Die Verwendung von Carboxyfluoresceindiacetat Succinimidylester (CFSE) auf Lymphozyten-Proliferation-Monitor
12. Oktober 2010
CFSE kovalent Etiketten langlebig intrazellulären Molekülen mit dem Fluoreszenzfarbstoff, Carboxyfluorescein. Als solche, als eine CFSE-markierten Zelle teilt, haben seine Nachkommen, die Hälfte der Menge der Fluoreszenz, die damit verwendet werden, um die Zellteilung zu beurteilen. Dieser Artikel beschreibt die Verfahren, die üblicherweise zur Kennzeichnung Maus-Lymphozyten mit CFSE verwendet.
Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, Lymphozyten mit dem intrazellulären Fluoreszenzfarbstoff CFSE zu markieren, so dass die Lymphozyten mittels Durchflusszytometrie auf Zellteilung überwacht werden können. Dies wird durch das Mischen von Lymphozyten mit CFDA se, der Diacetylform von CFSE, erreicht. Die beiden Acetylgruppen ermöglichen es dem Farbstoff, schnell in Zellen innerhalb der Lymphozyten einzudringen.
Esterasen entfernen die Acetylgruppen aus dem C-F-D-A-S-E und bilden die CFSE-Form des Farbstoffs. Ohne die Acetylgruppen wird CFSE fluoreszierend und ist auch weniger membrandurchlässig, wodurch der Farbstoff in den Zellen konzentriert wird. Die aminoreaktive AL-Seitenkette von CFSE koppelt den Farbstoff dann kovalent an intrazelluläre Proteine, wodurch die Zellen nahezu permanent fluoreszieren.
CFSE kann verwendet werden, um die Lymphozytenteilung auf der Grundlage der sequentiellen Fluoreszenzintensität von Tochterzellen zu überwachen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem tritiierten Thymidineinbau besteht darin, dass einzelne Zellen auf Zellteilung überwacht werden können. Das Verfahren wird von Ben Qua, einem Forschungsmitarbeiter aus meinem Labor zur Markierung von Zellen, demonstriert.
Beginnen Sie mit frisch isolierten Lymphozyten aus Milz oder Lymphknoten von Mäusen und fügen Sie eine Konzentration zwischen einem halben und 10 Millionen Zellen pro Milliliter Kulturmedium hinzu, ergänzt mit 5 % Wärme. Inaktiviertes fötales Kälberserum resuspendiert die Zellen gründlich und überträgt vorsichtig einen Milliliter auf den Boden eines frischen konischen 10-Milliliter-Röhrchens. Lege das Rohr vorsichtig waagerecht.
Geben Sie 110 Mikroliter PBS auf die Oberseite des Röhrchens in den nicht benetzten Teil des Kunststoffs und stellen Sie sicher, dass es nicht mit der Zelllösung in Berührung kommt. Fügen Sie eine frische Farbstofflösung von 1,1 Mikrolitern des fünf Millimolar Stocks C-F-D-A-S-E zu den 110 Mikrolitern PBS hinzu. Verschließen Sie das Röhrchen schnell und drehen Sie es gut um und wirbeln Sie es gut, um eine schnelle, gleichmäßige Durchmischung der Lösungen zu erhalten, da der Farbstoff fluoreszierend wird und somit zum Ausbleichen neigt.
Schützen Sie die Röhre vor Licht, indem Sie die Röhre mit Alufolie abdecken. Die Zellen werden fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, indem die Waschzellen in 10 Volumina von 20 Grad Celsius verdünnt werden, wobei PBS 5 %H-I-F-C-S enthält, durch Zentrifugation bei 300 G für fünf Minuten bei 20 Grad Celsius sedimentiert und der Überstand verworfen wird. Wiederholen Sie den Waschgang noch zweimal.
Die Zellen können dann auf ein Protokoll von Interesse zur Induktion der Zellteilung angewendet werden. Markierte Zellen können sowohl in in vitro als auch in vivo Assays verwendet werden. Nach Abschluss des Proliferationsassays werden die Zellen entnommen und mittels Durchflusszytometrie analysiert.
In diesem Beispiel wird die CFSE-Markierung in vitro verwendet, um zu messen, wie T-Zellen von genetisch veränderten transgenen Mäusen auf dendritische Zellen reagieren, die mit unterschiedlichen Antigenkonzentrationen gepulst werden. Die unschattierten CFSE-Verdünnungspeaks zeigen transgene CD acht positive T-Zellen, die sich ein- bis dreimal geteilt haben. Es ist zu erkennen, dass sich bei den höheren Konzentrationen des Antigens mehr T-Zellen teilen.
Die CFSE-Markierungsmethode ist auch für In-vivo-Assays wie adoptive Transferexperimente geeignet. Hier wird das Fax verwendet, um die Population von T-Zellen zu identifizieren, die für Empfängermäuse von Interesse sind. Ein anschließendes CFSE-Proliferationsprofil zeigt acht positive T-Zellen der Zöliakie, die sich nach ihrer Entwicklung ein- bis sechsmal geteilt haben, basierend auf den CFSE-Verdünnungspeaks.
Dieses Verfahren ebnete Forschern und Immunologen den Weg, die Lymphozytenproliferation während einer Immunantwort zu untersuchen.
