Feeder-freie Adaption, Kultur und Passagierung der Menschenrechte iPS-Zellen mit Komplett KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium

Das folgende Protokoll enthält Anweisungen für die Anpassung menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) zu Feeder-freien Kultur mit kompletten KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium (KSR-FF). Einmal angepasst, Anweisungen für die kontinuierliche Wartung sind ebenfalls vorhanden.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, humane induzierte pluripotente Stammzellen an die Feeder-freie Kultur unter Verwendung eines vollständigen Knockout-Serumersatzes und eines Feeder-freien Mediums anzupassen und zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zunächst gelt-, TRX-beschichtete oder zellstartbeschichtete Platten vorbereitet werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, Ihr IPS unter Verwendung von Speicherplatz von MEFs auf ein einzugsfreies Medium zu übertragen.

Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, Ihre IPS-Zellen kontinuierlich frei von Feedern zu halten. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die ein ähnliches Zellwachstum und eine ähnliche Stammzellbildung zeigen, die bei Meth-Kulturen durch Immunfärbung mit pluripotenten Markern gefunden wurden. Hallo, ich bin Kate Wagner von der GIB Co-Site bei Life Technologies.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Techniken besteht darin, dass Sie Zeit sparen und die Konsistenz in Ihrer Zellkultur erhöhen können, wenn Sie während Ihres gesamten Arbeitsablaufs einen Knockout-Serumersatz verwenden. Heute umfasst die Familie der Knockout-Produkte eine vollständige Liste von Medien und Reagenzien für Feeder-basierte, Feeder-freie und Xeno-freie Bedingungen für humane embryonale Stammzellen, embryonale Stammzellen der Maus und induzierte pluripotente Stammzellen. KSR kann für das Wachstum der Ableitung, die Expansion, die Kryokonservierung und die ersten Schritte der Differenzierung verwendet werden.

Das folgende Video zeigt Ihnen, wie Sie Ihre Zellen mit KSR unter feederfreien Bedingungen anpassen und verpacken. Mit Gel TRX beschichtete Kulturschalen werden für die Anpassung und Verpackung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen unter feederfreien Bedingungen einen Tag vor der Zubereitung dieser beschichteten Schalen benötigt. Tauen Sie ein Röhrchen Gelt TRX langsam auf, indem Sie es am folgenden Tag über Nacht im Kühlschrank belassen. Verdünnen Sie das Röhrchen mit Gelt TRX um 100 auf 100 in Basalmedium, indem Sie einen Milliliter Gel Rex in eine Flasche mit 99 Millilitern Basalmedium umfüllen. Mittel. Mischen Sie die Lösung vorsichtig.

Wir empfehlen die Verwendung von knockout D-M-E-M-F 12 als Basalmedium, aber bitte beachten Sie den Protokolltext für andere Optionen. Bedecken Sie die gesamte Oberfläche jeder Kulturschale mit Gel-Rex-Lösung. Für jede 60-Millimeter-Schale fügen Sie 1,5 Milliliter Gel Trek Solution hinzu.

Inkubieren Sie die Gerichte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Zusätzliche Teller können in Parfum eingewickelt und bis zu vier Wochen im Kühlschrank aufbewahrt werden. Zusätzliches verdünntes Gelt TRX kann zugeteilt und bei minus 20 bis minus 80 Grad Celsius gelagert werden, aber mehrere Gefrier-Auftauzyklen sollten vor der Verwendung vermieden werden.

Füllen Sie die mit gelt TRX überzogenen Gerichte in eine Zitronen- oder Durchflusshaube und lassen Sie sie auf Raumtemperatur ausgleichen. Bereiten Sie außerdem alle anderen erforderlichen Reagenzien vor und stellen Sie sicher, dass alle Medien auf 37 Grad Celsius äquilibriert und ordnungsgemäß begast werden. Anpassung menschlicher IPCs an das Feeder-freie Medium Erste Kultur.

Das IPSC befindet sich auf Meth-Feeder-Zellen, bis sie zu 70 bis 80 % konfluent sind. Saugen Sie das Medium aus jeder 60-Millimeter-Kulturschale ab und fügen Sie eine angemessene Menge Dispa-Lösung, d. h. einen Milliliter, hinzu. In diesem Fall inkubieren Sie die Gerichte bei 37 Grad Celsius für drei bis fünf Minuten.

Aspirieren Sie die Dispa-Lösung aus jeder Kulturschale und waschen Sie die Meth-Feeder-Zellen zwei- bis dreimal vorsichtig mit DPBS ab. Geben Sie anschließend eine angemessene Menge des vollständigen Serumersatzmediums in jede Kulturschale. Kratzen Sie die Zellen mit einem Zellschaber vorsichtig von der Oberfläche der Schale.

