Name: Feeder-freie Adaption, Kultur und Passagierung der Menschenrechte iPS-Zellen mit Komplett KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Erfahren Sie die feeder-freie Kultur menschlicher iPS-Zellen mit KnockOut Serum Replacement Medium. Diese Methode ermöglicht reproduzierbares Zellwachstum und Erhalt der Pluripotenz für die Stammzellforschung.

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Hinweis: Um sterile Kultur Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden alle Verfahren in diesem Protokoll unter Verwendung von sterilen Laborpraxis durchgeführt und führte unter einer Laminar-Flow-Haube. Vor dem Start, sicherzustellen, dass alle Medien äquilibriert bis 37 ° C und entsprechend vergast. Vorbereitung Geltrex-beschichteten Kulturschalen Hinweis: siehe Anhang für die Nutzung von CELLstart beschichteten Kulturschalen <ol><li> Thaw eine Tube Geltrex (1 mL) langsam bei 2-8 ° C und verdünnt 1:100 in 99 ml Knockout D-MEM/F-12. Mischen Sie die Lösung vorsichtig. Hinweis: Einige iPS-Zelllinien kann eine andere Geltrex Verdünnung für ein optimales Wachstum benötigen. Siehe Anhang für alternative Verdünnungen. </li><li> Abdeckung der gesamten Oberfläche jeder Kulturschale mit dem Geltrex-Lösung (1 mL für eine 35-mm-Schale, 1,5 mL für eine 60-mm-Schale). </li><li> Seal jedes Gericht mit Parafilm zum Trocknen zu verhindern und inkubieren Sie die Gerichte für 1 Stunde bei 37 ° C. Hinweis: An dieser Stelle können Sie die Geltrex-beschichteten Kulturschalen bei 4 ° C lagern bis zu 1 Monat. Seal jedes Gericht mit Parafilm die Geltrex vor dem Austrocknen zu verhindern. </li><li> Vor dem Einsatz, übertragen Sie die Geltrex-beschichtete Platten zu einem Laminarströmungshaube und es ihnen ermöglichen, auf Raumtemperatur (ca. 1 Stunde) ausgleichen. </li></ol> Vorbereitung Komplette KnockOut SR Feeder-freiem Medium <ol><li> Zur Vorbereitung 1 mL von 10 pg / mL Grundlegende FGF-Lösung, aseptisch mischen die unten aufgeführten Komponenten. Aliquot der Lösung und bei -20 ° C bis zu 6 Monaten. <table border="0"><tbody><tr><td> Grundlegende FGF </td><td> 10 ug </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 990 ul </td></tr><tr><td> 10% BSA </td><td> 10 l </td></tr></tbody></table> Hinweis: BSA mit HSA oder Knockout SR in der gleichen Konzentration ersetzt werden. </li><li> Zur Vorbereitung 50 ml 2 mg / mL Dispase-Lösung, aseptisch mischen die unten aufgeführten Komponenten. Filter sterilisieren der Lösung und lagern bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen. <table border="0"><tbody><tr><td> Dispase </td><td> 100 mg </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 50 mL </td></tr></tbody></table></li><li> Zu 100 ml komplette KnockOut SR Feeder-Free (KSR-FF) Medium aseptisch verbinden die Komponenten in der folgenden Tabelle aufgeführten vorzubereiten. <table border="1"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> Lager-Konzentration </td><td> Endkonzentration </td><td> Volumen </td></tr><tr><td> Knockout DMEM/F12 (Kat.-Nr. 12660-012) </td><td> - </td><td> 1X </td><td> 76,8 mL </td></tr><tr><td> Glutamax-I (Kat. Nr. 35050-061) </td><td> 200 mM </td><td> 2 mM </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> KnockOut SR (Kat.-Nr. 10828-028) </td><td> - </td><td> 20% </td><td> 20 mL </td></tr><tr><td> KnockOut SR-GFC (Kat.-Nr. A10580-01) </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> bFGF (Kat.-Nr. PHG0024) </td><td> 10 ug / mL </td><td> 20 ng / mL </td><td> 200 ul </td></tr></tbody></table> Sie können die KSR-FF Medium bei 2-8 ° C lagern bis zu einer Woche. </li><li> Kurz vor pre-Gleichgewicht der gesamten mittel-bis Temperatur und Gase, aseptisch fügen Sie die erforderlichen Volumen von 2 Mercaptoethanol (55 mM Lager-Konzentration) für eine 0,1 mM Endkonzentration. Zum Beispiel auf 100 ml KSR-FF Medium herzustellen add 182 uL 55 mM 2-Mercaptoethanol (1:550 Verdünnung) Alternativ kann die 2-Mercaptoethanol zum 1X fertig zugesetzt werden und bei 2-8 ° C für bis zu einer Woche. </li></ol> Anpassung IPSCs zu KSR-FF Medium <ol><li> Vor Beginn der Pre-Gleichgewicht Ihrer Geltrex beschichtete Platten auf Raumtemperatur in der Motorhaube. </li><li> Kultur der IPSCs am MEF Feeder-Zellen, bis sie 70-80% konfluent. Bitte beachten Sie die GIBCO embryonalen Maus-Fibroblasten-Handbuch für MEF-basierte Kultur-Protokolle. </li> Pre-warm das erforderliche Volumen der Dispase in einem 37 ° C Wasserbad. Siehe Tabelle 1 unten für Details auf den Datenträgern erforderlich. <li> Pre-Gleichgewicht das erforderliche Volumen des KSR-FF in einem 37 ° C Wasserbad for15 min. Siehe Tabelle 1 unten für Details auf den Datenträgern erforderlich. </li><li> Saugen Sie das Medium von den Kulturschalen, und fügen Sie eine entsprechende Menge an Dispase-Lösung. Inkubieren Sie die Speisen bei 37 ° C für 3-5 Minuten. </li><li> Saugen Sie das Dispase-Lösung aus jeder Kultur Gefäß und waschen Sie die MEF Feeder-Zellen vorsichtig mit D-PBS (2 bis 3 mal). </li><li> Fügen Sie einen angemessenen Betrag von kompletten KnockOut SR-Medium pro Kulturgefäß. Verwenden Sie eine Zelle Schaber oder einer 5-ml-Pipette vorsichtig kratzen die Zellen von der Oberfläche des Kulturgefäßes. Hinweis: siehe Anhang alternative Anpassung Protokolle für schwer zu iPS-Zelllinien anpassen, </li><li> Sammeln Sie die Zellsuspension aus jeder Kulturschale in verschiedene 15 ml konische Röhrchen. Spülen Sie jedes Kulturgefäß mit einer entsprechenden Menge von kompletten KnockOut SR Medium, und fügen Sie die D-PBS spülen Medium in den 15 ml konische Röhrchen mit der Zellsuspension. Seien Sie vorsichtig, nicht auf die Zellklumpen in einzelne Zellen zu brechen </li><li> Zentrifugieren Sie die 