Induction and Clinical Scoring von chronisch-rezidivierende experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis

Ich bin Christine Beaton. Ich bin wissenschaftliche Mitarbeiterin im Labor von George Chen am Department für Physiologie und Biophysik der University of California in Irvine. Und ich werde Ihnen in den nächsten Tagen zeigen, wie man eine chronisch rezidivierende EAE – das steht für experimentell autoimmune Enzephalomyelitis – bei DA-Ratten auslöst und überwacht.

Dies ist ein Tiermodell für multiple Sklerose, oder besser gesagt, eines der Tiermodelle für multiple Sklerose. Es zeichnet sich durch eine aufsteigende schlaffe Lähmung bei diesen Tieren sowie histologische Merkmale aus, die der menschlichen Erkrankung ähneln. Dieser Vorgang wird daher mehrere Tage in Anspruch nehmen.

Am ersten Tag zeige ich Ihnen, wie man die Genick-Emulsion mit naivem rotem Rückenmarkshomogenat in komplettem adjuvanten Transmittel herstellt. Am zweiten Tag zeige ich Ihnen, wie man die Ratten gegen UCAE impft, und danach warten wir zwischen sieben und 15 Tagen, um die ersten klinischen Anzeichen bei diesen Tieren zu beobachten. Zu diesem Zeitpunkt zeige ich Ihnen die verschiedenen Stadien des EAE-Verlaufs bei den unterschiedlichen Tieren. Zunächst zeige ich Ihnen alle Reagenzien und Materialien, die zur Herstellung der Emulsion benötigt werden.

Ich verwende also vollständigen Freund-Adjuvans H 37 Ra; dieses enthält zwar bereits Mycobacterium tuberculosis, werde ich jedoch mit vier Milligramm pro ml zusätzlichem lyophilisiertem Mycobacterium tuberculosis H 37 Ra anreichern. Um diese lyophilisierten Bakterien vorzubereiten, muss ich sie in mehr Teer geben und mit dem Mörtel zu einem feinen Pulver zermahlen. Sobald dies erledigt ist, werde ich diese Bakterien dem Adjuvans hinzufügen.

Dann ist das Adjuvans bereit. Der nächste Schritt besteht darin, mein Antigen vorzubereiten. Dazu entnehme ich gefrorene D-Ratten-Rückenmarkproben, die bei minus 80 gelagert wurden, und um sie gut eingefroren zu halten, lege ich sie zur Wägung auf Trockeneis. Nacheinander entnehme ich die Proben und zerkleinere das Rückenmark mit einfachen Rasierklingen in Wägegefäße.

Dann werde ich mein supplementiertes Adjuvans auf den Vortex geben. Während des Wirbelns werde ich mein Rückenmark nach und nach zu meinem Adjuvans hinzufügen, nachdem wir das gesamte Rückenmark auf dem Vortex mit dem Adjuvans vermischt haben. Wir werden weitere fünf Minuten lang wirbeln und danach die hergestellte Emulsion auf fünf ml-Glasspritzen verteilen.

Wir werden zwei Glas-Spritzen mit einem Fassungsvermögen von jeweils 5 ml mithilfe einer 16-G-Bridge verbinden und die Emulsion so schnell wie möglich durch diese Bridge von einem Spritzen in den anderen befördern. Nach einigen Minuten, wenn die Emulsion beginnt, fester zu werden, wechseln wir zu einer kleineren Bridge. Dies ist eine 18-G-Bridge, wodurch die Emulsion noch fester wird. Anschließend belassen wir die Emulsion über Nacht im Kühlschrank in den Spritzen, wobei die Bridge mit Aluminiumfolie umwickelt ist.

Ich habe 30 Milligramm Mycobacterium tuberculosis auf dem Wägepapier abgewogen. Ich habe sie in einen Mörser überführt. Unter Verwendung eines Pistills habe ich die Bakterienaggregate zu einem feinen Pulver zerkleinert.

