Name: Vorbereitung der neuronalen Kulturen aus Midgastrula Bühne Drosophila Embryonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 7 s
Description: Lernen Sie die Herstellung primärer neuronaler Kulturen aus Drosophila-Embryonen in der Midgastrula-Phase. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung elektrischer Erregbarkeit und synaptischer Übertragung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde vom NIH NS27501 zu DKOD unterstützt. Zusätzliche Unterstützung für diese Arbeiten von einem HHMI Professor Grant zu DKOD.

I. Drosophila Embryo-Entnahme <ol><li> Bereiten Eiersammlung Platten <ol><li> Kochen 200 ml dH 2 O mit 8 g Agar </li><li> Abkühlen auf 50 ° C </li><li> 2 ml EtOH und 2 ml Essigsäure </li><li> Gießen Sie in 35 mm Kunststoff-Petrischalen, Tops </li><li> Cool und speichern in luftdichten Behälter bei 4 ° C </li><li> Ergibt ca. 80 Teller </li></ol></li><li> Bereiten Hefepaste <ol><li> Lösen Sie Fleishmans aktive Backhefe in Wasser zu fügen </li><li> Mikrowelle für 20-30 Sekunden, um Hefe zu töten (achten Sie auf Überkochen) </li><li> Shop in 10 ml-Spritze (ohne Kanüle) bei 4 ° C für 2 Wochen </li></ol></li><li> Fliegen: Die Erwachsenen für Eiersammlung werden in der Regel am produktivsten zwischen 3 und 14 Tage nach dem Austritt, sofern sie hatten Zugang zu frischen Lebensmitteln. Viele Mutanten Aktien haben die Fruchtbarkeit, die manifestiert sich in einer abgesenkten Satz von der Eiablage und eine Veränderung in dem Alter, in dem sie am produktivsten sind gesunken. Generell machen mehrere hundert Erwachsene für einen guten Eiablage Bevölkerung. </li><li> Vorgehensweise: Verteilen Sie eine dünne Schicht von Hefe auf einem Ei Sammlung Platte einfügen. Dies bietet ein günstiges Substrat für die Eiablage. Transfer erwachsenen Fliegen auf eine saubere Entnahme der Eizellen Flasche und Band der Sammlung Platte an der Mündung der Flasche. Lassen Sie das Fliegen in dieser Flaschen länger als 3-4 Stunden, da die Luftfeuchtigkeit steigt und die Fliegen zu bekommen in Paste und auf Seiten der Flasche stecken. </li></ol> II. Embryo Dechorionation mit Bleach <ol><li> Richten Sie einen Büchner-Trichter an eine Saugflasche an einen Aspirator. Legen Sie ein Stück Whatman Papier Nr. 1 in den Trichter. Mit Saug-laufen, nass das Papier mit sterilem destilliertem Wasser. </li><li> Spülen Embryonen aus der Sammlung Platten auf das Filterpapier mit einem Strom von Wasser aus einer Spritzflasche. </li><li> Spülen Sie sie in mehreren Bänden von sterilem Wasser, schalten Sie Aspirator, und fügen Sie dann einen Trichter von 50% Bleichmittel. Lassen Eiern sitzen 5-10 Minuten. Das Chorion wird in 1-2 Minuten aufgelöst werden, aber je länger Sie verlassen die Embryonen in der Bleiche die mehr der kontaminierenden Hefe zerstört werden. Suchen Sie sich keine Erwachsenen oder Larven, die aus Schale haben gespült. </li><li> Spülen Sie die Embryonen in eine sterile Petrischale (NICHT Gewebekultur) mit sterilem destilliertem Wasser. Viele der Embryonen wird der Boden der Schale haften, wenn es nicht bereits vorher