Die Aufrechterhaltung Wolbachia in zellfreien Medium

Mein Name ist Courtney Ston. Ich arbeite an der Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health im Labor von Dr. Jason Rascon. Heute werden wir eine bakterielle Aufreinigung aus kultivierten Insektenzellen durchführen.

Es handelt sich tatsächlich um ein sehr einfaches Verfahren. Wir beginnen damit, unsere Zellen zu gewinnen, und zerstören dann die Membranen der eukaryotischen Wirtszellen physikalisch durch Lysierung mit Glaskügelchen. Anschließend verwenden wir die Differenzialzentrifugation, um die Bakterien von den Wirtszelltrümmern zu trennen.

Und dann verwenden wir eine Reihe von Filtrationsschritten, um weitere Wirtszellpartikel zu entfernen, sodass am Ende lediglich das gereinigte bakterielle Pellet übrig bleibt. Dies ist tatsächlich eine der wichtigsten Voraussetzungen. Es handelt sich um eine Zellkulturhaube, die dazu dient, alles steril zu halten, da Zellkulturen sehr anfällig für Kontaminationen sind.

Wir benötigen außerdem Zellkulturmedien, die Zellen selbst, und wir kultivieren sie in Plastikflaschen. Außerdem benötigen wir drei Millimeter große Glasperlen, 50-ml-Konizentrischenröhrchen und einen Zentrifugen, der in der Lage ist, Hochgeschwindigkeitszentrifugationen durchzuführen – etwa 18.000 G, um unsere Bakterien zu pelletieren, aber auch etwa 3.000 G oder 2.500 G, um unsere Wirtszellen zu pelletieren. Als Erstes beginnen wir daher mit unseren kultivierten Zellen.

Sie sind doch richtig gewachsen? Dies sind T-75-Kolben. Sie enthalten 15 ml Kulturmedium sowie uns selbst.

Als Erstes stören wir die Zellschicht auf und sammeln sie in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Dabei fährt man mehr oder weniger mit einem Abstreifer auf und ab, um alle Zellen in das Medium zu lösen. Sobald die Zellen im Medium sind, pipettieren wir sie einfach in das konische ML-Röhrchen.

Jetzt geben wir den beiden Zellsuspensionen jeweils drei Millimeter große Glaskugeln hinzu. Diese wurden autoklaviert und können tatsächlich wiederverwendet werden. Sie können gewaschen und in Bleichmittel eingeweicht sowie vor erneutem Gebrauch erneut autoklaviert werden.

Sie gießen vorsichtig, wobei Sie darauf achten, dass der Rand des Glas-B-Gefäßes den Rand des Zentrifugenröhrchens nicht berührt. In jedes Zentrifugenröhr geben wir anschließend etwa bis zur 5-Milliliter-Markierung Glasperlen hinein. Als Nächstes müssen wir die Zellen mechanisch aufbrechen, um die Bakterien in die Suspension freizusetzen.

Wir verwenden also einen Vortex und stellen ihn auf die höchste Vortex-Stufe ein, anschließend wirbeln wir fünf Minuten lang. Nun wirbeln wir die Zellen mit den drei Millimeter großen Glasperlen fünf Minuten lang und pipettieren anschließend den Überstand mit einer sauberen Pipette in ein sauberes und steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen ab. Wir gewinnen unsere neu erzeugte Suspension, die aus freigesetzten Bakterien und Lösung sowie aus gesamtem Zelltrümmern besteht.

Der nächste Schritt ist eine Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit, um das grobe Material zu pelletieren und die Bakterien in Suspension zu belassen. Dazu verwenden wir die Zentrifuge bei 2.500 ×g für 10 Minuten. Außerdem zentrifugieren wir bei vier Grad Celsius, um die Bildung des Pellets am Boden zu unterstützen.