Aber Sie sollten nicht zu stark mit dem Pistill drücken, um die Bakterien nicht zu zerstören. Zu Beginn eines Verfahrens, wenn die Bakterien aggregiert sind, haben sie eine gelbliche Färbung. Wenn Sie ein feines, sehr feines Pulver erhalten, werden Sie am Ende ein weißes Pulver haben, und das ist das Ziel. Allerdings sollten Sie nicht zu stark drücken, um die Bakterien nicht zu beschädigen.

Nachdem ich dies getan habe, habe ich 10 ml einer kompletten trans-Adjuvanz entnommen und sichergestellt, dass alle Bakterien in Suspension vorliegen. Ich habe die Probe geöffnet und die gesamten 10 ml komplette trans-Adjuvanz auf das disaggregierte Mycobacterium tuberculosis in die Mörser schüttet. Nun werde ich die ergänzte, komplette trans-Adjuvanz in ein 50-ml-Gefäß umfüllen.

Jetzt nehme ich mein ergänztes komplettes trans-Adjuvans und gebe es in ein Reagenzglas. Natürlich befinden sich die Bakterien am Boden der Flüssigkeit, und ich werde versuchen, die meisten von ihnen in das Reagenzglas zu überführen. Falls jedoch einige im Mörser verbleiben, ist das nicht weiter problematisch, da ich diesen Mörser ohne Reinigung wiederverwenden werde, um meine Rückenmarkemulsion herzustellen.

Hier sind die Rückenmarkproben. Sie wurden bei minus 80 gelagert. Ich habe 10 Gramm davon abgewogen, um sie 10 ml meines zugesetzten Adjuvans hinzuzufügen.

Was ich nun mit diesen Rückenmarken tun werde, ist, sie so lange wie möglich gefroren zu halten und sie in diesen Wägegefäßen mithilfe von Rasierklingen sehr fein zu zerkleinern. Um die Rückenmarke sehr fein zu zerkleinern, benötigen Sie zwei Rasierklingen und ein Wägegefäß. Ich nehme ein Rückenmark, lege es in mein Wägegefäß und beginne damit, es zu zerschneiden. Dabei halte ich eine Hand darüber, da es, weil es gefroren ist, noch „herumspringen“ kann. Ich fange zunächst die größeren Stücke auf, und es beginnt sehr schnell aufzutauen und an der Rasierklinge zu kleben.

Daher verwende ich die andere Rasierklinge, um es abzunehmen, und versuche, es so fein und so schnell wie möglich zu zerkleinern, damit es keine Zeit zum Schmelzen hat, da es viel schwieriger zu schneiden ist, sobald es geschmolzen ist. Es ist daher äußerst wichtig, dass das Rückenmark vollständig und sehr fein zerkleinert wird, denn je feiner es ist, desto homogener wird die Einweichung sein und desto mehr Ratten werden krank mit einer homogeneren Erkrankung. Deshalb ist es äußerst wichtig, all diese Rückenmarkstücke sehr, sehr gut zu zerkleinern.

Jetzt werde ich jede dieser Rückenmarkproben auf exakt die gleiche Weise fein hacken, bis ich die gesamten 10 Gramm Rückenmark verarbeitet habe. Als Nächstes werde ich das Rückenmark in der Mörsermühle leicht vermischen, um sicherzustellen, dass ich alle verbliebenen Mycobacterium tuberculosis-Zellen sammle, die nach dem Zusatz des Adjuvans noch in der Mörsermühle zurückgeblieben sind. Danach werde ich das Adjuvans auf den Vortex mischen.

Und während ich kontinuierlich so schnell wie möglich wirble, werde ich mein markhaltiges Rückenmark nach und nach diesem Adjuvans hinzufügen. Jetzt habe ich mein ergänztes Adjuvans auf dem Wirbel, und ich werde beginnen, mein markhaltiges Rückenmark nach und nach hinzuzufügen. Der Grund, warum ich das Antigen sehr langsam zum Adjuvans hinzufüge, liegt darin, dass wir eine Emulsion aus Wasser in Öl herstellen.

