Gene Lieferung in Postnatale Rattengehirn von Non-ventrikuläre Plasmid Injektion und Elektroporation

Hallo, ich bin RI Ov. Und ich bin Alexia Ying. Wir sind Doktorandinnen der Cent University. In diesem Video stellen wir eine Methode der in-vivo-Elektroporation zur gezielten Genübertragung in einen bestimmten Bereich leitender Hirngewebe vor.

Schauen wir uns das an. Die Methode der in-vivo-Elektroporation bietet eine schnelle und effiziente Möglichkeit, Gene von Interesse oder kleine interferierende RNA in lebendes Hirngewebe einzubringen.

Es bietet eine kostengünstige Alternative zur Erzeugung transgener Tiere und zur viralen Genübertragung. In diesem Video werden wir ein detailliertes Verfahren zur postnatalen Genübertragung in den neonatalen Rindenbereich demonstrieren. Wir verwenden ein Plasmid, das für das verbesserte grün fluoreszierende Protein sowie für den Hühner-Beta-Aktin-Promotor mit einem CMV-Enhancer kodiert.

Wir führen alle chirurgischen Eingriffe im laminar flow-Schrank durch, um die Sterilität aufrechtzuerhalten und das Risiko einer bakteriellen oder fungalen Kontamination des Tieres zu minimieren. Zur Plasmidapplikation in die Großhirnrinde verwenden wir einen WPI-Mikroinjektor mit elektronischer Steuerung und eine 10-Mikroliter-Hamilton-Spritze, die an einen stereotaktischen Manipulator angeschlossen ist. Das rote Jungtier wird mit einer Anästhesieeinheit bestehend aus einer Box und einer Maske anästhesiert.

Das Jungtier wird anschließend mit Ohrstangen am Heiztisch befestigt, der am stereotaktischen Manipulator angebracht ist. Für chirurgische Eingriffe und die Überwachung der Mikroinjektion verwenden wir ein binokulares Mikroskop. Für die Elektroporation nutzen wir den CYV 21 In-vivo-Elektro-Operator mit klemmenförmigen Elektroden.

Für die Wiederherstellung der Welpen. Nach der Anästhesie wird eine beheizte Kammer verwendet. Üblicherweise bereiten wir 10 Mikroliter der Plasmid-Injektionslösung in einem 200-Mikroliter-Dünnwandgefäß vor. Diese Lösung reicht für mehrere Experimente aus.

Wir mischen acht Mikroliter der Plasmidlösung mit einem Mikroliter 10 XPBS und einem Mikroliter einer 0,1 %igen Wasserlösung von Fast Green. Die Endkonzentration des Plasmids in der Injektionslösung sollte zwischen ein und drei Mikrogramm pro Mikroliter liegen. Die Verwendung niedrigerer Konzentrationen der Plasmid-DNA verringert die Transfektionseffizienz, während eine höhere DNA-Konzentration zu viskos wird, um durch die dünne Spitze der Glaskapillare injiziert zu werden.

Für die Herstellung der Glaspipette verwenden wir Boa-Silikatglas-Kapillaren mit Filament und den vertikalen Elektroden-Glaszieher mit maximalen Zieh- und Heizparametern. Anschließend brechen wir die Pipettenspitze mit einem Stück Papier ab, um einen Durchmesser der Spitze zwischen 10 und 20 Mikrometer zu erreichen. Wir überprüfen die Spitze, ihren Durchmesser und ihre Form unter dem Objektiv des Mikroskops.

Unter Verwendung einer dünnen Polymerkapillare füllen wir etwa ein Drittel des Volumens einer 10-Mikroliter-Hamilton-Spritze. Mit Mineralöl stellen wir sicher, dass keine Luftblasen entstehen. Anschließend füllen wir die Glaspipette mit Mineralöl und führen die Pipette in die Hamilton-Spritze ein.

Auch hier sollten Luftblasen vermieden werden. Die Spritze mit der Glaspipette wird anschließend auf einem Mikroinjektor befestigt, der mit einem Controller verbunden ist. Die auf einem stereotaktischen Gerät befestigte Mikroinjektionsanordnung ermöglicht es uns, die Spitze der Glaspipette sicher in das Röhrchen mit der Plasmid-Injektionslösung einzutauchen.