Und so stellen wir es einfach hier hinein, stellen sicher, dass es ausgewogen ist, schließen es und zentrifugieren 10 Minuten lang. Ich habe nun unseren Überstand, der Zelltrümmer der Wirtszelle sowie die gereinigten Bakterien enthält, zentrifugiert. Dazu habe ich 10 Minuten bei 2.500 ×g zentrifugiert.

Und wie Sie sehen können, habe ich ein Pellet am Boden meines Röhrchens, das aus zellulärem Gewebeabfall besteht. Meine neu freigesetzten Bakterien befinden sich noch im Überstand, da die Zentrifugation nicht stark genug war, um auch sie zu pelletieren. Als Nächstes werde ich daher den Überstand abnehmen und durch einen Fünf-Mikrometer-Filter filtrieren.

Dies ist ein Fünf-Mikrometer-Filter, der auf jede Art von Spritze passt. Ich werde eine 30-ml-Spritze verwenden, ziehe zunächst den Kolben hoch und befestige dann die Spritze am Filter, ohne den eigentlichen Filter, insbesondere den unteren Bereich, zu berühren, da dieser steril bleiben muss. Die Verbindung erfolgt einfach durch Einschrauben der Spritze, danach wird der Kolben vorsichtig niedergedrückt, um die Überstandflüssigkeit durch den Filter und in unser Gefäß zu befördern.

Sie sollten nicht zu fest drücken, da Sie sonst tatsächlich den Filter beschädigen könnten, wodurch er nicht mehr funktioniert. Wenn Sie viel Druck aufwenden müssen, sollten Sie den Filter entfernen und ersetzen, da dies bedeutet, dass er mit viel Zelltrümmern verstopft ist. Zu diesem Zeitpunkt fügen wir, abhängig von unserem Volumen, als zusätzliche Methode zur Gewinnung einer sehr reinen Bakterienkultur normalerweise 250 Millimolar Saccharoselösung, die filtersterilisiert wurde, unserem Hochgeschwindigkeitszentrifugenröhrchen hinzu.

Füllen Sie die Flasche bis zu etwa mindestens 80 % ihrer Kapazität. Üblicherweise füllen wir sie bis in den Hals hinein. Diese Röhrchen müssen so voll sein, damit sie im Hochgeschwindigkeitszentrifugen nicht implodieren.

Okay, nun werden wir das Überstandsgemisch zentrifugieren und unsere gereinigten Bakterien bei 18.000 ×g in dieser Hochgeschwindigkeitszentrifuge pelletieren. Dazu stellen wir sicher, dass die Röhrchen natürlich ausgewogen platziert sind, und schließen dann den Deckel. Wir stellen die Zentrifugation auf 10 Minuten ein.

Und wir führen dies gerne bei 10 Grad Celsius oder darunter durch, was hier unsere eingestellte Temperatur ist. Die Winkelgeschwindigkeit für diesen spezifischen Rotor in der Zentrifuge beträgt 12,5 Umdrehungen pro Minute. Wir verfügen über eine Umrechnungstabelle, sodass die Zentrifugation bei etwa 18.670 ×g erfolgt. Nun haben wir die Hochgeschwindigkeitszentrifugation durchgeführt, um unsere gereinigten Bakterien als Pellet abzutrennen.

Wie Sie nun sehen können, haben wir ein schönes bakterielles Pellet am Boden unseres Hochgeschwindigkeitsröhrchens. Als Nächstes entfernen wir daher das Überstandsmaterial in einen Behälter für flüssige Abfälle. Anschließend müssen wir unsere Bakterien erneut suspendieren.

Ich werde es in zwei Millilitern unseres Kulturmediums resuspendieren, das Schneider-Insektenmedium ist, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum. Und ich werde das Pellet einfach durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren resuspendieren, bis alle Bakterien wieder in Lösung sind. Da unsere Bakterien nun wieder in Suspension vorliegen, werden wir noch einen weiteren Reinigungsschritt durchführen, um jegliche mögliche zelluläre Trümmer des Wirts zu entfernen.

