Sägebewegungen – vom Ziliarepithel des Auges abzutrennen. Danach das Ziliarepithel vom retinalen Pigmentepithel (RPE) ablösen. Mit nicht gezahnten Pinzetten den Streifen des Ziliarepithels in eine neue 35-Millimeter-Schale überführen, die A-CSF enthält.Auf die gleiche Weise wird das Ziliarepithel aus der Augenschale des anderen Auges isoliert. Sobald die Ziliarepithel-Streifen gesammelt wurden, überführen Sie die Streifen in eine 35-Millimeter-Schale, die zwei Milliliter Dis-Space enthält. Stellen Sie die Schale mit den Streifen für 10 Minuten in einen 37 °C warmen Inkubator.Nach 10 Minuten die Streifen aus dem Dis-Raum in eine Schale mit zwei Milliliter filtrierten Tropfen in Halle ur haase und kind reic Säure überführen. Die Schale 10 Minuten bei 37 Grad Celsius stellen. Danach zum Präparationsmikroskop zurückkehren und die Sklera mit einer geraden Pinzette festhalten.Verwenden Sie die konkave Seite der nicht kalibrierten Pinzette, um das Ziliarepithel vorsichtig von der Sklera abzukratzen. Entfernen Sie die Sklera aus der Petrischale. Alles, was in der Schale verbleiben sollte.Jetzt liegen die gewünschten Zellen und die Enzymlösung vor. Mit einer feuerpolierten, mit Watte verschlossenen Pipette wird die Lösung in ein 14-Liter-Gefäß überführt. Die Lösung wird 30-mal titriert, um die Epithelzellen durch vorsichtiges Hin- und Herpipettieren aufzulösen, anschließend wird das Gefäß fünf Minuten bei 1500 U/min zentrifugiert.Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, nehmen Sie das Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge heraus, da die Zellen dazu neigen, sich vom Boden des Röhrchens zu lösen. Aspirieren Sie in diesem Schritt vorsichtig den größten Teil des Überstandes mit einer feuerpolierten Pipette und geben Sie dann einen Milliliter Trypsininhibitor in serumfreiem Medium zu den Zellen hinzu.Verwenden Sie eine Pipette mit kleinem Bohrungsdurchmesser und Wattepfropfen, um die Probe etwa 50-mal umzupipettieren, bis eine Einzelzell-Suspension vorliegt. Zentrifugieren Sie das Gefäß erneut fünf Minuten lang. Entfernen Sie bei 1500 U/min das Überstand und ersetzen Sie ihn durch ein Milliliter Ihrer Ansiedlungsmedium.Medium vorsichtig unter Verwendung einer feuerpolierten Glaspipette kühlen, um die Zellen erneut in Suspension zu bringen. Nach der Zellzählung werden diese in der gewünschten Dichte ausplattiert. In einer 24-Loch-Platte geben wir üblicherweise 10 Zellen pro Mikroliter aus, indem wir zunächst jedes Loch mit Medium füllen und dann die Zellsuspension hinzufügen, um ein Endvolumen von 500 Mikrolitern Medium zu erreichen.Stellen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius warmen Kohlendioxid-Inkubator, wo sie nicht bewegt wird, bis Sie die nach sieben Tagen entstandenen Sphären zählen, wenn das Verfahren erfolgreich durchgeführt wurde. Die dissezierten ziliären Epithelzellen sollten nach der Dissoziation und Ausplattung bei geringer Dichte wie folgt aussehen. Nach sieben Tagen im Kulturmedium werden die entstandenen Sphären aus retinalen Stammzellen gezählt.Eine Kugel muss einen Durchmesser von über 75 Mikrometern aufweisen und frei schwebend sein, um als aus Stammzellen stammende Kugel gezählt zu werden. Einige Zellen zeigen jedoch eine begrenzte Proliferation und bilden PHE, die das Größenkriterium nicht erfüllen, und werden daher nicht als aus Stammzellen stammende Kugeln gezählt. Ein Beispiel für einen solchen Asteroiden ist hier nach seiner Entwicklung dargestellt.Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Sehwissenschaften den Weg, um die Möglichkeit der Verwendung von retinalen Stammzellen bei der Behandlung von Netzhauterkrankungen zu erforschen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video demonstriert das Verfahren zur Isolierung von primären retinalen Ganglienzellen (RGCs) von Mäusen mit Hilfe der Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die zukünftige Untersuchung von RGCs mit dem Ziel, den starken Rückgang der Sehschärfe besser zu verstehen, der aus dem Verlust funktioneller RGCs bei neurodegenerativen Erkrankungen resultiert.

