Name: Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-10T18:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Lernen Sie Patch-Clamp-Techniken zur Aufzeichnung von BK-Kanalaktivierung in Xenopus-Oozyten mit Perfusionskontrolle. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen spannungs- und calciumabhängiger Ionenkanäle.

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Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health gewährt R01-HL70393 und R01-NS060706 zu JCJC unterstützt ist Professor für Biomedizinische Technik an der Spencer T. Olin Endowment.

1. Die Injektion von mRNA in Oozyten <ol><li> Inject von 0,05 bis 50 ng Boten-RNA, die in vitro in Xenopus laevis Oozyten (Stadium V-VI) mit Nanoject II Auto-Nanoliter Injector (Drummond Scientific Company, Modell 3-000-204) transkribiert wurde. Wiederholen Sie die Injektion auf ein Dutzend Eizellen für jede mRNA. </li><li> Spülen Sie den injizierten Oozyten zweimal mit ND-96-Lösung (96 mM Natriumchlorid (NaCl, Herr 58,44 g / mol), 2 mM Kaliumchlorid (KCl, Herr 74,56 g / mol), 1,8 mM Calciumchlorid (CaCl 2 • 2H 2 O Herr 147,02), 1 mM Magnesiumchlorid (MgCl 2 • 6H 2 O, Herr 203,31 g / mol), 5 mM 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic Säure (HEPES, Herr 238,31 g / mol), 2,5 mM Natriumpyruvat (Herr 110,04 g / mol) und 1x Penicillin-Streptomycin. pH 7,6), dann legen Sie sie in einer Kultur Platte und inkubieren bei 18 ° C für 2 + Tage. </li></ol> 2. Vorbereitung der Perfusion System <img src="/files/ftp_upload/2269/2269fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Illustration der Automatisierung ValveLink 16 Perfusion System. Die Perfusion System nutzt unter Druck Stickstoff zu Perfusionslösungen Push-out der Lösung Stauseen, durch die Infusionsschläuche, und die Durchblutung Bleistift und Trinkgeld. Der Durchfluss der einzelnen Streams von Perfusionslösung wird von einem Reservoir-Ventil und eine elektronische Ventil gesteuert. In diesem Protokoll ist eines der Reservoirs nicht unter Druck und fungiert als Abfallsammler sowie eine Druck-Auslösemechanismus. (Bild aus Hersteller-Website http://www.autom8.com angepasst) <ol><li> Verbinden Sie die Schläuche auf die Perfusion Bleistift. Schalten Sie das elektronische Ventilsteuerung und öffnen Sie die Elektronenröhren. </li><li> Um sicherzustellen, dass die Schläuche und die Durchblutung Bleistift frei von Verstopfung und Luftblasen sind, drücken Sie deionisiertem Wasser (DI) durch jeden Schlauch mit einer Spritze mit deionisiertem Wasser gefüllt. </li><li> Verbinden Sie die Schläuche auf die Lösung Stauseen und öffnen Sie das Ventil der Gasflasche unter Druck stehendem Stickstoff anzuwenden. </li><li> Öffnen Sie das Reservoir-Ventil, um den Schlauch mit Reservoir-Lösung füllen. Flick das Reservoir-Ventil, um Luftblasen in der Lösung zu entfernen, wenn nötig. Schließen Sie das Ventil nach der Schlauch mit der Lösung gefüllt ist. </li><li> Füllen Sie die Perfusion Spitze mit Wasser und schrauben Sie ihn auf die Perfusion Bleistift. Achten Sie darauf, keine Blasen-Falle beim Anschließen der Spitze. </li><li> Fix die Perfusion mit Bleistift auf das Bad Stufe mit Knetmasse. Vergewissern Sie sich, die Durchblutung Spitze ist in der Badewanne Platz. Die Perfusion ist jetzt eingerichtet. </li><li> Add DI-Wasser in der Badewanne. Vergewissern Sie sich, die Durchblutung Spitze in das Wasser eingetaucht ist. </li><li> Testen Sie, dass jeder Perfusionslösung kommt aus dem Perfusion Tipp richtig. Schließen Sie das elektronische Ventil verbunden, um den Schlauch der Abfallsammler und öffnen das Ventil für eine Perfusionslösung zu einer Zeit (140 mM Kaliumhydroxid (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mM 4 - (2-hydroxyethyl) -1 - piperazineethanesulfonic Säure (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM Kaliumchlorid (KCl, M r 74,56 g / mol), 1 mM Ethylenglycol-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'- tetraessigsäure (EGTA, M r 380,35 g / mol), ist pH-Wert auf 7,1-7,2 durch Methansulfonsäure (MeSO 3, M r 96,1 g / mol), Ca 2 eingestellt + oder Mg2 + ist es, gewünschten Konzentration zugegeben, wenn nötig). Unter dem Mikroskop beobachten, der Strahl der Perfusion Flüssigkeit aus der Perfusion Spitze. Schließen Sie das Ventil für die Perfusionslösung und öffnen das Ventil für die Abfallsammler. Die Perfusion Jet sollte fast verschwinden. Wiederholen Sie den gleichen Test für alle Perfusionslösungen. </li><li> Wenn Sie, dass alle Perfusionslösungen flow korrekt überprüft, ersetzen DI-Wasser in der Wanne mit Bad-Lösung (140 mM Kaliumhydroxid (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mM 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic Säure (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM Kaliumchlorid (KCl, M r 74,56 g / mol), ist pH-Wert auf 7,1-7,2 durch Methansulfonsäure (MeSO 3, M r 96,1 g / mol)) eingestellt. </li></ol> 3. Patch-Clamp- <ol><li> Recoat der Ag Aufnahme-Elektrode mit AgCl vor jedem Patch-Clamp-Sitzung. Entfernen Sie zunächst die Drahtelektrode aus dem Pipettenhalter und tauchen die Spitze der Hälfte der Drahtelektrode in einem Fläschchen mit frischem Bleichmittel für mindestens 15 Minuten. Diese Ablagerungen einer Schicht von AgCl auf den Draht. </li><li> Spülen Sie die Elektrode Draht mit deionisiertem Wasser und trocken tupfen. Installieren Sie dann die Ag / AgCl-Elektrode wieder in den Pipettenhalter. </li><li> Schließen Sie das Bad (Bezugs-) Elektrode zur headstage und legen Sie sie in das Bad. Dieser bereitet die Elektroden für die Aufzeichnung. </li><li> Jetzt für die Datenerfassung vorzubereiten. Schalten Sie den Computer und stecken Sie den Dongle in den Drucker-Port Ihres Computers. Die Hardware-Schlüssel muss gesteckt werden, damit Sie die Software zur Datenerfassung, die HEKA Impuls zu nutzen. </li><li> Schalten Sie den Verstärker (Axon Instruments, AXOPATCH 200B) und starten HEKA Pulse. Laden Sie die Protokoll-Datei und stellen Sie die Konfigurationseinstellungen, wie die Stimulus-Skala. Das Ziel für die Anpassung der Konfigurationseinstellungen ist, um sicherzustellen, dass der Test Potenzial genau gleich der Befehl Potenzial ist. Dies bereitet den Datenerfassungsgeräten. </li><li> Bereiten Eizellen. Tauchen Sie die Eizelle in Stripping-Lösung (200 mM N-Methyl-D-glucamin (NMG, M r 195,22 g / mol), 200 mM Aspartat (keine K +) (M r 133,1 g / mol), 2 mM Kaliumchlorid (KCl , M r 74,56 g / mol), 10 mM Ethylenglycol-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'-tetraessigsäure (EGTA, M r 380,35 g / mol), 1 mM Magnesiumchlorid (MgCl 2 • 6 H 2 O, M r 203,31 g / mol), 10 mM 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic Säure (HEPES, M r 238,31 g / mol), ist pH auf 7,4 mit Natriumhydroxid eingestellt (NaOH, M r 40,0 g / mol) für 5 - 10 min. Das Strippen Lösung löst die Dotterhaut von der Plasmamembran, die es ermöglicht, die Dotterhaut Streifen macht. </li><li> Gently Streifen die Dotterhaut von der Eizelle mit zwei Pinzetten. Ein devitellinized Eizelle ist äußerst fragil und sollte daher verschoben werden so wenig wie nötig. </li><li> Die Pflege zu verhindern, daß die devitellinized Eizelle in die Luft oder Blasen, verwenden Sie eine Glaspipette mit genügend Lösung der Eizelle in das Bad übertragen gefüllt. Dieser bereitet die Eizelle für die Aufnahme. </li><li> Bereiten Sie Patch-Pipetten. Ziehen Sie die Glaspipetten nach dem Einlegen einer Glaskapillare (VWR International, Cat # 53432-921) in eine Sutter