Das Adjuvans besteht hauptsächlich aus Mineralöl, und das Antigen ist eine gleichmäßige Lösung. Daher möchten wir das Antigen sehr langsam mit dem Öl vermischen, sodass das Öl das Antigen bei jeder Zugabe vollständig umhüllt. Wenn wir es auf einmal zugeben würden, würde das Öl das Antigen nicht vollständig umschließen.

Jetzt habe ich das gesamte mittlere Rückenmark zum Adjuvans in den Vortex gegeben und das Röhrchen auf den Vortex gestellt, um es weitere fünf Minuten lang rotieren zu lassen, damit sich alles vollständig vermischt. Ich stelle die Geschwindigkeit so ein, dass ich die höchstmögliche Wirbelbildung erreiche, ohne zu viel an den Rändern des Röhrchens verlieren. Nun sind die weiteren fünf Minuten Vortexen abgeschlossen, und ich werde den Vortex anhalten und mein Gemisch in Glas-Spritzen umfüllen.

Ich habe also die vollständige Spritze zusammengebaut. Ich habe sie mit der Brücke mit größerem Durchmesser verbunden und am anderen Ende der Brücke nur den Zylinder einer Spritze befestigt. Nun werde ich die Emulsion in diese Spritze einfüllen. Jetzt jedoch nicht.

Jetzt werde ich die gesamte Flüssigkeit in die untere Spritze überführen, die obere Spritze abkoppeln, die obere Spritze fertig zusammenbauen und sicherstellen, dass sich keine Luftblase in meiner unteren Spritze oder in der Brücke befindet. Und nun werde ich die Verbindung wiederherstellen. So habe ich nun beide Spritzen über diese Brücke miteinander verbunden.

Ein Spritze ist voll mit Immersionsflüssigkeit, die andere ist leer. Nun werde ich so schnell wie möglich den Kolben der einen Spritze hin und her zum anderen Spritzenkolben drücken. Jetzt werde ich die Brücke mit großem Durchmesser gegen eine schmalere austauschen, nämlich die 18-G-Brücke.

Die kleinere Brücke wird die Emulsion noch dicker machen. Um die Brücken zu wechseln, fülle ich die gesamte Emulsion in eine Spritze. Ich entferne die leere Spritze, achte darauf, dass nichts in der Brücke verloren geht, nehme die Brücke ab, setze die neue auf, spüle alle Luftblasen heraus und befestige die andere Spritze erneut.

Und ich wiederhole das Verfahren, wobei nun die Emulsion viel schwieriger durchzulassen ist, und achte darauf, diese Brücke nicht zu zerreißen, da sie sehr empfindlich ist. Ich wiederhole diesen Vorgang mit einem weiteren Satz Spritzen, solange noch Emulsion in meinem Gefäß vorhanden ist. Ich verwende also so viele Spritzen, wie nötig sind, um die gesamte Emulsion aufzubrauchen.

Jetzt habe ich die Emulsion bereits mehrmals, vielleicht 10 bis 15 Mal, durchmischt, aber das variiert je nach Charge. Inzwischen ist es äußerst schwierig, noch hindurchzukommen. Ich werde es noch ein paar Mal versuchen, oder vielleicht auch nicht.

Es sitzt jetzt wirklich fest, daher lasse ich es dort. Andernfalls besteht die Gefahr, entweder die Spritze oder die Brücke zu beschädigen. Wenn es also aufhört, sich vorwärts zu bewegen, und dies sehr früh geschieht, könnte das bedeuten, dass die Brücke verstopft ist.