Isolierung von murinen retinalen Ganglienzellen mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung

Millionen von Menschen leiden an retinalen degenerativen Erkrankungen, die zu irreversibler Blindheit führen. Ein gemeinsames Element vieler dieser Krankheiten ist der Verlust von Netzhautganglienzellen (RGCs). Dieses detaillierte Protokoll beschreibt die Isolierung von primären murinen RGCs durch positive und negative Selektion mit Durchflusszytometrie.

Isolierung von primären murinen Retinal-Ganglion-Zellen (RGCs) durch Durchflusszytometrie

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine multifunktionale Epithel des Auges. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur primären Zellkulturen, abgeleitet von der murinen RPE zu etablieren.

Primären Zellkulturen aus das retinale Pigmentepithel Maus

Das Protokoll beschreibt organotypische Explanten der Maus NeuroRetina, kultiviert zusammen mit seinem retinalen Pigment epithel (RPE), in R16 definierten Medium, frei von Serum und Antibiotika. Diese Methode ist relativ einfach durchzuführen, im Vergleich zu In-vivo-Experimenten kostengünstiger und zeitaufwändigund und kann an zahlreiche experimentelle Anwendungen angepasst werden.

Langfristige, serumfreie Kultivierung organotypischer Maus-Retina-Explanten mit intaktem retinalen Pigmentepithel

Dieses Protokoll stellt zwei Techniken vor, um die subzellulären Kompartimente von murinen Stäbchen-Photorezeptoren für die Proteinanalyse zu isolieren. Die erste Methode verwendet lebendes Netzhaut- und Zellulosefilterpapier, um die äußeren Segmente der Stäbchen zu trennen, während die zweite Methode lyophilisierte Netzhaut und Klebeband verwendet, um die inneren und äußeren Segmentschichten der Stäbchen abzuziehen.

Zwei Peeling-Methoden zur Isolierung von Photorezeptor-Zellkompartimenten in der Netzhaut der Maus zur Proteinanalyse

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von murinen postnatalen retinalen Endothelzellen, die für Zellertrag, Reinheit und Lebensfähigkeit optimiert sind. Diese Zellen eignen sich für Next-Generation-Sequenzierungsansätze.

Isolierung von retinen retinalen Endothelzellen für die Sequenzierung der nächsten Generation

Dieses Manuskript beschreibt ein vereinfachtes Protokoll zur schrittweisen Isolierung von retinalen pigmentierten Epithelzellen (RPE) aus Mausaugen. Das Protokoll umfasst die Enukleation und Dissektion von Mausaugen, gefolgt von der Isolierung, Aussaat und Kultivierung von RPE-Zellen.

Isolierung von primären retinalen pigmentierten Epithelzellen der Maus

Müller-Glia-Primärkulturen, die aus Mausnetzhaut gewonnen werden, stellen ein sehr robustes und zuverlässiges Werkzeug dar, um die Umwandlung von Gliazellen in retinale Vorläuferzellen nach einer microRNA-Behandlung zu untersuchen. Einzelne Moleküle oder Kombinationen können vor der anschließenden Anwendung von In-vivo-Ansätzen getestet werden.

Primäre Zellkulturen zur Untersuchung des Regenerationspotenzials von murinen Müller-Glia nach MicroRNA-Behandlung

Wir beschreiben eine einfache und effiziente Methode zur Isolierung von Zellen der retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) aus den Augen junger pigmentierter Meerschweinchen. Dieses Verfahren ermöglicht molekularbiologische Folgeuntersuchungen am isolierten RPE, einschließlich Genexpressionsanalysen.

Isolierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus Meerschweinchenaugen

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Isolierung retinaler glialer Müller-Zellen aus Mausaugen. Das Protokoll beginnt mit der Enukleation und Dissektion von Mausaugen, gefolgt von der Isolierung, Aussaat und Kultivierung von Müller-Zellen.

Isolierung von primären retinalen glialen Müller-Zellen der Maus

Das retinale Pigmentepithel (RPE) fungiert als entscheidende Barriere zwischen Aderhaut und Netzhaut und fördert die Gesundheit und Funktion von retinalen Zelltypen, wie z. B. Photorezeptoren. Darin beschreiben wir ein einfaches und effektives Protokoll zur Isolierung und Kultivierung adulter muriner RPE.

Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen

Erfahren Sie die Isolierung von retinalen Stammzellen aus dem Ziliarepithel des Mäuseauges und deren Kultivierung zu klonalen retinalen Sphären. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Selbsterneuerung und Multipotenzialität für die regenerative Medizin.

Isolierung von Retinal Stammzellen aus der Maus Eye

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