Wenn die Spitze die Oberfläche der Lösung berührt, tauchen wir sie um ein bis zwei Millimeter weiter ein. Anschließend verwenden wir den Mikroinjektor-Controller, um die Pipette mit etwa einem Mikroliter der Injektionsmischung zu füllen. Alle hier vorgestellten Experimente werden gemäß den Vorschriften der Universität Helsinki für Tierversuche durchgeführt.

Füllen Sie für jedes Experiment eine gastight-Spritze mit Iso-Fluoran. Befestigen Sie die Spritze an der Narkoseeinheit, die mit der Luftstromquelle, dem Tier und der auf dem stereotaktischen Aufbau befestigten Maske verbunden ist. Stellen Sie an der Narkoseeinheit den Luftstrom auf etwa 250 Milliliter pro Minute und den Iso-Fluorangehalt auf 4 % ein. Führen Sie das rote Pop in die Tierbox für zwei bis fünf Minuten ein.

Wenn das Jungtier aufhört, sich zu bewegen, legen wir es auf die Heizplatte, die an die stereotaktische Vorrichtung angeschlossen ist. Wir positionieren den rostralen Teil des Kopfes des Jungtiers in die Maske. Normalerweise dauert es fünf bis zehn Minuten, bis das Jungtier in eine tiefe Anästhesie eintritt.

Wenn dies erreicht ist, verringern wir den Isofluranfluss auf etwa 1,5 bis 2 %. Wir behandeln die Haut auf dem Kopf des Welpen mit 70 %igem Ethanol unter Verwendung kleiner Scheren und dünner Pinzetten. Wir schneiden die Haut vom Nacken des Welpen bis zur Stirn, klappen die Hautlappen seitlich zur Seite und ziehen die Ohrstifte leicht in die Gehörgänge des Schädels, um Kopf und Haut zu fixieren. Mithilfe eines Binokularmikroskops lokalisieren wir den Bregmapunkt am Schädel, identifizieren den interessierenden Bereich anhand der stereotaktischen Koordinaten, positionieren die Injektionspipette über diesem Bereich und markieren die Stelle, indem wir 25 bis 50 Nanoliter der Injektionslösung auf die Schädeloberfläche abgeben.

Wir bohren vorsichtig und sorgfältig mit einem Hochgeschwindigkeits-Chirurgiebohrer unter dem Mikroskop an der markierten Stelle in den Schädel, bis Flüssigkeit im gebohrten Bereich erscheint. Wir befestigen die Elektroporationszangen, Elektroden an den Seiten des Schädels. Wir tragen ein leitfähiges Gel auf, um eine bessere Leitfähigkeit zu erzielen.

Wir entfernen den Flüssigkeitstropfen aus der gebohrten Stelle mit einem kleinen Tupfer und tauchen die Glasnadel in das Loch ein. Gemäß den Koordinaten der Injektionsstelle injizieren wir 25 bis hundert Nanoliter der Injektionslösung mit einer Geschwindigkeit von fünf bis 20 Nanoliter pro Sekunde. Anschließend entfernen wir die Pipette schnell und führen unverzüglich die Elektroporation durch.

Die Elektroporation erfolgt durch Anlegen von fünf Impulsen mit einer Dauer von 50 Millisekunden bei einer Impulsamplitude von 99 Volt und einer Frequenz von einem Hertz. Wir entfernen die Elektroden und die Ohrhalterungen. Den Hautschnitt vernähen wir mithilfe einer Kombination aus stumpfen und scharfen Pinzetten sowie dem chirurgischen Faden.

Wir platzierten das Jungtier für 15 bis 30 Minuten in eine Wärmekammer, um die Erholung nach der Anästhesie zu unterstützen. Anschließend setzten wir das Jungtier zurück in den Käfig seiner Mutter. Die Expression des Transgens in den erfolgreich transfizierten Zellen wird etwa 10 Stunden nach der Elektroporation sichtbar und bleibt mehrere Wochen stabil.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten. Auf Wiedersehen.