Doch an diesem Punkt, da ich es mindestens 10 bis 15 Mal vermischt habe, bedeutet dies, dass die Emulsion fertig ist. Sie ist sehr dick, daher sollte ich sie in Ruhe lassen. Nun werde ich sie in Aluminiumfolie einwickeln und über Nacht in den Kühlschrank stellen.

Am gestrigen Tag haben wir die Emulsion mit roten Rückenmarkshöhlen vorbereitet und die Emulsion über Nacht im Kühlschrank gelassen. Heute nehmen wir sie heraus und werden pro Ratte 200 µL an der Basis des Schwanzes injizieren. Bevor wir jedoch injizieren, müssen wir sicherstellen, dass die Emulsion in Ordnung ist.

Es sollte also noch fest sein, und es ist weiterhin ein guter Feststoff. Der Riss, den Sie hier sehen, zeigt uns sogar, dass es sich um einen guten Feststoff handelt, der sich nicht in zwei Phasen aufgetrennt hat, was schlecht wäre. Diese Emulsion ist daher gut verwendbar.

Jede Box erhält also 200 Mikroliter unserer Emulsion. Zum Injizieren verwenden wir Dreimilliliterspritzen, achten jedoch darauf, Luer-Lock-Spitzenspritzen zu benutzen, da bei Verwendung von Schlupfverschluss-Spritzen die Emulsion so dick ist, dass die Nadel während des Injizierens herausbrechen könnte.

Verwenden Sie daher immer eine Spritze mit Lu-Verschlussart. Als Nadel versuchen wir, die kleinste mögliche Nadel zu verwenden, aber aufgrund der hohen Viskosität der Emulsion müssen wir eine 20-Gauge-Nadel verwenden. Da wir sehr präzise an der Basis des Schwanzes injizieren müssen, anästhesieren wir die Ratten für einige Minuten und nutzen die Gelegenheit, während die Ratten tief schlafen, um sie zu markieren.

Wir verwenden Ohrlochungen, und jede Ratte wird anhand eines spezifischen Lochmusters identifiziert. Nun sind wir bereit, die Ratten zu injizieren, und verabreichen jeder Ratte 200 µL Emulsion an der Schwanzwurzel, während wir gleichzeitig die Ohren markieren. Ich bereite die Emulsion jeweils nur für eine Ratte in der Injektionsspritze vor, da das Injizieren oft wirklich schwierig ist und ich stark drücken muss, und ich möchte keiner Ratte mehr verabreichen, als nötig ist.

Ich fülle die Spritze also immer nur für eine hu auf einmal. Zum Befüllen verbinde ich meine Kunststoffspritzenspritze mit der Brücke, die wiederum mit der Glasspritze verbunden ist, die die Emulsion enthält. Ich gebe etwa 300 Mikroliter Emulsion in meine Kunststoffspritze.

Dann verbinde ich die Nadel und presse die Luft aus der Nadel, damit ich diesen verlorenen Raum von 50 Mikrolitern in der Nadel nicht verliere. Und ich stelle sicher, dass ich genau 200 Mikroliter habe, und injiziere diese dann an der Basis des Schwanzes der Ratte. Nachdem wir nun alle unsere Herzen injiziert haben, werden wir sie täglich überwachen.

Wir werden sie jeden Morgen wiegen und zweimal täglich auf klinische Anzeichen einer EAE überprüfen. Die ersten Anzeichen, die ich Ihnen zeigen werde, sobald sie auftreten, sind ein schlaffer Schwanz. Bei den ersten Ratten erwarten wir das Auftreten dieser Symptome etwa am siebten bis achten Tag nach der Injektion. Die meisten Ratten erkranken zwischen dem zehnten und zwölften Tag, und die spätestens erkrankenden Ratten zeigen Symptome zwischen dem 15. und 17. Tag.