15 ml konische Röhrchen bei 200 xg für 5 Minuten auf dem Pellet IPSCs. </li><li> Saugen Sie den Überstand aus der iPSC Pellet. Das Pellet in einer entsprechenden Menge an KSR-FF-Medium nach dem Split-Verhältnis (Tabelle 1). Zerbrechen Sie das Zellklumpen auf eine kleinere Größe, da die kleineren Klumpen nicht gut befestigen zu tun, um die Oberfläche. Hinweis: Wir empfehlen eine Split-Verhältnis von 1:2 für die ersten 3 Stellen nach dem IPSCs wurden direkt aus dem iPSC MEF Kulturmedium KSR-FF Medium passagiert. Normalerweise wird ein Split-Verhältnis von 1.03 bis 01.05 angebracht, aber die Passage bei 1:2 sichert die höhere Dichte der Zellen benötigt bei der Anpassung in ein Feeder-freien Kultur. </li><li> Vor dem Ausplattieren der IPSCs auf Geltrex beschichtete Platten, absaugen Rest Geltrex Lösung aus dem vorbeschichteten Schüssel geben und langsam eine entsprechende Menge an Zellsuspension jeder Kulturschale. Hinweis: nicht ausspülen Gerichte vor dem Beschichten. </li><li> Bewegen Sie die Kulturschale hin und her und hin und her mehrere Male, um die Zellen auf der Oberfläche der Schale zu verteilen. Sanft statt der Kulturschale in einem 37 ° C Inkubator mit einer angefeuchteten Atmosphäre von 4 bis 6% CO 2 in Luft. Ersetzen Sie die verbrauchte Medium mit KSR-FF jeden Tag. </li></ol> Passagierung menschlichen iPS-Zellen mit KSR-FF <ol start="13"><li> Beachten Sie die menschliche IPSCs wachsen komplette KSR-FF unter dem Mikroskop, um zu bestätigen, dass die Zellen 70-80% konfluent und bereit, subkultiviert werden. Siehe Abbildung 1. Hinweis: Wenn Kolonien zu dicht oder zu groß werden, tritt stärkere Differenzierung. </li><li> Schneiden Sie und entfernen Sie alle differenzierten iPSC Kolonien vor Passage der Kultur. </li><li> Pre-warm das erforderliche Volumen der Dispase in einem 37 ° C Wasserbad. Siehe Tabelle 1 unten für Details auf den Datenträgern erforderlich. </li><li> Pre-Gleichgewicht das erforderliche Volumen des KSR-FF in einem 37 ° C Wasserbad for15 min. Siehe Tabelle 1 unten für Details auf den Datenträgern erforderlich. </li><li> Saugen Sie das verbrauchte Medium aus dem Kulturgefäß mit einer Pipette, und spülen Sie die Zellen zweimal mit D-PBS. </li><li> Vorsichtig fügen vorgewärmten Dispase-Lösung, um die Kultur Gefäß (z. B. 1 ml Dispase-Lösung pro 60-mm Kulturschale). Swirl das Kulturgefäß zu beschichten die gesamte Zelloberfläche. </li><li> Inkubieren Sie die Behälter bei 37 ° C für 3 Minuten. </li><li> Entfernen Sie das Gefäß aus dem Inkubator, absaugen Dispase-Lösung und vorsichtig waschen der Zellen mit D-PBS. </li><li> Vorsichtig kratzen die Zellen von der Oberfläche der Kulturschale mit einem Zellschaber, und übertragen Sie die Zellen in ein steriles 15 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Spülen Sie die Kulturschale zweimal mit KSR-FF, sanft "Abspritzen" alle Zellen, die nicht getrennt haben. Pool der Spül-Medium mit den Zellen in der 15 ml Tube. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 200 xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur die Zellen zu pelletieren. </li><li> Vorsichtig absaugen der Überstand ohne die Zellpellet und entsorgen Sie sie. </li><li> Gently Flick das Rohr vollständig verdrängen das Zellpellet aus dem Rohrboden. </li><li> Vorsichtig die Zellen in voräquilibriert KSR-FF mit einem 5 ml serologischen Pipette. Nicht verreiben. Hinweis: Es ist entscheidend, um den Schritt in die sanft resuspendieren ohne Anwendung von Gewalt, um Schäden zu vermeiden. </li><li> Übertragen Sie die Zellen in ein frisches 60-mm Geltrex-beschichtete Schale an der gewünschten Teilungsverhältnis und bewegen Sie die Kulturschale hin und her und hin und her mehrere Male, um die Zellen auf ihrer Oberfläche zu verteilen. </li><li> Legen Sie die Kulturschale in einem 37 ° C Inkubator mit einer angefeuchteten Atmosphäre von4 bis 6% CO 2 in Luft. </li><li> Am nächsten Tag sanft ersetzen das verbrauchte Medium mit KSR-FF, um Zelltrümmer zu entfernen. Ersetzen Sie die verbrauchte Medium Alltag danach. Beachten Sie die iPS-Zellen täglich und Passage sie nach Bedarf (ca. alle 4-5 Tage). Passagieren wird empfohlen, wenn die Zellen 70-80% Konfluenz erreichen. Für iPS-Zellen die Kryokonservierung und Auftauen zu unserem Protokoll beziehen sich unter dem Titel "Kryokonservierung und Wiederherstellen von Human iPS-Zellen unter Verwendung Komplette KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium". </li></ol> Erwartete Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2236/2236fig1.jpg" alt="Zellkultur unter dem Mikroskop; Untersuchung des Zellwachstums; Mikroskopische Bildgebung; biologische Forschung." data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Die Phasenkontrast-Abbildung unten zeigt IPSCs auf Geltrex-beschichteten Kulturschalen mit kompletten KnockOut Serum Ersatz Feeder-Free-Medium. Die IPSCs weisen Morphologie ähnlich hESCs, von großen Kernen und wenig Zytoplasma charakterisiert. (40fache Vergrößerung) <table border="1"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> 35mm Dish </td><td> 60mm Dish </td><td> 100mm Dish </td></tr><tr valign="top"><td> Komplette KnockOut SR Medium </td><td> 2 mL </td><td> 4 mL </td><td> 10 mL </td></tr><tr valign="top"><td> Geltrex Lösung </td><td> 1 mL </td><td> 1,5 ml </td><td> 4-5 ml </td></tr><tr valign="top"><td> Dispase </td><td> 0,5 ml </td><td> 1 mL </td><td> 3-4 mL </td></tr><tr valign="top"><td> D-PBS für das Spülen </td><td> 2 mL </td><td> 4 mL </td><td> 10 mL </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Empfohlene Volumes <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2236/2236appendix.pdf">Bitte klicken Sie hier, um die Anlage zu sehen</a> .