benetzt. Spülen Sie mehrmals mit sterilem Wasser in dieses Gericht. </li><li> Untersuchen Sie die Embryonen mit Durchlicht herausgreifen Mitte Gastrulastadium Embryonen. </li></ol> III. Vorbereitung der einzelnen Embryokulturen <ol><li> Machen DDM1 (siehe Rezepte in Abschnitt IV) </li><li> Gießen Sie Wasser aus Schüssel von Embryonen kurz vor dem Züchten. Abdeckung Embryonen mit sterilen Medien. </li><li> Set aus 3, 35 mm Petrischalen. Legen Sie in 4 autoklaviert runden Deckgläschen in jedem Gericht. Auf jedem Deckglas, legte 5 ul Medium. Verwenden Sie Bellco Deckgläser-low Bleiglas coverlips. Bellco Biological Glaswaren 800-257-7043 Cat # 1943-00012 </li><li> Ziehen Sie einige ziemlich feinen Pipetten. Die Pipetten verwenden wir sind auf einem Narishige PP-83 Abziehers. Die genauen Abmessungen der Pipette sind nicht entscheidend und wir in der Regel ziehen sie feiner als wir wollen, und sie brechen Sie die Spitze in der gleichen Sichtfeld wie der Embryo, um die Größe zu messen. Sie wollen nicht zu saugen alle Embryonen in einem Rutsch, und Ihr nicht wollen, dass die Spitze so klein, dass es 5 Minuten dauert, saugen die Zellen. Ziel für irgendwo dazwischen. Untersuchen Sie die Embryonen mit Durchlicht und mit einem Mund Saugrohr an der Pipette, um den Inhalt des Embryos zu entfernen. Disperse die Zellen auf die vorbereitete Deckglas durch vorsichtiges Vertreibung der Zellen, um die Deckglas nah wie möglich. Vielleicht möchten Sie die Deckgläser mit höherer Leistung zu prüfen und weiter zu verstreuen die Zellen in der gleichen Weise. </li><li> Lassen Sie die Zellen sitzen nicht länger als 10 Minuten. Flood die Schüssel mit den Medien und setzen in Inkubator, 4-5% CO 2-Umgebung, wenn mit Hilfe von definierten Medium. Temperatur zwischen 22-24 ° C. Wir verwenden routinemäßig 23 ° C und 95% Luftfeuchtigkeit. Feuchtigkeit ist sehr wichtig, da Sie, um Verdunstung zu vermeiden möchten. Sie können eine Standard-Säugetier-Inkubator in einer Kühlzelle mit Temperaturkontrolle platziert wurde auf 23 ° C </li></ol> IV. DDM1 definiertem Medium für den Anbau der Kulturen <ol><li> Machen DMEM: Zu 100 ml Ham F12/DME Medien (DMEM) (Irvine Scientific # 9052). <ol><li> Add 0,476 g Hepes (20 mm) (Sigma # H-3375). Mix. </li><li> Add 1,25 ml L-Glutamin 200 mM (Irvine Scientific # 9317). Mix. </li><li> Filter in Kapuze mit 0,2 mu m Acetat-Spritzenfilter (need 2 Filter). </li><li> Der pH-Wert ist 6.64 und Osm 288. </li><li> Machen Aliquots von 10 ml in 15ml-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Lagerung bei 4 ° C für nicht länger als 2 Wochen. Hinweis: Verwenden Sie immer autoklaviert gefiltertem Wasser und in Containern, die für Medien und Ergänzungen vorbehalten sind zu machen. Niemals einer pH-Elektrode oder Rührstab für andere Zwecke in Media.To verwendet machen DDM1: In Ergänzung unten aufgeführtenzu DMEM kurz vor Kultivierung. </li></ol></li><li> Zu 10 ml DMEM hinzufügen: <ul><li> 100 ul Transferrin </li><li> 100 ul Putrescin </li><li> 100 ul Selenium </li><li> 100 ul Progesteron </li><li> 50 pl Insulin </li></ul></li></ol>