Wir befinden uns nun am Tag 13 nach der Immunisierung unserer Tiere mit der Rückenmarkemulsion, und ich werde nun die Tiere überwachen, um ihre klinische Punktzahl zu überprüfen. Doch bevor ich dies tue, möchte ich Ihnen erläutern, wie wir unsere Tiere unterbringen. Autoimmunerkrankungen zeichnen sich dadurch aus, dass jeder im Tier vorhandene Erreger die autoimmune Antwort vermindern wird.

Um dies so weit wie möglich zu vermeiden, halten wir unsere Ratten unter spezifischen Bedingungen. Sie werden in dieser Zelle gehalten, die über gefilterte Luft verfügt und unter Überdruck steht; die Tiere selbst befinden sich in autoklavierten Käfigen. Somit wird absolut alles im Käfig vor dem Einsetzen der Ratte autoklaviert.

Und sie verfügen über Filter auf den Käfigen. Das Futter ist Standard-Nageternahrung. Es ist I originated.

Und wir geben unseren Ratten auch angesäuertes Wasser. Dazu nehmen wir normales Trinkwasser und fügen gemäß Standardprotokollen Salzsäure hinzu. Mit dem angesäuerten Wasser halten wir die Darmflora auf einem Minimum, wodurch das Risiko einer Beeinträchtigung der Autoimmunantwort verringert wird. Nun bin ich bereit, die klinische Bewertung meiner Ratten durchzuführen.

Die Bewertungsskala reicht von einem Wert von null, was keinerlei klinische Anzeichen bedeutet, bis sechs, was einem morbiden Zustand entspricht, bei dem die Tiere getötet werden. Nun werde ich Ihnen Schritt für Schritt Beispiele für jede klinische Punktzahl zeigen, die wir in diesem Modell beobachten können. Wir befinden uns nun am Tag 13 nach der Immunisierung der Ratten mit UCAE.

Und in diesem Käfig habe ich zwei Ratten, die noch nicht krank geworden sind. Sie zeigen also keinerlei klinische Anzeichen von Krankheit. Beide Ratten sind daher weiterhin gesund.

Sie laufen herum, rennen umher, und wie Sie sehen können, heben sie beim Bewegen ihren Schwanz vom Einstreu ab. Manchmal lassen sie den Schwanz trocknen, aber meistens versuchen sie, ihn vom Einstreu zu heben. Und wenn sich die Gelegenheit ergibt, klettern sie auch aus dem Käfig heraus, was bedeutet, dass sie die volle Kontrolle über alle vier Gliedmaßen haben und sich aufrichten können, wenn nötig.

Das erste klinische Anzeichen von EA ist ein schlaffer Schwanz. Wenn ich also eine Ratte aufhebe und meinen Finger gegen den Schwanz drücke, neigt die Ratte dazu, mit der Schwanzspitze zuzugreifen. Wie Sie gerade gesehen haben, hat diese Ratte keinen schlaffen Schwanz, und ich kann dies bei der anderen ebenso demonstrieren.

Der Schwanz greift um den Finger, was bedeutet, dass diese Ratten einen vollständig reaktiven Schwanz haben. Sie weisen einen klinischen Score von null auf, was tatsächlich keinerlei Anzeichen einer Erkrankung bedeutet. Hier sehen wir eine Ratte mit einem klinischen Score von 0,5.

Wenn man das Tier also einfach im Käfig beobachtet, verhält es sich absolut normal: Es läuft herum, klettert an der Seite des Käfigs hoch, aber die Schwanzspitze verlässt niemals die Einstreu. Dieser Ratte könnte also ein teilweiser Schwanzlähmung vorliegen. Daher greife ich die Ratte und führe denselben Test durch, und obwohl der Schwanz etwas Muskeltonus aufweist, krümmt sich das Ende nicht vollständig um meinen Finger.