<ol><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li>
<li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li>
<li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li>
<li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnli%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Ausgeschaltetes DMEM/F12</td><td></td><td>Cat. Nr. 12660-012</td><td>Hinweis: siehe Anhang zur Verwendung alternativer DMEM-Produkte</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td></td><td>Cat. Nr. 35050-061</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut-Serumersatz</td><td></td><td>KnockOut SR, Cat. Nr. 10828-028</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut-Serumersatz-Wachstumsfaktor-Cocktail</td><td></td><td>KnockOut SR-GFC, Cat. Nr. A10580-01</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic, human rekombinantes Protein, 10 &amp;mu;g</td><td></td><td>bFGF, Cat. Nr. PHG0024</td><td>Hinweis: siehe Anhang für alternative bFGF-Packungsgrößen.</td></tr><tr><td>2-Mercapt&amp;#8211;ethanol</td><td></td><td>Cat. Nr. 21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td></td><td>Cat. Nr. 17105-041</td><td>Hinweis: siehe Anhang für alternative Passagierungsmethoden.</td></tr><tr><td>Geltrex hESC-qualifizierte reduzierte Wachstumsfaktor-Basalmembranmatrix, 1 mL</td><td></td><td>Cat. Nr. A10480-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s phosphatgepufferte Salzlösung (D-PBS) ohne Calcium und Magnesium</td><td></td><td>Cat. Nr. 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Steriler Zellkulturhaube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brutschrank eingestellt auf 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettenhilfsgerät (Pipette-Aid)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad eingestellt auf 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile serologische Pipetten (5 mL, 10 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15-mL-Zentrifugenröhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60-mm-Zellkulturschalen mit Behandlung für Zellkultur</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

