Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Aktivierung von BK-Kanälen unter kontrollierter Spannung zu messen, während gleichzeitig die intrazelluläre Lösung gesteuert wird. Dies wird erreicht, indem BK-Kanäle zunächst durch Injektion von BK-Kanal-mRNA in Xenopus-Zellen exprimiert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht in der Vorbereitung des Perfusionsystems.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, eine Giga-Dichtung zwischen der Oozytenmembran und der Patch-Pipette zu bilden. Der letzte Schritt des Verfahrens ist das Auslösen des Membranflecks. Letztendlich zeigen Ergebnisse, die mit der Patch-Clamp-Technologie in Kombination mit einem Perfusionsystem erzielt wurden, dass BK-Kanäle durch Änderungen der Spannung und der Kalziumkonzentration aktiviert werden.

Hallo, ich bin Jin Cho Young aus dem Labor von Dr. Jamie Zu an der Washington University. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, darunter auch Fragen zum molekularen Mechanismus der Ionenkanalaktivierung. Beginnen wir also.

Der erste Schritt des Verfahrens beginnt einige Tage vor der Patch-Clamp-Messung und verwendet BK-Kanal-mRNA, die in vitro transkribiert wurde. Nach der Gewinnung der Xenopus laevis-Oozyten im Stadium fünf bis sechs injizieren Sie 0,05 bis 50 Nanogramm BK-Kanal-mRNA in ein Oozyt. Verwenden Sie hierzu einen Nano-Injector mit zwei automatischen Nanoliter-Injektoren.

Wiederholen Sie die Injektion an einem Dutzend Oozyten für jede mRNA nach der Injektion. Spülen Sie die Oozyten zweimal mit ND96-Lösung. Anschließend geben Sie die Oozyten in eine Kulturplatte und inkubieren sie bei 18 Grad Celsius für zwei oder mehr Tage, um den Oozyten Zeit für die Expression des BK-Kanals zu geben.

Nach zwei bis fünf Tagen der Inkubation sollten die Oozyten BK-Kanäle exprimieren und sind somit bereits für das Patch-Clamp-Verfahren bereit. Bevor Sie die Oozyten handhaben, richten Sie alle anderen benötigten Komponenten für das Patch-Clamp-Verfahren ein, beginnend mit dem Perfusionsystem. Das hier gezeigte System ist die automatisierte Ventilverbindung.

Ein 16-faches Perfusionsystem verwendet unter Druck stehenden Stickstoff, um Perfusionslösungen aus den Lösungsreservoiren durch die Perfusionsschläuche und in den Perfusionsstift sowie dessen Spitze zu drücken. Der Fluss jedes Stroms der Perfusionslösung wird durch ein Reservoirventil und ein elektronisches Ventil gesteuert. In diesem Protokoll wird eines der Reservoire nicht unter Druck gesetzt und dient sowohl als Abfallsammler als auch als Druckentlastungssystem.

Puffusionslösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen an Calcium oder Magnesium können vor den Experimenten hergestellt werden. Fügen Sie die Puffusionslösungen den Reservoirs hinzu und beschriften Sie jede Lösung entsprechend ihrer Calcium- oder Magnesiumkonzentration. Um das Puffusionssystem einzurichten, verbinden Sie zuerst die Schläuche mit dem Puffusionsstift.

Schalten Sie dann den elektronischen Ventilcontroller ein und öffnen Sie die elektronischen Ventile, um sicherzustellen, dass die Schläuche und der Perfusionsstift frei von Verstopfungen und Luftblasen sind. Drücken Sie deionisiertes Wasser mithilfe einer mit deionisiertem Wasser gefüllten Spritze durch jeden Schlauch. Verbinden Sie an dieser Stelle die Schläuche mit den Lösungsreservoirs und öffnen Sie das Ventil der Gasflasche, um Druckluft mit Stickstoff aufzubringen.

Öffnen Sie ein Reservoirventil, um die Tubing mit einer der Reservoirlösungen zu füllen. Klicken Sie gegebenenfalls auf das Reservoirventil, um Blasen in der Lösung zu entfernen. Schließen Sie das Reservoirventil, nachdem die Tubing mit Lösung gefüllt ist, füllen Sie die Perfusionspitze mit Wasser und schrauben Sie sie auf den Perfusionsstift.