Dazu verwenden wir einen 2,7-Mikrometer-Filter. Ich verwende gerne das Kunststoffgehäuse unseres Fünf-Mikrometer-Filters als Halterung. So können wir unsere Lösung aufnehmen, die Spritze auf den 2,7-Mikrometer-Filter schrauben und nun in ein Langzeitlagerungsgefäß filtrieren.

Wie bei dem anderen Filter drücken Sie den Kolben einfach sanft nach unten. So, jetzt haben wir unsere Lösung mit gereinigten Bakterien. Das nächste, was ich Ihnen zeigen werde, ist, wie wir die Vitalität testen.

Wir verwenden das Live-Dead-Bakterienvitalitätskit mit Hintergrundbeleuchtung von Molecular Probes. Dieses Kit enthält zwei Farbstoffe: Propidiumiodid und Cyto Nine. Propidiumiodid fluoresziert rot und färbt nur Bakterien, deren bakterielle Membran nicht vollständig intakt ist, während Cyto Nine alle Bakterien anfärbt.

Wenn Sie diese Bakterien unter dem mit fluoreszenzoptischem Gerät ausgestatteten Mikroskop betrachten, leuchten alle Bakterien grün, während eine Teilmenge, nämlich die toten Zellen, rot fluoresziert. Wir entnehmen eine kleine Portion aus unserer gereinigten Probe, und in diesem Fall entnehme ich lediglich 10 µL, gerade genug für eine Objektträgerpräparation. Anschließend gebe ich sie in zwei weitere hinein.

Dann füge ich unsere beiden anderen Farbstoffe hinzu, lediglich einen Mikroliter der Mischung aus Propidiumiodid und Cyto-Neun, zu unserer bakteriellen Suspension. Anschließend kann man die Probe 15 Minuten im Dunkeln inkubieren lassen. Wir haben jedoch festgestellt, dass man sie nahezu sofort aufnehmen und untersuchen kann, um die Ergebnisse zu sehen.

Okay, nun werde ich meine Objektträgerprobe mit den Bakterien, die mit der Hintergrundbeleuchtungs-Färbung für tote Zellen versehen sind, mikroskopisch untersuchen. Ich gebe die Probe auf meinen Objektträger, platziere ein Deckglas darauf und betrachte sie dann. Ich werde unseren rot-grün gemischten Filter verwenden, um die Vitalität meiner Bakterien beurteilen zu können.

Wenn ich den Verschluss öffne, sehe ich meine Bakterien, die mehr oder weniger wie nadelspitzen erscheinen. Doch hier erkenne ich, dass ungefähr 90 bis 95 % der Bakterien grün sind, während nur etwa 5 % rot sind. Wir haben also eine sehr hohe Vitalitätsrate, richtig?

Ich habe Ihnen soeben die Aufreinigung lebensfähiger Akia aus kultivierten Insektenzellen vorgestellt. Dieses Protokoll umfasste die physikalische Zerstörung eukaryotischer Wirtszellen und anschließend eine Differenzialzentrifugation zur Isolierung der gereinigten Bakterien sowie eine Reihe von Filtrationsschritten, um die Qualität der aufgereinigten Bakterien sicherzustellen und diese vollständig von allen Wirtszellbestandteilen zu befreien. Danach haben wir den Live-Dead-Assay mittels Durchstrahlung beschrieben, der zwei Farbstoffe verwendet, um die Lebensfähigkeit der Bakterien zu bewerten.

Sie können nun Ihre gereinigten Bakterien in einer Vielzahl von Anwendungen verwenden, einschließlich der Infektion anderer kultivierter Zellsysteme, um die Infektion eines spezifischen Systems zu erhöhen. Außerdem können Sie metabolische Studien oder zahlreiche andere Untersuchungen mit Ihren lebenden, gereinigten Bakterien durchführen.