feeder-freie adaption, kultur und passagierung der menschenrechte ips-zellen mit komplett knockout serum ersatz feeder-freiem medium

Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

Die Entdeckung im Jahr 2006, dass Mensch und Maus-Fibroblasten umprogrammiert könnte zu iPS-Zellen 1-3 mit Qualitäten bemerkenswert ähnlich wie embryonale Stammzellen zu erzeugen ist eine wertvolle neue Quelle für pluripotente Zellen für die Wirkstoffforschung, Zell-Therapie und Grundlagenforschung geschaffen. GIBCO Medien und Reagenzien sind an der Spitze der pluripotenten Stammzellen seit Jahren. Knockout DMEM mit Knockout Serum Replacement ergänzt wird das Medium der Wahl für die embryonalen Stammzellen das Wachstum und nun iPS Zellkultur 3-9. Dieser Goldstandard Medien kann nun für Feeder-freien Kultur mit der Zugabe von Knockout SR Growth Factor Cocktail verwendet werden. Traditionelle menschliche ES-und iPS-Zellkultur-Methoden erfordern den Einsatz von Maus oder humanen Fibroblasten Feederschichten oder Feeder-konditioniertem Medium. Diese Kultur Methoden sind arbeitsintensiv, hart zu skalieren und es ist schwierig, Hüften Zellen undifferenziert wegen der undefinierten Zustand zu erhalten. Invitrogen hat Knockout SR Growth Factor Cocktail entwickelt, damit Sie auf einfache Weise Übergang Hüfte Zellkulturen Feeder-free unter Beibehaltung Ihrer Benutzung der Knockout SR.

