Vorbereitung der neuronalen Kulturen aus Midgastrula Bühne Drosophila Embryonen

Dieses Video zeigt die Herstellung von primären neuronalen Kulturen aus midgastrula Bühne Drosophila-Embryos. Ansichten von lebenden Kulturen zeigen Zellen 1 Stunde nach dem Ausplattieren und differenzierten Neuronen nach 2 Tagen Wachstum in einem Bicarbonat-basierten definiertem Medium. Die Neuronen sind elektrisch erregbar und bilden synaptische Verbindungen.

Mein Name ist Diana Dowd und ich bin Professorin in der Abteilung für Entwicklungs- und Zellbiologie sowie für Anatomie und Neurobiologie an der UC Irvine. Und heute werde ich die Präparation von primären neuronalen Kulturen aus Drosophila-Embryonen demonstrieren. Und das bedeutet, dass alle Zellen aus einem mittleren Gastrostadium, dem Drosophila-Embryo, entnommen und in Zellkulturen gelegt werden.

Und wofür wir diese Kulturen verwenden, ist, um wirklich zu verstehen, was die Gene und Umweltfaktoren sind, die für die Regulierung der elektrischen Erregbarkeit und der synaptischen Übertragung zwischen Drosophila-Neuronen wichtig sind. Um diese Prozedur zu starten, müssen wir Drosophila-Embryonen sammeln. Dazu nehmen wir Eierauffangteller und verteilen ein wenig Hefepaste darauf.

Es ist ein günstiger Bodengrund für die erwachsenen Fliegen, um ihre Eier abzulegen. Wir kleben diese Teller auf Flaschen mit einer Population erwachsener Fliegen, normalerweise hundert bis 200 Fliegen. Und dann lassen wir die Fliegen, erwachsene Fliegen, etwa zwei bis drei Stunden lang ihre Eier ablegen.

Dann entfernen wir die Eizellentnahmeplatten, und das sind die Embryonen, die wir für das Kulturverfahren verwenden. Der nächste Schritt in diesem Verfahren besteht darin, die Embryonen zu enthüllen, und das bedeutet, dass wir die Embryonen tatsächlich entfernen. Wir tun dies, indem wir die Embryonen in einen Büchner-Trichter abwaschen, auf dem wir ein Stück Filterpapier haben, damit es die Embryonen auffängt.

Wir lassen sie im Büchner-Trichter in einer 50%igen Bleichlösung sitzen. Diese 50%ige Bleichlösung löst das Corion nicht nur auf, sondern dient auch als Teil unseres Sterilisationsverfahrens. Wir führen dieses Verfahren eigentlich nicht in der Haube durch, sondern außerhalb der Haube, also werden die Embryonen, sobald sie entchlort sind, in eine Petrischale gewaschen.

Wenn der Corian weg ist, ist die Membran ziemlich klebrig und haftet schön an einer Petrischale. Sie können dann destilliertes Wasser darüber gießen und das destillierte Wasser zwei- oder dreimal entfernen und das Wasser einfach abschütteln und die Embryonen werden an der Petrischale kleben. Verwenden Sie keine Gewebekultur-Plastikschale.

Daran halten sie sich nicht. Wir beginnen den sterilen Teil des Eingriffs, indem wir die Petrischalen der Embryonen nehmen und sie in eine Laminar-Flow-Haube bringen. Es handelt sich um bellco Abdeckeinlagen.

Sie sind unbeschichtet, aber sie wurden autoklaviert und nicht gewaschen. Wir finden, dass sie nicht sehr gut funktionieren. Wenn sie gewaschen werden, nehmen wir in der Regel vier Deckfolien heraus und legen sie in eine einzige Petrischale.

Wir werden also vier Embryokulturen in jeder Petrischale herstellen. Okay, die Petrischale ist im Grunde bereit, damit wir mit der Kultivierung beginnen können, und normalerweise mache ich 12 Kulturen, 12 bis 16 Kulturen auf einmal. Okay? Der Nährboden, den wir verwenden, ist ein relativ einfach definiertes Medium.

Es ist A-D-M-E-M-Basis, und wir stellen dieses flüssige Medium alle zwei Wochen her, damit es zwei Wochen im Kühlschrank haltbar bleibt. Dieser wurde sterilisiert. Es wurde durch einen 0,2-Mikron-Sterilfilter geleitet, und dann fügen wir dem Medium fünf Nahrungsergänzungsmittel hinzu.