Überblick
Dieser Artikel beschreibt das Verfahren zur Markierung von Maus-Lymphozyten mit dem fluoreszierenden Farbstoff CFSE, der die Überwachung der Zellteilung durch Durchflusszytometrie ermöglicht. Die Methode erlaubt es Forschern, die Lymphozytenproliferation während Immunreaktionen zu verfolgen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Immunologie
- Zellbiologie
- Durchflusszytometrie
Hintergrund
- CFSE ist ein fluoreszierender Farbstoff, der zur Markierung intrazellulärer Proteine verwendet wird.
- Er ermöglicht die Beurteilung der Zellteilung durch Messung der Fluoreszenzverdünnung in Tochterzellen.
- Diese Technik bietet Vorteile gegenüber traditionellen Methoden wie der Tritium-Thymidin-Inkorporation.
- CFSE-Markierung kann sowohl in in vitro als auch in in vivo Assays angewendet werden.
Zweck der Studie
- Demonstration der CFSE-Markierungstechnik zur Überwachung der Lymphozytenteilung.
- Bereitstellung eines detaillierten Protokolls für Forscher.
- Hervorhebung der Anwendung von CFSE bei der Untersuchung von T-Zell-Reaktionen auf Antigene.
Verwendete Methoden
- Isolierung von Lymphozyten aus der Mausmilz oder Lymphknoten.
- Mischen von Lymphozyten mit CFDA SE zur Erleichterung des Farbstoffeintritts.
- Inkubation und Waschen der Zellen zur Entfernung überschüssigen Farbstoffs.
- Durchflusszytometrieanalyse zur Beurteilung der Zellteilung basierend auf der CFSE-Verdünnung.
Hauptergebnisse
- CFSE-Markierung ermöglicht die Verfolgung der T-Zell-Teilung als Reaktion auf verschiedene Antigenkonzentrationen.
- Die Durchflusszytometrie zeigt deutliche Peaks, die verschiedenen Teilungsstufen der T-Zellen entsprechen.
- Die Methode ist sowohl für in vitro als auch für in vivo Anwendungen effektiv.
- Die Ergebnisse demonstrieren den Nutzen von CFSE in der immunologischen Forschung.
Schlussfolgerungen
- CFSE-Markierung ist eine zuverlässige Methode zur Untersuchung der Lymphozytenproliferation.
- Diese Technik verbessert das Verständnis von Immunreaktionen.
- Forscher können diese Methode für verschiedene experimentelle Designs nutzen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
CFSE labeling enables precise tracking of lymphocyte proliferation, supporting target validation in immunology-focused drug discovery. By quantifying division at single-cell resolution, it de-risks mechanistic hypotheses and informs go/no-go decisions in early discovery. The method’s compatibility with multi-color flow cytometry enhances assay scalability and cross-functional data integration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring antigen-driven T cell division in response to varying stimulus concentrations.
- Operational Value: Provides quantitative, single-cell readouts that clarify pathway activation and functional target engagement.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing biologically active compounds from inert controls based on proliferation profiles.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, low-variance fluorescent labeling compatible with high-throughput flow cytometry workflows.
- Reproducibility: Enables consistent detection of up to eight division cycles, supporting assay qualification across sites and operators.
- Multiplexing Capacity: Integrates with other fluorochromes for simultaneous phenotyping and functional readouts in complex immune assays.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models antigen-specific T cell responses applicable to vaccine, autoimmune, and oncology indications.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo validation via adoptive transfer models, preserving proliferation tracking fidelity.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs preclinical go/no-go decisions by correlating proliferation depth with mechanistic potency and target modulation.
Pipeline & Workflow Integration
CFSE labeling functions as a discovery-phase tool that connects hypothesis testing in early immunology to lead optimization through quantifiable proliferation metrics.
- Discovery Biology: Tests mechanistic hypotheses by linking antigen exposure to lymphocyte division kinetics, reducing ambiguity in target function.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence dilution data enabling reliable comparison of test conditions across compound libraries.
- Analytics: Generates resolvable flow cytometry peaks corresponding to division cycles, supporting statistical comparison of proliferation indices.
- Translational Research: Enables continuity from reductionist in vitro assays to physiologically relevant in vivo models without re-labeling or assay redesign.
- Enterprise Reuse: Serves as a modular, plug-and-play labeling platform applicable across multiple immune cell types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving individual cell division histories obscured in bulk assays.
- Operational Value: Ensures assay standardization through covalent, stable labeling with minimal technical variance and no requirement for radioactive handling.
- Strategic Value: Reduces late-stage failure risk by confirming target-mediated biological activity early in the discovery cascade.
- Portfolio Impact: Enables objective, data-driven prioritization of immunomodulatory candidates based on proliferation efficacy and specificity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile cell handling, flow cytometry compensation, and fluorescence interpretation to avoid artifacts from dye quenching or aggregation.
- Dependent on access to calibrated flow cytometers with appropriate laser and filter sets for FITC-channel detection.
- Necessitates standardized washing protocols to remove extracellular dye and ensure signal specificity to intracellularly retained CFSE.
- Must account for potential dye toxicity at high concentrations or prolonged incubation, though source notes low toxicity under standard conditions.
- Requires light protection during staining and handling to prevent photobleaching and maintain signal integrity.