Das folgende Protokoll enthält Anweisungen für die Anpassung menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) zu Feeder-freien Kultur mit kompletten KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium (KSR-FF). Einmal angepasst, Anweisungen für die kontinuierliche Wartung sind ebenfalls vorhanden.

Feeder-freie Adaption, Kultur und Passagierung der Menschenrechte iPS-Zellen mit Komplett KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium

Die Entdeckung im Jahr 2006, dass menschliche und murine Fibroblasten reprogrammiert werden können, um iPS-Zellen 1-3 mit Eigenschaften zu generieren, die denen embryonaler Stammzellen bemerkenswert ähnlich sind ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, humane induzierte pluripotente Stammzellen an eine kultivierung ohne Futterzellen unter Verwendung eines vollständigen Knockout-Serumersatzes und eines Mediums ohne Futterzellen anzupassen und diese Kulturform aufrechtzuerhalten. Dies wird erreicht, indem zunächst Gelt-, TRX- oder Cell-Start-beschichtete Platten vorbereitet werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, Ihre IPS-Zellen von MEFs in ein Medium ohne Futterzellen mittels Disc-Space zu überführen.Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, Ihre iPS-Zellen kontinuierlich ohne Futterzellen zu kultivieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die ein vergleichbares Zellwachstum und Stammzelleigenschaften wie bei Maus-Embryonal-Fibroblasten-Kulturen zeigen, nachgewiesen durch Immunfärbung mit Pluripotenzmarkern. Hallo, ich bin Kate Wagner von der GIBco-Seite bei Life Technologies.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass Sie Zeit sparen und die Konsistenz Ihrer Zellkultur erhöhen können, wenn Sie das Knockout-Serumersatzmittel während des gesamten Arbeitsablaufs verwenden. Die Produktfamilie der Knockout-Produkte umfasst heute eine vollständige Liste an Medien und Reagenzien für kultivierende Zellen, kultivierungsunterstützte, kultivierungsunterstützungsfreie und xeno-freie Bedingungen für humane embryonale Stammzellen, murine embryonale Stammzellen und induzierte pluripotente Stammzellen. KSR kann für die Gewinnung, das Wachstum, die Expansion, die Kryokonservierung sowie die ersten Schritte der Differenzierung verwendet werden.In dem folgenden Video wird gezeigt, wie Sie Ihre Zellen unter zellfreien Bedingungen mit KSR anpassen und verpacken. Für die Anpassung und Verpackung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen unter zellfreien Bedingungen werden mit Gel TRX beschichtete Kulturschalen benötigt. Einen Tag vor der Herstellung dieser beschichteten Schalen eine Röhrchen Gelt TRX langsam auftauen, indem es über Nacht im Kühlschrank belassen wird. Am folgenden Tag das aufgetaute Gelt TRX im Verhältnis 1:100 in Basalmedium verdünnen, indem ein Milliliter Gel Rex in eine Flasche mit 99 Milliliter Basalmedium überführt wird. Die Lösung vorsichtig mischen.Wir empfehlen, Knockout D-M-E-M-F 12 als Basalmedium zu verwenden, siehe jedoch den Protokolltext für andere Optionen. Bedecken Sie die gesamte Oberfläche jeder Kulturschale mit Gel Rex-Lösung. Geben Sie für jede 60-Millimeter-Schale 1,5 Milliliter Gel Trek-Lösung hinzu.Inkubieren Sie die Petrischalen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Zusätzliche Platten können in Parafilm verpackt und bis zu vier Wochen im Kühlschrank aufbewahrt werden. Zusätzlich verdünntes Gelt TRX kann portioniert und bei minus 20 bis minus 80 Grad Celsius gelagert werden, wobei mehrfache Gefrier-Tau-Zyklen vor der Verwendung vermieden werden sollten.Überführen Sie die mit gelt TRX beschichteten Schalen in eine Sicherheitswerkbank (Laminar-Flow) und lassen Sie sie auf Raumtemperatur equilibrieren. Bereiten Sie zusätzlich alle anderen benötigten Reagenzien vor und stellen Sie sicher, dass alle Medien auf 37 Grad Celsius temperiert und angemessen beimpft sind. Um humane IPCs an ein mittelfreies Kulturmedium anzupassen, führen Sie zunächst die Kultur durch.Die iPS-Zellen befinden sich auf Meth-Fütterungszellen, bis sie 70 bis 80 % konfluent sind. Aspirieren Sie das Medium aus jeder 60-Millimeter-Kulturschale und geben Sie eine geeignete Menge an Dispase-Lösung hinzu, und zwar ein Milliliter. Inkubieren Sie die Schalen in diesem Fall bei 37 Grad Celsius für drei bis fünf Minuten.Aspirieren Sie die Dispa-Lösung aus jeder Kulturschale und spülen Sie die Meth-Fütterzellen vorsichtig zwei- bis dreimal mit DPBS ab. Geben Sie anschließend eine geeignete Menge vollständigen Serumersatzmediums in jede Kulturschale. Mit einem Zellabstreifer werden die Zellen vorsichtig von der Oberfläche der Schale abgeschabt.Sammeln Sie die Zellsuspension von jeder Schale in