<ol><li>Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bases+of+behavioral+plasticity%3A+Establishing+and+modifying+synaptic+circuits+in+the+Drosophila+Genetic+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System.</a> J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).</li>
<li>O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-gated+currents+and+firing+properties+of+embryonic+Drosophila+neurons+grown+in+a+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium.</a> J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).</li>
<li>Lee, D., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+excitatory+synaptic+transmission+mediated+by+nAChR+in+cultured+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons.</a> J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).</li>
<li>Lee, D., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic-AMP-dependent+plasticity+at+excitatory+cholinergic+synapses+in+Drosophila+neurons%3A+Alterations+in+the+memory+mutant+dunce%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cyclic-AMP-dependent plasticity at excitatory cholinergic synapses in Drosophila neurons: Alterations in the memory mutant dunce.</a> J. Neurosci. 20, 2104-2111 (2000).</li>
<li>Hodges, D. D., Lee, D., Boswell, K., Preston, C. F., Hall, L. M., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tipE+regulates+sodium-dependent+repetitive+firing+in+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">tipE regulates sodium-dependent repetitive firing in Drosophila neurons.</a> Mol. Cell Neurosci. 19, 402-416 (2002).</li>
<li>Lee, D., Su, H., Dowd, O., K, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+receptors+containing+Rdl+subunits+mediate+fast+inhibitory+synaptic+transmission+in+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA receptors containing Rdl subunits mediate fast inhibitory synaptic transmission in Drosophila neurons.</a> J. Neurosci. 23, 4625-4634 (2003).</li>
</ol>

In Drosophila Kulturen aus midgastrula Embryonen bereitete den Neuronen entstehen aus Neuroblasten Vorläufer, von denen viele vor der Differenzierung in vitro zu teilen. Dieses System bietet somit eine einmalige Gelegenheit für die Exploration von genetischen und umweltbedingten Faktoren wichtig in sehr frühen Phasen der neuronalen Entwicklung (Rohrbaugh et al., 2003). Wir haben gezeigt, dass Neurone in einer einfachen Definition-Medium in elektrisch erregbaren Neuronen, bilden auch funktionelle synaptische Verbindungen (O Dowd, 1995; Lee u...

Die Kulturen in diesem Medien getroffen werden, sind eine 5% ige CO2-Inkubator bei etwa 22-24 ° C gehalten werden Wir verwenden eine Standard-Säugetier-Zellkultur-Inkubator in einem kalten Raum gebracht und erhitzt, um 23 ° C. Immer verwendet autoklaviert gefiltertem Wasser und machen in Containern, die für Medien und Ergänzungen vorbehalten sind. Niemals ein pH-Meter oder Rührstab für andere Zwecke in den Medien verwendet.

vorbereitung der neuronalen kulturen aus midgastrula bühne drosophila embryonen

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Herstellung von primären neuronalen Kulturen aus midgastrula Bühne Drosophila-Embryos. Die Methoden für die Erhebung Embryonen und ihre dechorionation mit Bleichmittel demonstriert. Mit einer Glaspipette an einem Mund-Saugrohr, illustrieren wir die Entfernung aller Zellen, die aus einzelnen Embryonen. Das Verfahren zum Dispergieren Zellen aus jeder embyro in einen kleinen (5 l) Tropfen Medium auf einer unbeschichteten Deckglas wird demonstriert. Ein Blick durch das Mikroskop bei 1 Stunde nach dem Ausplattieren zeigt die bevorzugte Zelldichte. Die meisten der Zellen, wenn in definierten Medium überleben Neuroblasten, dass ein oder mehrere Male in der Kultur teilen, bevor Erweiterung neuritischen Prozesse durch 12-24 Stunden. Ein Blick durch das Mikroskop zeigt den Grad der Neuritenwachstum und Verzweigung in eine gesunde Kultur in 2 Tage in vitro zu erwarten. Die Kulturen werden in einer einfachen Bicarbonat Basis definiert Medium, in einer 5% CO 2-Inkubator bei 22-24 ° C. Neuritischen Prozesse weiter zu erarbeiten über die erste Woche in der Kultur, und wenn sie in Kontakt mit Neuriten aus dem benachbarten Zellen bilden sie oft funktionelle synaptische Verbindungen. Neuronen in diesen Kulturen auszudrücken spannungsabhängigen Natrium, Kalzium und Kalium-Kanälen und sind elektrisch erregbar. Diese Kultur ist nützlich für die Untersuchung molekularer genetischen und umweltbedingten Faktoren, die neuronale Differenzierung, Erregbarkeit und Synapsenbildung / Funktion zu regulieren.