Ich werde diese Ratte mit einem Score von 1,5 bewerten, was einem teilweisen Schwanzlähmungszeichen entspricht. Ein klinischer Score von eins ist gekennzeichnet durch einen vollständig schlaffen Schwanz, sodass kein Teil des Schwanzes Muskeltonus aufweist, aber die Ratte kann ihre Hinterbeine noch verwenden. Wie Sie sehen können, steht diese Ratte an der Seite des Käfigs aufrecht, was zeigt, dass ihre Hinterbeine normal funktionieren.

Doch wenn ich die Schwänze dieser Ratten überprüfe, indem ich sie anhebe, ist absolut keine Tonusspannung in ihren Schwänzen vorhanden. Ein weiterer Test, den man durchführen kann, besteht darin, dass, während sich die RU auf dem Boden des Käfigs befindet, wenn man den Schwanz mit einer normalen RU anhebt, der Schwanz langsam herunterkommt oder möglicherweise gar nicht bis zum Boden reicht – dies entspricht einem RU-Wert von eins. Wenn man den Schwanz anhebt, fällt er sofort zu Boden.

Dieses RU kann alle vier Gliedmaßen bewegen, aber die Hintergliedmaßen sind zu schwach, um diesem RU das Aufstehen zu ermöglichen. Daher werde ich dieses RU mit einem klinischen Score von zwei klassifizieren. Der Hauptunterschied zwischen einem Score von eins und zwei besteht darin, dass beim Score von eins lediglich eine schlaffe Schwanzlähmung vorliegt.

Die Hinterbeine sind voll funktionsfähig, und bei einer Punktzahl von drei würde die Ratte auf die Seite fallen. Eine Zwei ist ein Zwischenwert, was bedeutet, dass die Ratte ihre Hinterbeine benutzen kann, diese jedoch deutlich schwächer sind als die einer normalen Ratte. Diese Ratte weist somit eine ungewöhnliche Erscheinungsform der EAE auf.

Normalerweise wird die EAE als aufsteigende schlaffe Lähmung charakterisiert, aber in einigen Fällen, die ziemlich selten sind, wie in diesem hier, entwickeln die Ratten zunächst eine Lähmung der Vordergliedmaßen, bevor die Hintergliedmaßen gelähmt werden. Und genau das ist bei dieser Ratte der Fall. Wenn man sie betrachtet, sieht man, dass ihr Kopf tiefer liegt als der Rest des Körpers, da sie Schwierigkeiten mit den Vordergliedmaßen hat und nicht mehr an der Käfigwand hochklettern kann.

Und obwohl seine Hintergliedmaßen normal funktionieren, kann er nicht mit den Vordergliedmaßen drücken. Daher würde ich diese Ratte dennoch mit einem Wert von zwei bewerten, was einer leichten Parase entspricht, obwohl wir das normalerweise bei Hintergliedmaßen bei diesem RU sehen, hier jedoch bei allen vier Gliedmaßen beobachten. Dieses RU weist somit ein viel schwerwiegenderes Phänotyp auf als die vorherigen.

Es weist einen klinischen Score von drei auf. Wie ich Ihnen zeigen werde, funktionieren die Vordergliedmaßen vollständig normal, während die beiden Hintergliedmaßen eine moderate Parese aufweisen. Beide Hintergliedmaßen sind für die RU nutzbar, um sich fortzubewegen, doch die RU kippt auf die Seite und kann diese Beine nicht vollständig kontrollieren.

Diese Sporen werden viel schwächer, als sie es normalerweise ohne EE wären. In diesem Stadium machen wir uns bereits keine Sorgen mehr um schlaffe Schwänze, da viele dieser Ratten nach einer Weile einen sehr straffen Schwanz entwickeln. Dieser hier hat noch einen sehr schlaffen Schwanz, aber manchmal kann man eine Dystonie erkennen. Der Schwanz beginnt dann, sich unkoordiniert zu bewegen.