separate kegelförmige 15-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie jede Kulturschale mit einer geeigneten Menge vollständigem serumfreiem Medium und geben Sie die Spülflüssigkeit zu den kegelförmigen 15-Milliliter-Röhrchen mit der Zellsuspension. Zentrifugieren Sie die kegelförmigen 15-Milliliter-Röhrchen fünf Minuten bei Raumtemperatur mit 200 ×g, um die Zellen zu pelletieren.Nach der Zentrifugation vorsichtig den Überstand abpipettieren und verwerfen, ohne das Zellpellet zu stören. Das Röhrchen vorsichtig anstoßen, um das Zellpellet vollständig vom Röhrchenboden zu lösen. Eine geeignete Menge vollständiges Serumersatzmedium ohne Futterzellen entsprechend dem gewünschten Aufteilungsverhältnis hinzufügen.Und pellet vorsichtig resuspendieren. Die Zellklumpen nicht weiter zerkleinern, da kleinere Klumpen nicht gut an der Oberfläche anhaften. Jegliche Reste der Gel-TRE-Lösung aus den zuvor vorbereiteten mit Gel Rex beschichteten Kulturschalen absaugen und langsam eine geeignete Menge der Zellsuspension in jede Kulturschale geben.Bewegen Sie die Kulturschale mehrmals hin und her sowie von Seite zu Seite, um die Zellen gleichmäßig auf der Oberfläche der Schale zu verteilen. Stellen Sie die Kulturschalen vorsichtig in einen 37 °C warmen Inkubator mit einer feuchten Atmosphäre mit 4 bis 6 % CO2 in Luft. Ersetzen Sie das verbrauchte Medium danach täglich, bis die Zellen etwa 70 bis 80 % konfluent sind.Wenn die humanen induzierten pluripotenten Stammzellen, die in einem vollständigen serumfreien, feederfreien Medium wachsen, zu 70 bis 80 % konfluent sind, sind sie bereit für die Subkultivierung. Entfernen Sie gegebenenfalls differenzierte Zellen vor der Aufbereitung. Aspirieren Sie das verbrauchte Medium aus der 60-Millimeter-Kulturschale mit einer Pipette und waschen Sie die Zellen zweimal aus.Mit DPBS vorsichtig ein Milliliter der vorgewärmten Scheiben-basierten Lösung der Kulturschale hinzufügen. Die Kulturschale schwenken, um die gesamte Zelloberfläche zu bedecken. Die Kultur bei 37 Grad Celsius für drei bis fünf Minuten inkubieren.Als Nächstes die Dissoziationslösung absaugen und die Zellen vorsichtig zweimal mit DPBS waschen, komplettes Serumersatzmittel ohne Futterzellen hinzufügen und die Zellen vorsichtig von der Oberfläche der Kulturschale ablösen. Mit einem Zellabstreifer die Zellen in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen. Die Kulturschale zweimal mit komplettem Serumersatzmittel ausspülen.Medium ohne Futterzellen vorsichtig darüber sprühen, um alle Zellen abzuwaschen, die sich nicht gelöst haben. Sammeln Sie das Medium aus beiden Spülgängen zusammen mit den Zellen in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten bei Raumtemperatur mit 200 × g, um die Zellen zu pelletieren, ohne das Zellpellet zu stören.Den Überstand vorsichtig abpipettieren und verwerfen. Das Röhrchen sanft anstoßen, um den Zellpellet vollständig vom Röhrchenboden zu lösen. Die Zellen vorsichtig in komplettem Serumersatz resuspendieren.Kulturmedium ohne Futterzellen mit einer fünf Milliliter-Serologiepipette. Nicht titrieren. Überführen Sie die Zellen in eine frische 60 Millimeter große, mit Gelt TRX beschichtete Petrischale im gewünschten Aufteilungsverhältnis.Bewegen Sie die Kulturschale mehrmals vor und zurück sowie von Seite zu Seite, um die Zellen gleichmäßig auf der Oberfläche zu verteilen. Stellen Sie die Kulturschale am folgenden Tag in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius mit einer feuchten Atmosphäre aus vier bis 6 % Kohlendioxid in Luft. Ersetzen Sie das verbrauchte Medium vorsichtig durch kompletten Serumersatz.Medium ohne Futterzellen zuführen, um Zelltrümmer zu entfernen. Danach täglich das verbrauchte Medium erneuern. Diese Phasenkontrastaufnahme zeigt humane induzierte pluripotente Stammzellen, die auf mit Gelt TRX beschichteten Kulturschalen mit vollständigem, serumfreiem Medium ohne Futterzellen kultiviert wurden.Die IPC weisen eine Morphologie auf, die menschlichen embryonalen Stammzellen ähnelt und sich durch große Kerne und geringes Zytoplasma auszeichnet. Immunfärbungen zeigen, dass die in Medium mit Knockout-Serumersatz plus Wachstumsfaktorcocktail kultivierten IPC die pluripotenten Marker OCT4 und SSEA4 exprimieren. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man IPC unter Knockout-Serumersatz-Bedingungen ohne Fütterungszellen anpassen und kultivieren kann. Das war's also.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt die Einzelheiten des Verfahrens zur Kryokonservierung humanen iPS-Zellen in KnockOut SR Kryokonservierungsmedium und Gewinnung dieser Zellen in völliger KnockOut SR Feeder Free (KSR-FF) mittel-oder Feeder-basierte KnockOut SR Medium.