Achten Sie darauf, keine Blasen einzuschließen. Befestigen Sie beim Anschließen der Spitze den Perfusionsstift mit Modelliermasse an der Badplattform und stellen Sie sicher, dass sich die Perfusionsöffnung im Bereich des Bades befindet. Das Perfusionsystem ist nun eingerichtet.

Fügen Sie an dieser Stelle entionisiertes Wasser zum Bad hinzu. Stellen Sie sicher, dass die Perfusionspitze im Wasser eingetaucht ist. Überprüfen Sie, ob jede Perfusionslösung korrekt aus der Perfusionspitze austritt.

Schließen Sie das elektronische Ventil, das mit dem Schlauch des Abfallbehälters verbunden ist, und öffnen Sie das Ventil für eine der Perfusionslösungen. Beobachten Sie unter dem Mikroskop den Strahl der Perfusionsflüssigkeit, der aus der Perfusionspitze austritt. Schließen Sie das Ventil für diese Perfusionslösung und öffnen Sie das Ventil für den Abfallbehälter.

Der Perfusionsstrahl sollte fast verschwinden. Wiederholen Sie denselben Test für jede der Perfusionslösungen. Nachdem Sie überprüft haben, dass alle Perfusionslösungen korrekt fließen, ersetzen Sie das deionisierte Wasser im Bad durch die gewünschte Badelösung.

Jetzt ist es an der Zeit, die Aufzeichnungsvorrichtung aufzubauen. Sie sollten die silberne Aufzeichnungselektrode vor jeder Patch-Clamp-Sitzung erneut mit Silberchlorid beschichten. Entfernen Sie zuerst den Elektrodendraht aus dem Pipettenhalter und tauchen Sie die Spitze des Elektrodenfadens zur Hälfte in ein Gefäß mit frischer Bleichlauge für mindestens 15 Minuten ein.

Dadurch bildet sich eine Schicht aus Silberchlorid auf dem Draht. Spülen Sie den Elektrodendraht mit entionisiertem Wasser ab und trocknen Sie ihn vorsichtig ab. Bringen Sie dann die Silber-Silberchlorid-Elektrode wieder im Pipettenhalter an.

Schalten Sie nun Ihren Computer ein. Stecken Sie den Hardware-Schlüssel in den Druckerport Ihres Computers. Der Hardware-Schlüssel muss eingesteckt sein, damit Sie die Software zur Datenerfassung, also HEA pulse, verwenden können.

Schalten Sie den Verstärker ein und starten Sie die Software zur Datenerfassung. HEA-Puls. Laden Sie die Protokolldatei und passen Sie die Konfigurationseinstellungen wie die Reizskala an.

Das Ziel der Anpassung der Konfigurationseinstellungen besteht darin, sicherzustellen, dass das Testpotential exakt dem Befehlspotential entspricht. Nun sind wir bereit, die Oozyten vorzubereiten. Entnehmen Sie die Oozyten aus dem Inkubator.

Das Oozyt fünf bis zehn Minuten in die Abtragungslösung eintauchen. Die Abtragungslösung löst die Vitellinmembran von der Plasmamembran, wodurch das Abtragen der Vitellinmembran ermöglicht wird. Nach fünf bis zehn Minuten die Vitellinmembran vorsichtig vom Oozyt abziehen.

Unter Verwendung von zwei Pinzetten. Eine Divi-OC-Stelle ist äußerst empfindlich und sollte daher so wenig wie nötig bewegt werden. Achten Sie darauf, die Devi-Oozyte weder Luft noch Blasen auszusetzen, und verwenden Sie eine Glaspipette, die mit ausreichend Lösung gefüllt ist, um die Oozyte in das Bad zu überführen.

Die Kanäle auf der Oozytenmembran sind nun freigelegt und bereit für die Patch-Pipette. Ziehen Sie eine Patch-Pipette, indem Sie ein Glas-Kapillarrohr in den Mikropipettenzieher einsetzen. Untersuchen Sie die Pipetten unter einem Mikroskop, um Form und Öffnungsdurchmesser der Spitze zu bestimmen.

Der Öffnungsdurchmesser sollte zwei bis vier Mikrometer betragen, um den kapazitiven Strom während der Aufzeichnung zu verringern, und um eine glatte Spitze sicherzustellen, die Spitze mit Wachs beschichten und anschließend abbrennen. Unter einem Mikroskop polieren. Die Pipettenspitze füllen, indem die Spitze der Pipette in die Pipettenlösung eingetaucht und der Kolben angezogen wird.

