Feeder-freie Adaption, Kultur und Passagierung der Menschenrechte iPS-Zellen mit Komplett KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, humane induzierte pluripotente Stammzellen an eine kultivierung ohne Futterzellen unter Verwendung eines vollständigen Knockout-Serumersatzes und eines Mediums ohne Futterzellen anzupassen und diese Kulturform aufrechtzuerhalten. Dies wird erreicht, indem zunächst Gelt-, TRX- oder Cell-Start-beschichtete Platten vorbereitet werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, Ihre IPS-Zellen von MEFs in ein Medium ohne Futterzellen mittels Disc-Space zu überführen.

Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, Ihre iPS-Zellen kontinuierlich ohne Futterzellen zu kultivieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die ein vergleichbares Zellwachstum und Stammzelleigenschaften wie bei Maus-Embryonal-Fibroblasten-Kulturen zeigen, nachgewiesen durch Immunfärbung mit Pluripotenzmarkern. Hallo, ich bin Kate Wagner von der GIBco-Seite bei Life Technologies.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass Sie Zeit sparen und die Konsistenz Ihrer Zellkultur erhöhen können, wenn Sie das Knockout-Serumersatzmittel während des gesamten Arbeitsablaufs verwenden. Die Produktfamilie der Knockout-Produkte umfasst heute eine vollständige Liste an Medien und Reagenzien für kultivierende Zellen, kultivierungsunterstützte, kultivierungsunterstützungsfreie und xeno-freie Bedingungen für humane embryonale Stammzellen, murine embryonale Stammzellen und induzierte pluripotente Stammzellen. KSR kann für die Gewinnung, das Wachstum, die Expansion, die Kryokonservierung sowie die ersten Schritte der Differenzierung verwendet werden.

In dem folgenden Video wird gezeigt, wie Sie Ihre Zellen unter zellfreien Bedingungen mit KSR anpassen und verpacken. Für die Anpassung und Verpackung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen unter zellfreien Bedingungen werden mit Gel TRX beschichtete Kulturschalen benötigt. Einen Tag vor der Herstellung dieser beschichteten Schalen eine Röhrchen Gelt TRX langsam auftauen, indem es über Nacht im Kühlschrank belassen wird. Am folgenden Tag das aufgetaute Gelt TRX im Verhältnis 1:100 in Basalmedium verdünnen, indem ein Milliliter Gel Rex in eine Flasche mit 99 Milliliter Basalmedium überführt wird. Die Lösung vorsichtig mischen.

Wir empfehlen, Knockout D-M-E-M-F 12 als Basalmedium zu verwenden, siehe jedoch den Protokolltext für andere Optionen. Bedecken Sie die gesamte Oberfläche jeder Kulturschale mit Gel Rex-Lösung. Geben Sie für jede 60-Millimeter-Schale 1,5 Milliliter Gel Trek-Lösung hinzu.

Inkubieren Sie die Petrischalen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Zusätzliche Platten können in Parafilm verpackt und bis zu vier Wochen im Kühlschrank aufbewahrt werden. Zusätzlich verdünntes Gelt TRX kann portioniert und bei minus 20 bis minus 80 Grad Celsius gelagert werden, wobei mehrfache Gefrier-Tau-Zyklen vor der Verwendung vermieden werden sollten.

Überführen Sie die mit gelt TRX beschichteten Schalen in eine Sicherheitswerkbank (Laminar-Flow) und lassen Sie sie auf Raumtemperatur equilibrieren. Bereiten Sie zusätzlich alle anderen benötigten Reagenzien vor und stellen Sie sicher, dass alle Medien auf 37 Grad Celsius temperiert und angemessen beimpft sind. Um humane IPCs an ein mittelfreies Kulturmedium anzupassen, führen Sie zunächst die Kultur durch.

Die iPS-Zellen befinden sich auf Meth-Fütterungszellen, bis sie 70 bis 80 % konfluent sind. Aspirieren Sie das Medium aus jeder 60-Millimeter-Kulturschale und geben Sie eine geeignete Menge an Dispase-Lösung hinzu, und zwar ein Milliliter. Inkubieren Sie die Schalen in diesem Fall bei 37 Grad Celsius für drei bis fünf Minuten.

Aspirieren Sie die Dispa-Lösung aus jeder Kulturschale und spülen Sie die Meth-Fütterzellen vorsichtig zwei- bis dreimal mit DPBS ab. Geben Sie anschließend eine geeignete Menge vollständigen Serumersatzmediums in jede Kulturschale. Mit einem Zellabstreifer werden die Zellen vorsichtig von der Oberfläche der Schale abgeschabt.

Sammeln Sie die Zellsuspension von jeder Schale in separate kegelförmige 15-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie jede Kulturschale mit einer geeigneten Menge vollständigem serumfreiem Medium und geben Sie die Spülflüssigkeit zu den kegelförmigen 15-Milliliter-Röhrchen mit der Zellsuspension. Zentrifugieren Sie die kegelförmigen 15-Milliliter-Röhrchen fünf Minuten bei Raumtemperatur mit 200 ×g, um die Zellen zu pelletieren.