Sammeln Sie die Zellsuspension aus jeder Schale in separate konische 15-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie jede Kulturschale mit einer angemessenen Menge des vollständigen Serumersatzmediums und geben Sie das Spülmedium in die konischen 15-Milliliter-Röhrchen, die die Zellsuspensionszentrifuge enthalten. Die 15 Milliliter konischen Röhrchen bei 200 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur zum Pelletieren der Zellen.

Nach der Zentrifugation das Supernat vorsichtig aspirieren und entsorgen, ohne das Küvettenpellet zu stören. Schnippen Sie vorsichtig mit dem Rohr, um das Zellpellet vollständig vom Rohrboden zu lösen. Fügen Sie eine angemessene Menge des vollständigen Serumersatzes mit dem Feeder-freien Medium entsprechend dem gewünschten Split-Verhältnis hinzu.

Und suspendieren Sie das Pellet vorsichtig wieder. Brechen Sie die Zellklumpen nicht auf eine kleinere Größe auf, da die kleineren Klumpen nicht gut an der Oberfläche haften. Aspirieren Sie alle verbleibenden Gel-TRE-Lösungen aus den zuvor vorbereiteten Gel-Rex-beschichteten Kulturschalen und geben Sie langsam eine angemessene Menge Zellsuspension in jede Kulturschale.

Bewegen Sie die Kulturschale mehrmals hin und her und von einer Seite zur anderen, um die Zellen auf der Oberfläche der Schale zu verteilen. Stellen Sie die Kulturschalen vorsichtig in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre von vier bis 6 % CO2 in Luftfehler. Ersetzen Sie das verbrauchte Medium danach täglich, bis die Zellen zu etwa 70 bis 80 % zusammenfließen

Wenn die humaninduzierten pluripotenten Stammzellen, die einen vollständigen Serumersatz und ein freies Feedermedium bilden, zu 70 bis 80 % konfluent sind, sind sie bereit für die Subkultur. Wenn es differenzierte Zellen gibt, entfernen Sie diese vor dem Verpacken. Aspirieren Sie das verbrauchte Medium mit einer Pipette aus der 60-Millimeter-Kulturschale und spülen Sie die Zellen zweimal aus.

Mit DPBS geben Sie vorsichtig einen Milliliter vorgewärmte Lösung auf Scheibenbasis in die Kulturschale. Schwenken Sie die Kulturschale, um die gesamte Zelloberfläche zu beschichten. Inkubieren Sie die Kultur drei bis fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Als nächstes aspirieren Sie die Dis-Space-Lösung und waschen die Zellen vorsichtig zweimal mit DPBS, fügen Sie einen vollständigen Serumersatz und ein Feeder-freies Medium hinzu und kratzen Sie die Zellen vorsichtig von der Oberfläche der Kulturschale ab. Übertragen Sie die Zellen mit einem Zellschaber in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie die Kulturschale zweimal mit vollständigem Serumwechsel aus.

Feederfreies Medium, das sanft alle Zellen absprüht, die sich nicht abgelöst haben. Ziehen Sie das Medium aus beiden Spülgängen mit den Zellen in der 15-Milliliter-Tube. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 200 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Zellen zu pelletieren, ohne das Zellpellet zu stören.

Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und entsorgen Sie ihn. Schnippen Sie vorsichtig mit dem Rohr, um das Zellpellet vollständig vom Rohrboden zu lösen. Resuspendieren Sie die Zellen sanft in einem vollständigen Serumersatz.

Dosierfreies Medium mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette. Nicht tri raten. Übertragen Sie die Zellen in eine frische 60-Millimeter-Gelt-TRX-beschichtete Schale mit dem gewünschten Split-Verhältnis.

Bewegen Sie die Kulturschale mehrmals hin und her und von einer Seite zur anderen, um die Zellen auf ihrer Oberfläche zu verteilen. Stellen Sie die Kulturschale am nächsten Tag in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre von vier bis 6 % Kohlendioxid an der Luft. Ersetzen Sie das verbrauchte Medium vorsichtig durch einen vollständigen Serumersatz.

Zuführung von freiem Medium zur Entfernung von Zelltrümmern. Ersetzen Sie das verbrauchte Medium danach jeden Tag. Dieses Phasenkontrastbild zeigt humane induzierte pluripotente Stammzellen, die auf gelt TRX-beschichteten Kulturschalen unter Verwendung eines vollständigen Serumersatzes und eines Feeder-freien Mediums gezüchtet wurden.

Die IPC-Morphologie, die der menschlichen embryonalen Stammzellen ähnelt und durch große Zellkerne und spärliche Zytoplasma-Immun-Färbung gekennzeichnet ist, zeigt, dass IPCs, die mit Knockout-Serumersatzmedium plus dem Wachstumsfaktor-Cocktail kultiviert wurden, die pluripotenten Marker OCT vier und SSEA vier exprimierten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ihre IPCs und Knockout-Serumersatz- und Feeder-freien Bedingungen anpassen und pflegen können. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.