Isolierung von Retinal Stammzellen aus der Maus Eye

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, retinale Stammzellen aus dem Ziliarepithel des Auges zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zuerst das Auge gereinigt und in zwei Hälften geschnitten wird, beginnend mit dem Sehnerv, die Hornhaut durchtrennt und wieder auf den Sehnerv trifft, und dann die neurale Netzhaut und die Linse entfernt werden. Der zweite Schritt des Eingriffs besteht darin, das Ziliarepithel herauszuschneiden, indem die Iris der Hornhaut und das pigmentierte Epithel der Netzhaut abgeschnitten werden.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, das Ziliarepithel enzymatisch zu behandeln, die Sklera zu entfernen und das Epithel mechanisch in einzelne Zellen zu dissoziieren. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Zellen in serumfreien Medien zu resuspendieren und sie in Gewebekulturplatten zu legen, die serumfreie Medien mit Wachstumsfaktoren enthalten. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die prospektiv zeigen, wie viele Stammzellen im Ziliarepithel des Auges durch klonale Kugelbildung in vitro gefunden werden.

Hallo, mein Name ist Brenda Coles. Unser Labor kam zum ersten Mal auf diese Methode, als wir Arbeiten über die regenerativen Fähigkeiten von Amphibien und Fischen in ihren Augen untersuchten und die Hypothese aufstellten, dass es vielleicht eine Zelle im Auge von Säugetieren mit den gleichen Fähigkeiten gibt. Die Isolierung der retinalen Stammzellen erfolgt in einem speziellen sterilen Raum, der für Primärkulturexperimente vorgesehen ist.

Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, richten Sie das Präpariermikroskop und die Kaltlichtquelle ein und legen Sie dann die sterilen Präparierinstrumente aus. Jede Haube verfügt über einen Hotbeat-Sterilisator zur Sterilisation der Instrumente zwischen den Schritten. Wir isolieren retinale Stammzellen aus Augen, die sofort in eine sterile Petrischale mit künstlicher zerebraler Rückenmarksflüssigkeit gelegt wurden. Nach der Entnahme von Mäusen, die gemäß den genehmigten Tierethikprotokollen getötet wurden, ist der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens das Präparieren eines runden Objekts unter dem Mikroskop.

Es muss sehr vorsichtig vorgegangen werden, um das interessierende Gewebe nicht zu zerstören Reinigen Sie das Auge unter dem Präpariermikroskop mit einer Pinzette. Entferne die Haare und das verbundene Gewebe, das an der Hornhautgrenze befestigt ist. Übertragen Sie dann das Auge in eine neue Schale mit A CSF, während Sie das Auge mit einer gezackten Pinzette festhalten.

Verwenden Sie eine abgewinkelte Mikro-Präparierschere, um die Augenmuskeln zu entfernen. Entfernen Sie auch den Sehnerv, wenn er noch am Auge befestigt ist, versuchen Sie, das Auge während dieses Vorgangs nicht zu quetschen. Übertragen Sie die Augen mit einem Liquor auf eine neue Schale.

Als nächstes benutzte ich eine gebogene Mikro-Präparierschere, um das Auge in zwei Hälften zu schneiden. Beginnen Sie am Sehnerv und schneiden Sie durch die Mitte der Hornhaut, die sich wieder am Sehnerv trifft, wo der Schnitt eingeleitet wurde. Ideal ist es, wenn die beiden Augenteile in etwa gleich groß sind, denn das erleichtert den nächsten Schritt.

Halten Sie die Hornhaut mit zwei Pinzetten fest und schälen Sie die beiden Augenhälften vorsichtig auseinander. Entfernen und entsorgen Sie die Linseneingeweide und die neurale Netzhaut von den Augenmuscheln. Die Schalen mit A CSF in eine neue Schale geben.

Jetzt sind wir bereit, das Ziliarepithel zu isolieren. Richten Sie zunächst die Augenschale so aus, dass sich die Hornhaut zu Ihrer Rechten und das pigmentierte Epithel der Netzhaut zu Ihrer Linken befindet. Stecken Sie die Augenmuschel vorsichtig mit einer geraden Pinzette auf der RPE-Seite fest.

