Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Aktivierung des BK-Kanals unter kontrollierter Spannung aufzuzeichnen und gleichzeitig die intrazelluläre Lösung zu steuern. Dies wird erreicht, indem zunächst BK-Kanäle in Xenopus-Zyten exprimiert werden, indem ihnen BK-Kanal-mRNA injiziert wird. Der zweite Schritt des Eingriffs ist die Vorbereitung des Perfusionssystems.

Der dritte Schritt des Eingriffs besteht darin, einen Giga-Seal zwischen der Eizellmembran und der Patch-Pipette zu bilden. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, das Membranpflaster herauszuschneiden. Letztendlich zeigen die Ergebnisse, die durch den Einsatz der Patch-Clamp-Technologie in Verbindung mit einem Profusionssystem erzielt wurden, dass BK-Kanäle durch Änderungen der Spannung und der Kalziumkonzentration aktiviert werden.

Hallo, ich bin Jin Cho Young vom Dr. Jamie Zus Labor an der Washington University. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, einschließlich Fragen zum molekularen Mechanismus der Ionenkanalaktivierung. Also lasst uns loslegen.

Der erste Schritt des Verfahrens beginnt einige Tage vor der Patch-Klemmung und verwendet BK-Kanal-mRNA, die in vitro transkribiert wurde. Nach der Ernte der Xenopus Lavu Cytes der Stadien fünf bis sechs injizieren Sie 0,05 bis 50 Nanogramm BK-Kanal-mRNA in einen Zyten. Mit einem Nano-Inject zwei Auto-Nanoliter-Injektoren.

Wiederholen Sie die Injektion auf ein Dutzend Eizellen für jede mRNA nach der Injektion. Spülen Sie die Eizellen zweimal mit der ND 96-Lösung. Legen Sie dann die Eizellen in eine Kulturplatte und inkubieren Sie sie zwei oder mehr Tage lang bei 18 Grad Celsius, damit die Eizellen Zeit haben, den BK-Kanal zu exprimieren.

Nach zwei bis fünf Tagen Inkubation sollten die Eizellen BK-Kanäle exprimieren und sind somit bereits für das Patch-Clamping bereit. Bevor Sie mit den Eizellen umgehen, richten Sie alles andere ein, was Sie für das Patch-Clamping benötigen, beginnend mit dem Perfusionssystem. Bei dem hier gezeigten System handelt es sich um den automatischen Ventilverketter.

16 Profusion System Druckbeaufschlagter Stickstoff drückt Profusionslösungen aus den Lösungsbehältern durch die Profusionsschläuche in den Profusionsstift und die Spitze. Der Durchfluss jedes Stroms der Profusionslösung wird durch ein Reservoirventil und ein elektronisches Ventil gesteuert. In diesem Protokoll wird eines der Reservoirs nicht unter Druck gesetzt und fungiert als Abfallsammler sowie als Druckentlastungsmechanismus.

Vor den Versuchen können Perfusionslösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen von Calcium oder Magnesium hergestellt werden. Geben Sie die Perfusionslösungen in die Reservoire und beschriften Sie jede einzelne, um die Konzentration von Kalzium oder Magnesium anzugeben. Um das Profusionssystem einzurichten, verbinden Sie zuerst die Schläuche mit dem Profusionsstift

Schalten Sie dann die elektronische Ventilsteuerung ein und öffnen Sie die elektronischen Ventile, um sicherzustellen, dass die Schläuche und der Profusionsstift frei von Verstopfungen und Luftblasen sind. Drücken Sie entionisiertes Wasser mit einer mit deionisiertem Wasser gefüllten Spritze durch jeden Schlauch. Verbinden Sie an dieser Stelle die Schläuche mit den Lösungsbehältern und öffnen Sie das Ventil der Gasflasche, um Stickstoff unter Druck zu setzen.

Öffnen Sie ein Reservoirventil, um den Schlauch mit einer der Reservoirlösungen zu füllen. Klicken Sie bei Bedarf auf das Vorratsventil, um Blasen in der Lösung zu entfernen. Schließen Sie das Reservoirventil, nachdem der Schlauch mit Lösung gefüllt ist, füllen Sie die Perfusionsspitze mit Wasser und schrauben Sie sie auf den Perfusionsstift

Achte darauf, dass keine Blasen eingeschlossen werden. Befestigen Sie beim Verbinden der Spitze den Perfusionsstift mit Modelliermasse auf der Badewannenbühne und achten Sie darauf, dass sich die Profusionsspitze im Badewannenraum befindet. Das Profusionssystem ist nun eingerichtet.