Kryokonservierung und Wiederherstellen von Human iPS-Zellen unter Verwendung Komplette KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium

Die Qualität von embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) durch die rechte Mausstamm wie CF-1 bestimmt. Pluripotenz-unterstützende MEFs und konditionierte Medien (CM) aus diesen gewonnenen Erkenntnisse sollten den optimalen Konzentrationen von Activin A, Gremlin und TGFß1 für die Activin / Nodal und FGF Signalwege erforderlich, um kooperativ zu halten Selbsterneuerung und Pluripotenz enthalten.

Vorbereitung von embryonalen Maus-Fibroblasten-Zellen zum Kultivieren von humanen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen

Trotz anhaltender Bemühungen, um den Übergang Kulturen Feeder-freien Bedingungen, bleiben die Ableitung und Kultur von humanen embryonalen Stammzellen (hES) weitgehend abhängig von Co-Kulturen mit embryonalen Feeder (MEF). Hier zeigen wir eine neuartige Methode zur schnellen Beseitigung Zubringer vom hESC Kulturen vor den Experimenten.

Schnelle Fibroblast Entfernung aus High Density humanen embryonalen Stammzellen Kulturen

Neuralleiste (NC)-Zellen aus humanen pluripotenten Stammzellen (hpSC) abgeleitet haben ein großes Potenzial für die Modellierung menschlichen Entwicklung und Krankheit und für die Zell-Ersatz-Therapien. Hier ein Feeder-freie Adaption des derzeit weit...