Schneiden Sie anschließend mit dem Skalpell die Hornhaut und Iris vom Ziliarepithel des Auges ab, indem Sie das Skalpell sanft nach unten drücken, anstatt Sägebewegungen zu verwenden. Schneiden Sie danach das Ziliarepithel vom RPE ab. Verwenden Sie eine nicht gezackte Pinzette, um den Streifen des Ziliarepithels in eine neue 35-Millimeter-Schale zu übertragen, die einen Liquor enthält.

Isolieren Sie auf die gleiche Weise das Ziliarepithel von der anderen Augenschale. Nachdem die Ziliarepithelstreifen gesammelt wurden, werden die Streifen in eine 35-Millimeter-Schale mit zwei Millilitern Disraum gegeben. Legen Sie die Schale mit den Streifen für 10 Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator.

Nach 10 Minuten geben Sie die Streifen aus dem Despace in eine Schale mit zwei Millilitern gefilterten Tropfen in Halle Ihre Haase und Art Reinsäure. Stellen Sie das Gericht 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Kehren Sie nun zum Präpariermikroskop zurück, während Sie die Sklera mit einer geraden Pinzette festhalten.

Verwenden Sie die Pinzette am unteren Rand der Kurve, um das Ziliarepithel vorsichtig von der Sklera abzukratzen. Die Sklera aus der Form nehmen. All das sollte in der Schüssel bleiben.

Nun sind die Zellen von Interesse und die Enzymlösung. Übertragen Sie die Lösung mit einer feuerpolierten Wattepette in ein 14-Liter-Röhrchen. Tritrieren Sie diese Lösung 30 Mal, um die Epithelzellen aufzubrechen, indem Sie die Lösung vorsichtig in die Pipette hinein- und wieder herausdrücken, zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 1500 U/min.

Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, nehmen Sie das Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge. Da die Zellen dazu neigen, sich vom Boden des Röhrchens zu lösen. In diesem Stadium aspirieren Sie vorsichtig den größten Teil des SuperNet mit einer feuerpolierten Pipette und fügen Sie dann einen Milliliter Trypsin-Inhibitor in serumfreien Medien zu den Zellen hinzu.

Verwenden Sie eine kleine Bohrlochpipette mit Wattestopfen, um die Probe etwa 50 Mal zu trigen, bis es sich um eine Einzelzellsuspension handelt. Zentrifugieren Sie das Röhrchen erneut fünf Minuten lang. Entfernen Sie bei 1500 U/min den Überstand und ersetzen Sie ihn durch einen Milliliter Ihrer Beschichtung.

Medium Schonend mit einer feuerpolierten Glaspipette kühlen, um die Zellen wieder zu suspendieren. Nach dem Zählen plattieren die Zellen diese in der gewünschten Dichte. In einer 24-Well-Platte plattieren wir in der Regel 10 Zellen pro Mikroliter, indem wir jede Vertiefung zuerst mit Medium füllen und dann die Zellsuspension hinzufügen, um ein Endvolumen von 500 Mikrolitern Medium zu erhalten.

Legen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius heißen Kohlendioxid-Inkubator, wo sie nicht bewegt wird, bis Sie die Kugeln gezählt haben, die nach sieben Tagen entstehen, wenn dieser Vorgang erfolgreich durchgeführt wurde. Die präparierten Ziliarepithelzellen sollten nach der Dissoziation und Plattierung bei geringer Dichte so aussehen. Nach sieben Tagen in Kultur werden die entstehenden retinalen Stammzellkugeln gezählt.

Eine Kugel sollte einen Durchmesser von mehr als 75 Mikrometern haben und frei schwebend sein, um als aus Stammzellen gewonnene Kugel gezählt zu werden. Einige Zellen weisen jedoch eine begrenzte Proliferation auf und bilden PHE, die das Größenkriterium nicht erfüllen und nicht als aus Stammzellen gewonnene Kugeln gezählt werden. Ein Beispiel für einen solchen Asteroiden ist hier Nach seiner Entwicklung dargestellt.

Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Sehwissenschaften den Weg, um die Möglichkeit zu erforschen, retinale Stammzellen zur Behandlung von Netzhauterkrankungen einzusetzen.