Dieses Video zeigt die Herstellung von primären neuronalen Kulturen aus midgastrula Bühne Drosophila-Embryos. Ansichten von lebenden Kulturen zeigen Zellen 1 Stunde nach dem Ausplattieren und differenzierten Neuronen nach 2 Tagen Wachstum in einem Bicarbonat-basierten definiertem Medium. Die Neuronen sind elektrisch erregbar und bilden synaptische Verbindungen.

Vorbereitung der neuronalen Kulturen aus Midgastrula Bühne Drosophila Embryonen

Dieses Video veranschaulicht das Verfahren zur Herstellung primärer Neuronenkulturen aus Drosophila-Embryonen im mittleren Gastrulationsstadium. Die Methoden zur Gewinnung von Embryonen ...

Mein Name ist Diana Dowd, und ich bin Professorin am Fachbereich Entwicklungsbiochemie und Zellbiologie sowie Anatomie und Neurobiologie an der UC Irvine. Heute werde ich die Herstellung primärer neuronaler Kulturen aus Drosophila-Embryonen demonstrieren. Dabei werden sämtliche Zellen eines Drosophila-Embryos im mittleren Gastrulationsstadium entnommen und in Zellkultur überführt.Und wozu wir diese Kulturen verwenden, ist, die Gene und Umweltfaktoren besser zu verstehen, die für die Regulation der elektrischen Erregbarkeit und der synaptischen Übertragung zwischen Drosophila-Neuronen wichtig sind. Um dieses Verfahren zu beginnen, müssen wir Drosophila-Embryonen sammeln. Dazu nehmen wir Eiersammelplatten und verteilen etwas Hefepaste darauf.Es ist ein günstiges Substrat für die ausgewachsenen Fliegen, um ihre Eier abzulegen. Wir stellen diese Platten auf Flaschen, die eine Population ausgewachsener Fliegen enthalten, gewöhnlich hundert bis 200 Fliegen. Anschließend lassen wir die Fliegen, die ausgewachsenen Fliegen, etwa zwei bis drei Stunden lang ihre Eier ablegen.Dann entfernen wir die Eiersammelplatten, und dies sind die Embryonen, die wir für das Kultivierungsverfahren verwenden

preparation-neuronal-cultures-from-midgastrula-stage-drosophila

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt die Herstellung von primären neuronalen Kulturen aus den Gehirnen von Spätstadium Drosophila Puppen. Ansichten von lebenden Kulturen zeigen Neuritenwachstum und Bildgebung von Calcium-Spiegel mit Fura-2.

Primäre neuronale Kulturen aus den Gehirnen von Late Stage Drosophila Puppen

In utero Elektroporation ist eine wertvolle Methode zur Transfektion von neuronalen Vorläuferzellen in vivo. Abhängig von der Platzierung der Elektroden und der Entwicklungspsychologie Zeitpunkt der Elektroporation können bestimmte Teilmengen von kortikalen Zellen ausgerichtet werden. Gezielte Zellen können dann in vivo oder in vitro für die Auswirkungen der genetischen Veränderung untersucht werden.

In utero Elektroporation gefolgt von primären neuronalen Kultur für ein Studium Gene Function in Subset von kortikalen Neuronen

Wir bieten Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von primären Zellen losgelöst...

Primären Zellkulturen aus Drosophila Gastrula Embryonen

Dieses Video beschreibt eine Methode zur Kultivierung dopaminerger Neuronen aus embryonalem Hirngewebe von Mäusen. Der Prozess umfasst die Behandlung des Mittelhirns mit einem proteolytischen Enzym, die Ablösung der Zellen und die Kultivierung auf polymerbeschichteten Deckgläsern in einem nährstoffreichen Medium mit Antibiotika für ihr Wachstum und ihre langfristige Lebensfähigkeit.