Feeder freie Ableitung von Neural Crest Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Dieses Protokoll liefert ein Verfahren für die Gewinnung von embryonalen Maus-Stammzellen (MESC) -conditioned Medium (MESC-CM), abgeleitet von Serum (fötales Rinderserum, FBS) - und Feeder (Maus embryonale Fibroblasten, MEFs) -freien Bedingungen für eine Zelle -freie Ansatz. Es kann für die Behandlung von Hautalterung und Alterungs-assoziierten Erkrankungen Anwendung finden.

Sammlung von Serum- und Feeder-freie Maus embryonale Zellen konditionierten Medium für eine zellfreie Ansatz Stem

Die regelmäßige Charakterisierung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs), um die Aufrechterhaltung ihres pluripotenten Zustands zu gewährleisten, ist ein wichtiger Schritt, bevor diese Zellen für andere Anwendungen verwendet werden. Hier beschreiben wir eine Methode zur kleinskaligen Vermehrung von humanen iPSCs, die speziell entwickelt wurde, um ihre einfache und routinemäßige Charakterisierung mittels Immunzytochemie zu ermöglichen.

Kleines Vermehrung von menschlichen iPS-Zellen in Serum-freien Bedingungen für die Routine Immunzytochemische Charakterisierung

Die Produktion von spezialisierten netzhautzellen aus pluripotenten Stammzellen ist ein Wendepunkt in der Entwicklung der Stammzell-Therapie für Erkrankungen der Netzhaut. Der vorliegende Beitrag beschreibt eine einfache Methode für eine effiziente Erzeugung von retinalen Organellen und retinalen Pigment Epithel für Grund-, translationalen und klinischen Forschung.

Definierten Xeno-frei und Feeder-freie Kulturbedingungen für die Generation der menschlichen iPSC-abgeleitete Retinal Zellmodellen

Wir stellen Ihnen hier ein Protokoll für die Differenzierung der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen in jeder Somiten Derivat (Myotom, Sklerotom Dermatome und Syndetome) in chemisch definierten Bedingungen, die hat Anwendungen in zukünftigen Krankheit Modellierung und zellbasierte Therapien in der orthopädischen Chirurgie.

In vitro-Generation der Somiten Derivate aus menschlichen induzierten Zellen pluripotenten Stammzellen

Um die Einschränkungen zu vermeiden, die mit der enzymatischen oder mechanischen Passage von humanen embryonalen Stammzellen (hESCs) und humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) verbunden sind, die auf Feederzellen kultiviert wurden, haben wir eine schnelle, effektive, kosteneffiziente und ertragreiche Methode zur Gewinnung von hESC- oder hiPSC-Kolonien etabliert, die auf einer Feederzellschicht menschlicher Vorhautfibroblasten gehalten werden, indem wir EDTA-vermittelte...

Schnelle, kostengünstige, enzymfreie Passage von humanen pluripotenten Stammzellen auf Feederzellen durch Ethylendiamintetraessigsäure-vermittelte Disadhäsion

Hier stellen wir eine Methode zur Differenzierung und Erweiterung von humanen iPSC-abgeleiteten chimären Antigenrezeptoren (CAR)-exprimierenden natürlichen Killerzellen mit verbesserter Abtötung gegen verschiedene Malignome vor. Dieses Protokoll demonstriert die Differenzierung und Expansion von für natürliche Killer (NK) optimierten iPSC-abgeleiteten CAR-NK-Zellen und die Messung der Antitumoraktivität gegen verschiedene Tumorzelllinien.

Fortschritte bei humanen induzierten pluripotenten Stammzellen, die von chimären Antigenrezeptoren abgeleitet werden und natürliche Killerzellen exprimieren

Erfahren Sie die feeder-freie Kultur menschlicher iPS-Zellen mit KnockOut Serum Replacement Medium. Diese Methode ermöglicht reproduzierbares Zellwachstum und Erhalt der Pluripotenz für die Stammzellforschung.

Feeder-freie Adaption, Kultur und Passagierung der Menschenrechte iPS-Zellen mit Komplett KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium (Video) | JoVE Journal

Feeder-freie Adaption, Kultur und Passagierung der Menschenrechte iPS-Zellen mit Komplett KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium

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