Dadurch wird die Spitze der Pipette benetzt. Füllen Sie die Pipette anschließend zu einem Drittel mit Pipettenlösung unter Verwendung einer Spritze. Danach setzen Sie die Pipette in den Pipettenhalter mit der Silber-Silberchlorid-Elektrode hinein.

Stellen Sie sicher, dass die Drahtelektrode mit der Pipettenlösung in Kontakt steht. Der nächste Schritt besteht darin, einen inside-out-Patch aus dem vorbereiteten Oozyt zu präparieren. Suchen Sie zunächst unter dem Mikroskop den klaren Rand des Oozyten.

Bringen Sie mit Hilfe des Manipulators die Patch-Pipette nahe an die Oozyte heran und stellen Sie sicher, dass sie untergetaucht ist. Notieren Sie im Badlösung den Serienwiderstand der Pipette. Der ideale Serienwiderstand der Patch-Pipette liegt zwischen ein und 1,5 Milliohm, wenn sie mit Pipettenlösung gefüllt und in Badlösung untergetaucht ist.

Drücken Sie die Pipette nun langsam gegen die Oozyte, bis der Widerstand sich etwa verdoppelt hat. Erzeugen Sie einen Gigaohm-Siegel, indem Sie vorsichtig über ein mit dem Pipettenhalter verbundenes Saugrohr durch den Mund Saugdruck ausüben. Nach Bestätigung der Bildung eines Gigaseals stabilisieren Sie den Patch, indem Sie ihn einige Minuten lang bei minus 30 Millivolt halten.

Um einen Inside-Out-Patch zu erhalten, schneiden Sie den Patch durch schnelles Vorstoßen der Pipette weiter in die OO-Stelle und anschließendes vorsichtiges Zurückziehen aus dieser heraus. Der Inside-Out-Patch ist nun bereit für die Patch-Clamp-Technik. Bewegen Sie die Pipette, die den Inside-Out-Patch hält, auf etwa 100 Mikrometer Abstand von der Öffnung der Perfusionspitze.

Schließen Sie das elektronische Ventil für das Sammeln des Abfalls und öffnen Sie das Reservoirventil für die gewünschte Perfusionslösung. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Ströme über die Membran. Ändern Sie die Spannung und die Perfusionslösungen nach Bedarf.

Wenn Sie mit der Aufnahme fertig sind, reinigen Sie den Tubing-Stift und die Spitze, indem Sie entionisiertes Wasser durchschicken, um Verstopfungen zu vermeiden. Die hier erhaltenen Patch-Clamp-Aufnahmen zeigen, dass die Wildtyp-BK-Kanäle in einem Oozyten-Membranpatch sowohl auf Spannung als auch auf Calcium reagieren. Diese Abbildung zeigt eine Patch-Aufnahme mit nominell null Calcium in der Perfusionslösung.

Die Rechteckwellen über den Stromspuren zeigen die an den Patch angelegte Spannung an. Es wurden vier Spannungen im Bereich von 50 Millivolt bis 200 Millivolt in Schritten von 50 Millivolt angelegt. Der maximale Strom von etwa zwei Nanoampere wurde bei der maximalen Spannung von 200 Millivolt erreicht.

Diese Zunahme der Stromamplitude mit steigender Spannung zeigte an, dass die Öffnungswahrscheinlichkeit der BK-Kanäle mit der Spannung anstieg. Diese Abbildung zeigt die Reaktion des inside-out-Patches auf verschiedene Spannungen. Bei einer Kalziumkonzentration von einem Mikromolar in der Perfusionslösung wurden Spannungssprünge angelegt.

Wie in der vorherigen Abbildung zu sehen, stieg die Reaktion auf den 200 Millivolt-Spannungsschritt oben auf etwa drei Nanoampere, wenn Kalzium in der Perfu acht vorhanden war, im Vergleich zu zwei Nanoampere ohne Kalzium. Dies zeigt, dass die Öffnungswahrscheinlichkeit der BK-Kanäle in Gegenwart von Kalzium zunahm. Zusammenfassend zeigte dieses Patch-Clamp-Verfahren, dass die BK-Kanäle spannungs- und kalziumabhängig sind.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Aktivierung des Eisenkanals mittels der Patch-Clamp-Technik in Kombination mit einem Pro-Fueling-System aufgezeichnet wird. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.