Large Scale Zebrafisch-Based In-vivo- Small Molecule-Screen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, kleine Moleküle zu entdecken, die spezifisch Schlüsselaspekte der Embryonalentwicklung und Physiologie modulieren. Dies wird erreicht, indem eine große Anzahl befruchteter Eizellen in 96 gelegt wird, während in einem zweiten Schritt die Platten gesiebt werden. Aliquots einer Bibliothek kleiner Moleküle werden zu den 96-Well-Platten neben den Embryonen in den 96 hinzugefügt.

Well-Platten werden auf Phänotypen untersucht, die durch die kleinen Moleküle hervorgerufen werden. Es werden Ergebnisse erzielt, die zeigen, welche kleinen Moleküle die Entwicklung oder Physiologie von Superfischen spezifisch beeinflussen. Hallo, mein Name ist Charles Hong von der Vanderbilt University School of Medicine.

In unserem Labor führen wir chemische Hochdurchsatz-Screenings mit Difish-Embryonen durch. Dies ist eine relativ einfache Technik, die umfassend angepasst werden kann, um neuartige bioaktive Verbindungen zu entdecken. Richten Sie am Nachmittag vor dem Tag des chemischen Screenings 10 bis 20 Zebrafisch-Aufzuchtbecken ein.

Setzen Sie eine Trennwand in jedes Becken ein und füllen Sie jedes Becken mit Wasser aus dem Aquakultursystem mit einem Fischnetz, wobei ein erwachsenes Männchen und ein bis zwei erwachsene Weibchen in den Innenbehälter umgefüllt werden. Beschriften Sie in jedem Aufzuchtbecken die Becken und legen Sie am Morgen des Bildschirms einen Deckel darauf. Entfernen Sie die Trennwände aus den Aufzuchtbecken und lassen Sie den Zebrafisch sich paaren.

Im Laufe der nächsten Stunde. Lassen Sie befruchtete Eier durch das Gitter am Boden jedes Innenbehälters fallen. Nach einer Stunde bringen Sie die erwachsenen Seberfische wieder in die permanenten Lagertanks zurück.

Entfernen Sie den Innenbehälter und sammeln Sie die Eier, indem Sie das Wasser in jedem Aufzuchtbecken durch ein Teesieb aus Plastik abseihen. Drehen Sie das Sieb über eine Petrischale und spülen Sie das Sieb vorsichtig aus, um die Eier in die Petrischale zu spülen. Durch die Verwendung einer Waschflasche mit E drei Medium sollten alle unbefruchteten Eizellen, die undurchsichtig erscheinen, entfernt werden.

Mit einer Einweg-Plastikpipette sollte jede Kreuzung etwa 200 Embryonen ergeben. Dann werden mit einer Glaspasterpipette etwa fünf Embryonen in E 3 Medium in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte übertragen. Sobald die Embryonen auf einer 96-Well-Platte angeordnet sind.

Entfernen Sie mit einer 12-Kanal-Pipette so viel wie möglich des E 3-Mediums aus den Vertiefungen. Achten Sie darauf, die Embryonen nicht zu punktieren. Mit der 12-Kanal-Pipette werden 250 Mikroliter E drei abgegeben.

Medium, das 0,5 Mikrogramm pro Milliliter enthält, kann so schnell wie möglich in jedes Brunnen mycin gelangen, um die Embryonen nicht austrocknen zu lassen. Legen Sie die 96-Well-Platten in einen 28,5 Grad Celsius heißen Inkubator, bis sie das gewünschte Stadium erreichen, in dem die Verbindungen hinzugefügt werden sollen. In diesem Protokoll suchen wir nach Verbindungen, die die frühe embryonale Musterbildung stören und die Embryonen drei Stunden lang inkubieren oder bis das 1000-Zellstadium von mehr als 90% der Embryonen erreicht ist, die typischerweise mit kleinen Molekülbibliotheken versorgt werden.

In einer 96-Well-Quellplatte, in der jede Verbindung als 10-Millimolar-Stamm in DMSO gelagert wird, taut etwa 60 Minuten bevor die Embryonen das gewünschte Stadium erreichen, eine angemessene Anzahl von 96-Well-Platten auf, die Aliquots kleiner Moleküle enthalten. Notieren Sie sich die Serien- oder andere Identifikationsnummer der Quellplatten, um die Kondensation auf den Platten zu minimieren. T fallen in eine Trocknungskammer, in der sich ein Trockner befindet. Rechts.