Sie werden alle zwei Monate zubereitet und dann in Aliquoten eingefroren, die zu 10 mil des flüssigen Mediums hinzugefügt werden. Also entfernen wir einfach den Inhalt. Letztes, dann ist das einfach, wir invertieren dieses Medium nur vorsichtig, um es zu vermischen, und wir können loslegen. Okay.

Alles ist eingerichtet. Ich habe meine Kulturschale, die fertig ist, oder meine Petrischale, in der vier Deckgläser sind, griffbereit. Und jetzt nehme ich mein Gericht mit Embryonen und ich werde es tun, sie sitzen jetzt in dem destillierten Wasser.

Ich werde das destillierte Wasser entfernen, indem ich es einfach abschüttle. So mache ich es direkt in den Mülleimer. Und jetzt gieße ich etwa zwei Mühlen des Mediums auf diese Embryonen, und jetzt sind sie bereit, dass ich die Glasnadel tatsächlich in einzelne Embryonen einführe und den Inhalt entferne.

Man muss die Medien von außen haben. Wenn es da draußen Wasser gäbe, dann hätte man natürlich einen osmotischen Schock. Um mich nun darauf vorzubereiten, die Kulturen vorzubereiten, bevor ich den Inhalt des Embryos entnehme, gebe ich den Fünf-Mikroliter-Tropfen auf die Deckgläser.

Wenn Sie es zu lange stehen lassen, ändert sich der pH-Wert des Mediums. Okay, jetzt gebe ich einen Fünf-Mikroliter-Tropfen auf die Mitte jedes der vier Deckblätter. Es ist tatsächlich wichtig, dass diese Tropfen so intakt wie möglich bleiben.

Wenn sich das Medium über den gesamten Deckglas verteilt, dann werden die Zellen in einige plattiert, eine sehr dünne Flüssigkeitsschicht ist schwierig. Sie möchten, dass sie die Zellen in einen schönen, runden Tropfen Flüssigkeit füllen. Wie Sie dort sehen können, haben wir vier schöne runde Tropfen Flüssigkeit zum Mitnehmen bereit.

Und jetzt nehme ich eine der Pipetten, die ich gezogen habe, und befestige sie dann einfach an diesem Mundpipettenröhrchen. Sie können jedes beliebige Röhrchen verwenden, aber das Gute an diesem Röhrchen ist, dass es tatsächlich mit 100-Mikroliter-Pipetten von VWR geliefert wird. Und in denen, die wir haben, gibt es eine kleine Gummidichtung

Ich kann die Mundpipette, ich meine die Glaspipette, in dieses Ende der Pipette einführen. Und wenn ich dann den Inhalt des Embryos aufsauge, werde ich nicht weiter nach oben gehen, in die Region, in der er sich zu verengen beginnt. Da ist also dieser riesige Bereich, der mich mit dem Mäusesaugen hier oben von dem Ort trennt, an dem die Zellen sind.

Das gibt es also nicht, es gibt kein Problem mit Kontamination. Wenn Sie den Inhalt versehentlich in diesen Bereich saugen, werden Sie große Probleme mit der Kontamination haben. In unseren Laminar-Flow-Hauben haben wir Präpariermikroskope, die auf skopischer Basis arbeiten.

Dadurch kann Licht von unten in den Embryo eindringen, und das ermöglicht es uns, die Kopffurche und den Mitteldarm und die Vorstellungskraft zu sehen, die man sehen wird, wenn man sich die tatsächlichen Embryonen ansieht. Und so wählen wir tatsächlich das Stadium des Embryos aus, das für die Kultivierung wichtig ist, um den Inhalt des Embryos zu entfernen. Wir verwenden Glaspipetten und ziehen an einem normalen Mikroelektrodenabzieher, den wir für die Herstellung unserer Patch-Recording-Pipetten verwenden.

Uns ist es egal, wie die Einstellungen sind. Wir ziehen ziemlich feine Pipetten, weil wir die Pipette in der Schale neben dem Embryo in der Größe abbrechen werden, die wir wirklich wollen. Dann nehmen wir diese Glaspipetten, führen sie durch die Membran des Embryos und verwenden ein Mundsaugrohr, das an der Rückseite der Rückseite der Pipette befestigt ist.