Geben Sie an dieser Stelle entionisiertes Wasser in das Bad. Stellen Sie sicher, dass die Profusion-Spitze im Wasser ist. Prüfen Sie, ob jede Perfusionslösung korrekt aus der Perfusionsspitze austritt.

Schließen Sie das elektronische Ventil, das mit dem Schlauch des Abfallsammlers verbunden ist, und öffnen Sie das Ventil für eine der Profusionslösungen. Beobachten Sie unter dem Mikroskop den Strahl der Profusionsflüssigkeit, der aus der Perfusionsspitze austritt. Schließen Sie das Ventil für diese Fülllösung und öffnen Sie das Ventil für den Abfallsammler.

Der Profusionsstrahl sollte fast verschwinden. Wiederholen Sie den gleichen Test für jede der Perfusionslösungen. Wenn Sie überprüft haben, dass alle Perfusionslösungen korrekt fließen, ersetzen Sie das entionisierte Wasser im Bad durch die gewünschte Badlösung.

Jetzt geht es an den Aufbau des Aufnahmegeräts. Sie sollten die Silberaufzeichnungselektrode vor jeder Patch-Klemmsitzung mit Silberchlorid neu beschichten. Entfernen Sie zuerst den Elektrodendraht aus dem Pipettenhalter und tauchen Sie die obere Hälfte des Elektrodendrahts mindestens 15 Minuten lang in ein Fläschchen mit frischem Bleichmittel.

Dadurch wird eine Schicht aus Silberchlorid auf dem Draht abgelagert. Spülen Sie den Elektrodendraht mit entionisiertem Wasser ab und tupfen Sie ihn trocken. Setzen Sie dann die Silber-Silberchlorid-Elektrode wieder in den Pipettenhalter ein.

Schalten Sie nun Ihren Computer ein. Stecken Sie den Hardwareschlüssel in den Druckeranschluss Ihres Computers. Der Hardware-Key muss eingesteckt sein, damit Sie die Datenerfassungssoftware verwenden können, bei der es sich um HEA pulse handelt.

Schalten Sie den Verstärker ein und starten Sie die Datenerfassungssoftware. HEA-Puls. Laden Sie die Protokolldatei und passen Sie die Konfigurationseinstellungen wie z.B. die Stimulusskala an.

Das Ziel beim Anpassen der Konfigurationseinstellungen besteht darin, sicherzustellen, dass das Testpotenzial genau dem Befehlspotenzial entspricht. Jetzt sind wir bereit, die Eizellen vorzubereiten. Entnehmen Sie die Eizellen aus dem Inkubator.

Tauchen Sie die Eizelle fünf bis 10 Minuten lang in Stripping-Lösung. Die Stripping-Lösung löst die viel-Membran von der Plasmamembran, wodurch es möglich wird, die vitel-Membran zu. Nach fünf bis 10 Minuten entfernen Sie vorsichtig die Vitelmembran von der Eizelle.

Mit zwei Pinzetten. Ein Divi OC Standort ist extrem fragil und sollte daher so wenig wie nötig bewegt werden. Achten Sie darauf, dass die Devi-Eizelle nicht Luft oder Blasen ausgesetzt wird, verwenden Sie eine Glaspipette, die mit genügend Lösung gefüllt ist, um die Eizelle in das Bad zu überführen.

Die Kanäle auf der Eizellmembran sind nun freigelegt und bereit für die Patch-Pipette. Ziehen Sie eine Patch-Pipette, indem Sie ein Glaskapillarröhrchen in den Mikropipettenabzieher einführen. Beobachten Sie die Pipetten unter einem Mikroskop, um die Spitzenform und den Öffnungsdurchmesser zu bestimmen.

Der Öffnungsdurchmesser sollte zwei bis vier Mikrometer betragen, um den kapazitiven Strom während der Aufnahme zu reduzieren und eine glatte Spitze zu gewährleisten, die Spitze mit Wachs beschichten und dann abfeuern. Polieren Sie es unter dem Mikroskop. Füllen Sie die Pipettenspitze, indem Sie die Spitze der Pipette in die Pipettenlösung legen und den Kolben ziehen.