Schleudern Sie die Platten kurz in einer Tischzentrifuge, die mit einem Multiwell-Plattenadapter ausgestattet ist. Entfernen Sie das Aluminium-Deckenband mit einer 12-Kanal-Pipette von der Quellplatte und verdünnen Sie die Verbindungen in der Quellplatte mit DMSO auf die gewünschte Konzentration. In diesem Protokoll verwenden wir eine Endkonzentration von 0,5 Millimolar und fügen 4,75 Mikroliter DMSO hinzu, um die 10 Millimolare Rohplatte zu verdünnen.

Wenn die Embryonen in der 96-Well-Platte das gewünschte Stadium erreichen, verwenden Sie eine 12-Kanal-Pipette, um 2,5 Mikroliter Verbindungen von den Quellplatten in die Empfängerplatten mit den Embryonen zu übertragen. Decken Sie die Platten, die jetzt die Embryonen und Verbindungen enthalten, mit Deckeln ab und notieren Sie die Identifikationsnummer der Quellplatten auf den Embryoplatten. Mischen Sie die Platten durch leichtes Schwenken und legen Sie sie in einen 28,5 Grad Celsius heißen Inkubator.

Decken Sie jede Quellplatte, die unbenutzte kleine Moleküle enthält, mit einer Aluminiumdecke ab, kleben Sie sie ab und stellen Sie sie zur Langzeitlagerung in einen Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius. Formulieren Sie vor dem Ausführen des visuellen Bildschirms ein spezifisches Trefferkriterium. Zum Beispiel kann in einem Screening auf niedermolekulare Inhibitoren von vier Gehirnen in der Entwicklung ein Treffer eine Verbindung sein, die den Verlust des Vorderhirns verleiht.

Das Fehlen von Augen ist ein einfacher visueller Indikator für den Verlust des Vorderhirns und erfordert keine Fluoreszenz, um zu den gewünschten Zeitpunkten in der Entwicklung zu bestimmen. Nehmen Sie die 96-Well-Platten mit zusammengesetzten behandelten Embryonen aus dem Inkubator und untersuchen Sie jede Vertiefung unter einem Stereomikroskop, wenn Sie nach niedermolekularen Inhibitoren der Vier-Gehirn-Entwicklung suchen, untersuchen Sie die Platten nach 28 Stunden auf den Verlust des Auges als Marker für die Entwicklungshemmung von vier Gehirnen. Notieren Sie die Identität der Platte und die Position der Vertiefung für alle Vertiefungen, in denen mindestens drei von fünf Embryonen den vorgeschriebenen Hi-Phänotyp aufweisen. Setzen Sie die 96-Vertiefungsplatte wieder in den Inkubator ein.

Bestätigen Sie den Verlust von Augen und Vorderhirn nach 48 Stunden. Auch wenn die Embryonen kein Vorderhirn haben, überleben sie mindestens vier Tage. Bestätigen Sie einen potenziellen Treffer, indem Sie die Wirkung der Verbindung bei mehreren Dosen für jede Dosis erneut testen, 10 Embryonen werden in 0,5 Millilitern E drei Medien in einem 48-Well-Plattenformat getestet.

Der Zeitpunkt der Wirkstoffausgabe für die Wiederholungsprüfung sollte mit dem des ursprünglichen Screenings identisch sein. Ein HIIT wird bestätigt, wenn der hervorgerufene Phänotyp in Abhängigkeit von der Dosis nach einem erneuten Test der Substanz reproduziert wird. Identifizieren Sie schließlich die hi-Verbindung aus der Datenbank der kleinen Moleküle in der chemischen Bibliothek.

Mit Hilfe des auf Zebrafischen basierenden visuell-chemischen Screenings entdeckten wir einen niedermolekularen Igel-Signalinhibitor, der auf seiner Wirkung auf die Körperachse basiert. Dieses Bild zeigt Embryonen, die einem Igelhemmer ausgesetzt waren, mit einer ausgeprägten ventralen Krümmung des Schwanzes. Nach 24 Stunden zeigen die gleichen Embryonen, die nach 48 Stunden untersucht wurden, immer noch den ventral gekrümmten Phänotyp.

Dieses Bild zeigt den compound-behandelten Embryo im Vergleich zum mutierten Embryo des Igel-Signalwegs. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann eine Person in nur wenigen Stunden etwa 400 Verbindungen pro Woche screenen. Diese Technik hat auch den Weg für chemische Biologen geebnet, Dinge wie die Zellentwicklung, die Zellsignalwege und die Embryonalentwicklung zu untersuchen.

Bei der Arbeit mit uncharakterisierten kleinen Molekülen ist es wichtig, Laborkittel und Handschuhe zu tragen, da diese nicht charakterisierten Moleküle potenziell gefährlich sein können.