Wir betrachten also auf dieser Ebene nicht mehr den Schwanz, sondern nur noch die Funktion der Gliedmaßen. Wir bewerten dies mit 3,5, denn wenn wir die Hintergliedmaßen betrachten, bewegt sich eine, während die andere vollständig gelähmt ist und bei der Vorwärtsbewegung der Maus überhaupt nicht hilft. Dies wird daher als eine vollständige Lähmung einer Hintergliedmaße angesehen und erhält die Punktzahl 3,5.

Dieses Tier hat einen klinischen Score von vier, was einer vollständigen Lähmung der Hintergliedmaßen entspricht, und ist gekennzeichnet durch eine völlige Unfähigkeit, die Hinterbeine zu bewegen. Die Ratte in diesem Käfig hat einen klinischen Score von fünf, was einer vollständigen Lähmung der Hintergliedmaßen mit zusätzlicher Inkontinenz entspricht. Dieses Tier ist inkontinent, wie wir sehen können, es hat hier vollständig Gewicht verloren, was wir bei den anderen Tieren, die nicht inkontinent sind, nicht beobachten.

Wenn unsere HUS einen Wert von drei oder mehr aufweisen, geben wir ihnen Wasserflaschen mit langen Saugröhrchen, um sicherzustellen, dass sie Zugang zum Wasser haben. Außerdem stellen wir Futter auf den Boden des Käfigs und verabreichen ihnen Gel-Packungen. Dennoch bieten wir bei jedem Herausnehmen der Ratten zur Überwachung, was zweimal täglich erfolgt, zusätzlich Wasser an, falls sie tagsüber nicht ausreichend getrunken haben.

Hier habe ich eine Ratte mit einem klinischen Score von vier. In diesem Stadium müssen diese Tiere etwas ermutigt werden, Futter aufzunehmen. Deshalb befeuchte ich ihr Futter, wodurch es für sie viel leichter zum Kauen wird.

Ich habe Ihnen also in den letzten zwei Wochen gezeigt, wie man chronisch rezidivierende EAE bei DA-Ratten induziert und überwacht. Im ersten Schritt zeigte ich Ihnen, wie man die Rückenmark-Immersion vorbereitet, und anschließend, wie man sie an der Basis des Schwanzes dieser Ratten injiziert. Heute habe ich Ihnen gezeigt, wie man diese Ratten anhand unterschiedlicher Krankheitsstadien bewertet.

Natürlich handelt es sich hierbei um ein chronisches rezidivierendes Modell, sodass wir erwarten, dass die Ratten schwankende Werte aufweisen. Die Erkrankung wird innerhalb weniger Tage in Remission gehen und im Laufe der Zeit erneut rezidivieren. Einige Ratten werden in eine chronischere Krankheitsphase eintreten.

Es wird von Tier zu Tier variieren. Bevor wir dieses Video beenden, möchte ich noch einen Aspekt bezüglich der Testung von Wirkstoffen in diesen Modellen betonen. Der entscheidende Punkt ist, die Tiere so gut wie möglich zu randomisieren.

Eine sehr wichtige Information ist, dass je früher das Tier krank wird, desto schwerer ist seine Erkrankung. Daher sollten Sie nicht alle Kontrolltiere am ersten Tag zusammenfassen und die behandelten Tiere an den folgenden Tagen. Stattdessen teilen wir die Tiere bereits dann, wenn ein Tier krank wird und an dem Tag, an dem wir die Behandlung beginnen möchten, zufällig in zwei verschiedene Gruppen ein.

Wenn wir beispielsweise eine Kontroll- und eine behandelte Gruppe haben, kommt das erste Tier in die Kontrollgruppe, das zweite in die behandelte Gruppe und so weiter, bis alle Tiere ihren jeweiligen Gruppen zugewiesen sind. Wir stellen jedoch sicher, dass diese Randomisierung so früh wie möglich im Protokoll erfolgt. Ich hoffe, dieses Video war für Sie hilfreich und Sie sind nun in der Lage, eine chronisch rezidivierende EAE bei D-Ratten zu induzieren und zu überwachen.

Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.