Dadurch wird die Spitze der Pipette benetzt. Füllen Sie anschließend die Pipette mit einer Spritze zu einem Drittel mit Pipettenlösung. Legen Sie dann die Pipette mit der Silber-Silberchlorid-Elektrode in den Pipettenhalter.

Stellen Sie sicher, dass die Drahtelektrode mit der Pipettenlösung in Kontakt kommt. Der nächste Schritt besteht darin, ein Inside-Out-Pflaster aus der vorbereiteten Eizelle herauszuschneiden. Finden Sie zunächst den klaren Rand der Eizelle unter dem Mikroskop.

Bewegen Sie die Patch-Pipette mit dem Manipulator nahe an die Eizelle und stellen Sie sicher, dass sie untergetaucht ist. Erfassen Sie in der Badlösung den Serienwiderstand der Pipette. Der ideale Serienwiderstand der Patch-Pipette liegt zwischen einem und 1,5 Milliohm, wenn sie mit Pipettenlösung gefüllt und in Badlösung getaucht wird.

Schieben Sie nun die Pipette langsam gegen die Eizelle, bis sich ihr Widerstand ungefähr verdoppelt. Erhalten Sie eine Giga-Ohm-Dichtung, indem Sie durch ein Saugrohr, das mit dem Pipettenhalter verbunden ist, sanft mit dem Mund ansaugen. Nachdem Sie bestätigt haben, dass sich eine Giga-Dichtung gebildet hat, stabilisieren Sie das Pflaster, indem Sie es einige Minuten lang bei minus 30 Millivolt halten.

Um ein Inside-Out-Pflaster zu erhalten, entfernen Sie das Pflaster, indem Sie die Pipette schnell weiter in die OO-Stelle schieben und dann vorsichtig herausziehen. Das Inside-Out-Patch ist nun bereit für die Patch-Klemmung. Bewegen Sie die Pipette mit dem Pflaster auf der Innenseite etwa 100 Mikrometer von der Öffnung der Perfusionsspitze entfernt.

Schließen Sie das elektronische Ventil für die Abfallsammlung und öffnen Sie das Auffangventil für die gewünschte Profusionslösung. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Ströme im gesamten Patch. Ändern Sie die Spannungs- und Profusionslösungen nach Belieben.

Wenn Sie mit der Aufnahme fertig sind, reinigen Sie den Bleistift und die Spitze der Profusion-Schläuche, indem Sie durch entionisiertes Wasser drücken, um Verstopfungen zu vermeiden. Die hier gewonnenen Patch-Clamp-Aufzeichnungen zeigen, dass die Wildtyp-BK-Kanäle auf einem Eizellmembranpflaster sowohl auf Spannung als auch auf Kalzium reagieren. Diese Abbildung zeigt eine Patch-Aufzeichnung mit nominal null Calcium in der Perfusionslösung.

Die Rechteckwellen über den Stromkurven zeigen die Spannung an, die an das Feld angelegt wird. Es wurden vier Spannungen von 50 Millivolt bis 200 Millivolt in Schritten von 50 Millivolt angelegt. Der maximale Strom, etwa zwei Nanoampere, wurde bei einer maximalen Spannung von 200 Millivolt erreicht.

Diese Zunahme der Stromamplitude mit zunehmender Spannung deutet darauf hin, dass die Offenwahrscheinlichkeit von BK-Kanälen mit der Spannung zunimmt. Diese Abbildung zeigt das Verhalten des Inside-Out-Patches auf unterschiedliche Spannungen. Wenn sich ein mikromolares Kalzium in der Perfusionslösung befand, wurden Spannungsstufen angelegt.

Wie in der vorangegangenen Abbildung stieg das Ansprechverhalten auf den Spannungsschritt von 200 Millivolt auf etwa drei Nanoampere an, wenn das Perfu-Acht Kalzium enthielt, verglichen mit zwei Nanoampere ohne Kalzium. Dies deutet darauf hin, dass die Öffnungswahrscheinlichkeit der BK-Kanäle in Gegenwart von Kalzium zunahm. Zusammenfassend zeigte dieses Patch-Clamp-Verfahren, dass die BK-Kanäle spannungs- und kalziumabhängig sind.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Aktivierung des Eisenkanals mithilfe der Patch-Clamp-Technik in Verbindung mit einem professionellen Betankungssystem aufzeichnen können. Jetzt. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.