Nach der Zentrifugation vorsichtig den Überstand abpipettieren und verwerfen, ohne das Zellpellet zu stören. Das Röhrchen vorsichtig anstoßen, um das Zellpellet vollständig vom Röhrchenboden zu lösen. Eine geeignete Menge vollständiges Serumersatzmedium ohne Futterzellen entsprechend dem gewünschten Aufteilungsverhältnis hinzufügen.

Und pellet vorsichtig resuspendieren. Die Zellklumpen nicht weiter zerkleinern, da kleinere Klumpen nicht gut an der Oberfläche anhaften. Jegliche Reste der Gel-TRE-Lösung aus den zuvor vorbereiteten mit Gel Rex beschichteten Kulturschalen absaugen und langsam eine geeignete Menge der Zellsuspension in jede Kulturschale geben.

Bewegen Sie die Kulturschale mehrmals hin und her sowie von Seite zu Seite, um die Zellen gleichmäßig auf der Oberfläche der Schale zu verteilen. Stellen Sie die Kulturschalen vorsichtig in einen 37 °C warmen Inkubator mit einer feuchten Atmosphäre mit 4 bis 6 % CO2 in Luft. Ersetzen Sie das verbrauchte Medium danach täglich, bis die Zellen etwa 70 bis 80 % konfluent sind.

Wenn die humanen induzierten pluripotenten Stammzellen, die in einem vollständigen serumfreien, feederfreien Medium wachsen, zu 70 bis 80 % konfluent sind, sind sie bereit für die Subkultivierung. Entfernen Sie gegebenenfalls differenzierte Zellen vor der Aufbereitung. Aspirieren Sie das verbrauchte Medium aus der 60-Millimeter-Kulturschale mit einer Pipette und waschen Sie die Zellen zweimal aus.

Mit DPBS vorsichtig ein Milliliter der vorgewärmten Scheiben-basierten Lösung der Kulturschale hinzufügen. Die Kulturschale schwenken, um die gesamte Zelloberfläche zu bedecken. Die Kultur bei 37 Grad Celsius für drei bis fünf Minuten inkubieren.

Als Nächstes die Dissoziationslösung absaugen und die Zellen vorsichtig zweimal mit DPBS waschen, komplettes Serumersatzmittel ohne Futterzellen hinzufügen und die Zellen vorsichtig von der Oberfläche der Kulturschale ablösen. Mit einem Zellabstreifer die Zellen in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen. Die Kulturschale zweimal mit komplettem Serumersatzmittel ausspülen.

Medium ohne Futterzellen vorsichtig darüber sprühen, um alle Zellen abzuwaschen, die sich nicht gelöst haben. Sammeln Sie das Medium aus beiden Spülgängen zusammen mit den Zellen in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten bei Raumtemperatur mit 200 × g, um die Zellen zu pelletieren, ohne das Zellpellet zu stören.

Den Überstand vorsichtig abpipettieren und verwerfen. Das Röhrchen sanft anstoßen, um den Zellpellet vollständig vom Röhrchenboden zu lösen. Die Zellen vorsichtig in komplettem Serumersatz resuspendieren.

Kulturmedium ohne Futterzellen mit einer fünf Milliliter-Serologiepipette. Nicht titrieren. Überführen Sie die Zellen in eine frische 60 Millimeter große, mit Gelt TRX beschichtete Petrischale im gewünschten Aufteilungsverhältnis.

Bewegen Sie die Kulturschale mehrmals vor und zurück sowie von Seite zu Seite, um die Zellen gleichmäßig auf der Oberfläche zu verteilen. Stellen Sie die Kulturschale am folgenden Tag in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius mit einer feuchten Atmosphäre aus vier bis 6 % Kohlendioxid in Luft. Ersetzen Sie das verbrauchte Medium vorsichtig durch kompletten Serumersatz.

Medium ohne Futterzellen zuführen, um Zelltrümmer zu entfernen. Danach täglich das verbrauchte Medium erneuern. Diese Phasenkontrastaufnahme zeigt humane induzierte pluripotente Stammzellen, die auf mit Gelt TRX beschichteten Kulturschalen mit vollständigem, serumfreiem Medium ohne Futterzellen kultiviert wurden.

Die IPC weisen eine Morphologie auf, die menschlichen embryonalen Stammzellen ähnelt und sich durch große Kerne und geringes Zytoplasma auszeichnet. Immunfärbungen zeigen, dass die in Medium mit Knockout-Serumersatz plus Wachstumsfaktorcocktail kultivierten IPC die pluripotenten Marker OCT4 und SSEA4 exprimieren. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man IPC unter Knockout-Serumersatz-Bedingungen ohne Fütterungszellen anpassen und kultivieren kann. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.