Kultivierung und Erhaltung dopaminerger Neuronen aus embryonalem Hirngewebe der Maus

Dieses Video zeigt ein Protokoll zur Identifizierung exogener Faktoren, die die Reaktivierung von Drosophila-neuralen Stammzellen des Gehirns aus ihrem Ruhezustand initiieren. Frisch geschlüpfte Larven werden präpariert, um ihre Gehirne zu isolieren, die dann mit oder ohne Testhormon in Medien kultiviert werden, um das Potenzial des Hormons zur Reaktivierung und Proliferation von neuralen Stammzellen zu bewerten.

Analyse der Reaktivierung neuraler Stammzellen in kultivierten Drosophila-Hirnexplantaten

Das Video zeigt den Prozess der Isolierung und Kultivierung von Dopamin-Neuronen aus dem Mittelhirn von Mausembryonen. Die isolierten ventralen Mittelhirnböden werden mit Hilfe von Enzymen dissoziiert. Die resultierenden Dopamin-Neuronen werden geerntet und in Mikroinseln in Multi-Well-Platten übertragen. Die Zellen werden mit einem Dopamin-Neuronenmedium inkubiert, um die Zellen in den Mikroinseln auf einer hohen Dichte zu halten.

Isolierung und Kultivierung von primären embryonalen Dopamin-Neuronen aus dem Mittelhirn der Maus

Quelle: Jeong, S. Visualisierung des axonalen Projektionsmusters embryonaler Motoneuronen in Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt die Visualisierung von axonalen Projektionen in Drosophila Embryonen. Die Immunmarkierung von Motoneuronen, die präzise Dissektion zur Freilegung neuronaler Strukturen und die differentielle Interferenzkontrastmikroskopie zeigen zusammen eine detaillierte neuronale Architektur, wobei die axonalen Projektionsmuster hervorgehoben werden.

Visualisierung axonaler Projektionsmuster embryonaler Motoneuronen in Drosophila

Drosophila S2-Zellen und kultivierten Neuronen sind große Systeme für die Bildgebung von motorbetriebenen Organellentransport in vivo. Hier beschreiben wir ausführliche Protokolle für die Kultivierung beider Zelltypen, die Abbildung und Analyse des Verkehrs.

Organell-Transport in kultivierten Drosophila Zellen: S2-Zelllinie und primären Neuronen.

Die Ursachen der Degeneration von dopaminergen Neuronen im Mittelhirn während der Parkinson-Krankheit sind nicht vollständig geklärt. Zellkultursysteme stellen ein wesentliches Werkzeug für die Untersuchung der neurophysiologischen Eigenschaften dieser Neuronen dar. Hier stellen wir ein optimiertes Protokoll vor, das für die in vitro Modellierung der Neurodegeneration verwendet werden kann.

Isolation, Kultur und langfristige Wartung von Primär mesencephalen dopaminergen Neuronen aus embryonalen Nagetier Brains

Diese Arbeit beschreibt eine Standard-Immunhistochemie-Methode zur Visualisierung von Motor-Neuronen-Projektionen von späten Stadium-16 Drosophila Melanogaster Embryonen . Die gefilterte Präparation von festen Embryonen, die mit FasII-Antikörper gefärbt wurden, bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Gene zu charakterisieren, die für die motorische Axon-Pathfindung und die Zielerkennung während der neuronalen Entwicklung erforderlich sind.

Visualisierung des axonalen Projektionsmusters der embryonalen motorischen Neuronen in<em&gt; Drosophila</em

Eine Methode zur Reaktivierung ruhender neuraler Stammzellen in kultivierten Drosophila-Hirnexplantationen wurde etabliert. Mit dieser Methode kann die Rolle systemischer Signale von gewebeintrinsischen Signalen bei der Regulation der Ruhe, des Eintritts und des Austritts neuronaler Stammzellen entkoppelt werden.

Reaktivierung neuronaler Stammzellen in kultivierten Drosophila-Hirnexplantationen

Lernen Sie die Herstellung primärer neuronaler Kulturen aus Drosophila-Embryonen in der Midgastrula-Phase. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung elektrischer Erregbarkeit und synaptischer Übertragung.

Vorbereitung der neuronalen Kulturen aus Midgastrula Bühne Drosophila Embryonen

Weitere Videos entdecken