Dann extrahieren wir den Inhalt des gesamten Embryos. Dann bewegen wir die Entnahme, nehmen die Pipette heraus und legen sie in eine andere Schale, die einen Deckschirm mit einem Fünf-Mikroliter-Tropfen Medium hat. Und wir stoßen den Inhalt des Embryos in diesen Fünf-Mikroliter-Tropfen aus.

Wir pipettierten mehrmals auf und ab, um die Zellen zu dispergieren, und ließen dann diese Abdeckung etwa 10 Minuten lang in der Schale gleiten, bevor wir die Schale mit zwei Mühlen Medium fluteten. Die Schalen der Zellen werden nach dem Plattieren in einen 5%CO2-Inkubator gegeben. Dies ist sehr wichtig, da es sich bei dem von uns verwendeten Medium um ein bikarbonatgepuffertes Medium handelt.

Wir haben einige HEPs drin, aber das reicht nicht aus, um in der Luftumgebung zu puffern. Und so muss man einen 5%CO2-Inkubator verwenden. Ideal ist jedoch eine relativ niedrige Temperatur um die 22 bis 23 Grad.

Also nehmen wir einen Standard-CO2-Inkubator, der aus Säugetierkulturen verwendet wird, und erhitzen ihn auf 37 Grad. Was wir tun, ist, dass wir die Heizung ausschalten, sie in unserem Labor stehen lassen und Eis in den Boden des Inkubators geben können, und das hält die Temperatur bei etwa 21 bis 25 Grad. Die andere Technik, die wir verwenden, besteht darin, dass wir wieder einen dieser Standard-Heiz-CO2-Inkubatoren nehmen und den Inkubator in einen Kühlraum stellen.

Dann können Sie den Inkubator tatsächlich recht effektiv auf 23 Grad heizen, wenn die Umgebungstemperatur kalte Raumtemperatur hat. Und das sind also die beiden Methoden, die wir verwenden, um ein Standard-Siegel zu haben, ein Säugetier-Siegel zum Brutkasten, um uns zu erlauben, zu überleben. In Ordnung, dies ist eine Kultur, die vor einer Stunde in der gleichen Vergrößerung plattiert wurde, die wir direkt nach dem Plattieren eine Stunde nach dem Plattieren gesehen haben.

Hier sehen wir Neuronen, die sich etwa zwei Tage lang differenziert haben. In Kultur haben sich die Neuroblasten ein oder mehrere Male geteilt und dann Neuronen hervorgebracht, die Prozesse ausdehnen, die ausgedehnte überlappende neurotische Netzwerke bilden. Hier haben wir zwei Zellkörper, die Kopf an Kopf stehen.

Der obere verlängert einen Gang bei 11 Uhr und der untere einen Gang bei fünf Uhr. Das sind ihre wichtigsten Erweiterungen. Und dann sieht man, dass sie feinere Äste bilden.

Diese haften sehr eng an dem Glassubstrat, und es gibt Prozesse, die Sie sehen können, die auch von anderen Zellen stammen, die diese überlappen. Und das sind Orte potenzieller synaptischer Verbindungen. Wir flickten eine dieser Zellen, und im Allgemeinen hatten sie mit dieser Prozessausarbeitung synaptische funktionelle synaptische Ströme.

Jetzt wachsen unsere Zellen 12 Stunden nach dem Plattieren in Kultur. Sie werden ziemlich schöne Prozesse verlängert haben. Unsere Standardphysiologie beginnen wir etwa ein bis zwei nach der Kultivierung.

Und man sieht, dass sie die Prozesse in den nächsten vier, fünf Tagen tatsächlich weiter wachsen lassen. Und wir haben von Zellen bis zu zwei Wochen in Kultur aufgenommen, aber die meisten unserer Aufnahmen sind zwischen zwei und sechs Tagen in Kultur mit diesen Kulturen, die wir dann gerade von Drosophila-Embryonen im mittleren Gastrostadium vorbereitet haben, wir haben Netzwerke von Neuronen, die in Kultur kommunizieren. Wir sind in der Lage, uns die Brenneigenschaften dieser Zellen tatsächlich anzusehen.

Sie haben vielfältige Brenneigenschaften. Sie feuern wiederholt, einige Zellen feuern wiederholt, andere Zellen feuern bei der Geburt, und diese Zellen sind hauptsächlich cholinerg oder GABAerg. Und wir schauen uns synaptische Ströme an, die von diesen vermittelt werden, von Nikotin-, Aach-, H-Rezeptoren und GABA-Rezeptoren.