P-97 Flaming / Brown Micropipette Puller. Beachten Sie die Pipetten unter dem Mikroskop an der Spitze Form und Öffnung Durchmesser zu bestimmen. Der Öffnungsdurchmesser sollte 2-4 Mikrometer betragen. </li><li> Um kapazitive Strom während der Aufnahme zu reduzieren und eine glatte Spitze, Fell der Spitze mit Wachs zu gewährleisten und dann Feuer-polieren. </li><li> Füllen Sie die Pipettenspitze, indem Sie die Spitze der Pipette in die Pipette Lösung (140 mM Kaliumhydroxid (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mM 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic Säure (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM Kaliumchlorid (KCl, M r 74,56 g / mol), 2 mM Magnesiumchlorid (MgCl 2 • 6H 2 O, M r 203,31 g / mol), ist pH-Wert auf 7,1-7,2 durch Methansulfonsäure eingestellt Säure (MeSO 3, M r 96,1 g / mol)) und Zeichnung der Kolben. Diese benetzt die Spitze. </li><li> Füllen Pipette 1 / 3 voll mit Pipette Lösung mit einer Spritze und setzen Sie die Pipette in den Pipettenhalter mit der Ag / AgCl-Elektrode im Inneren und Kontaktaufnahme mit der Pipette Lösung. Dies bereitet der Patch-Pipette. </li><li> Verbrauchsteuerpflichtige Inside-out-Patch von der Eizelle vorbereitet, finden die klare Kante Eizelle unter dem Mikroskop. Bewegen Sie den Patch-Pipette in der Nähe der Eizelle mit Manipulator. Notieren Sie die Seriennummer Widerstand der Pipette. Die ideale Serie Widerstand der Patch-Pipette wird zwischen 1-1,5 MOhm, wenn sie mit Pipette gefüllt und unter Wasser in Bad-Lösung. </li><li> Langsam schieben Sie die Pipette gegen die Eizelle, bis der Widerstand etwa verdoppelt. </li><li> Bewerben sanfte Saugwirkung auf die Membran durch den Mund durch ein Saugrohr, die den Pipettenhalter verbunden ist, bis ein Giga-Ohm-Siegel erhalten. Stabilisieren Sie den Patch, indem Sie am Spannung -30 mV für ein paar Minuten. </li><li> Um eine inside-out-Patch-, Verbrauchsteuer den Patch schnell drücken Sie die Pipette weiter in die Eizelle und dann vorsichtig herausziehen. </li><li> Die inside-out-Patch ist nun bereit zum Spannen. Bewegen Sie die Pipette hält die inside-out patch bis etwa 100 Mikrometer weg von der Öffnung der Perfusion Spitze. </li><li> Schließen Sie das elektronische Ventil für Abfälle sammeln und öffnen Sie das Reservoir-Ventil für die gewünschte Perfusionslösung </li><li> Starten Sie die Aufnahme Ströme über das Pflaster. Ändern Sie den Spannungs-und Perfusionslösungen wie gewünscht. </li><li> Wenn Sie die Aufnahme beendet ist, reinigen Sie die Infusionsschläuche, Bleistift und Spitze, indem Sie durch entionisiertes Wasser verstopft zu vermeiden. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Bei der Herstellung von Eizellen für die Patch-Clamp, würde die 5-10 min Behandlung von Abbeizlösung die Dotterhaut von der Plasmamembran, die es ermöglicht Abziehen der Dotterhaut zu lösen. Die ideale Serie Widerstand der Patch-Pipette wird zwischen 1-1,5 MOhm, wenn sie mit Pipette gefüllt und unter Wasser in Bad-Lösung. Nachfolgend finden Sie eine repräsentative Aufnahme von Wildtyp-BK-Kanäle auf eine Eizelle Membran-Patch. Auf der linken Seite oben, zeigen die quadratische Wellen der Spannung an den patch - der zweite Schritt mit steigender Spannung von 50 mV bis 200 mV mit Schrittweite von 50 mV. Nachfolgend finden Sie die entsprechenden aktuellen Spuren, wenn die Perfusionslösung nominal 0 Ca 2 + (frei [Ca 2 +] liegt bei etwa 0,5 nm). Die inAnstieg der Stromamplitude bedeutet, dass die offene Wahrscheinlichkeit BK-Kanäle mit steigender Spannung. Auf der rechten Seite ist der gleiche Patch mit 1,0 uM Ca 2 + perfundiert, wenn sie mit der gleichen Spannung Protokoll angewendet. Die Stromamplitude erhöht mehr unter der gleichen Spannung, was darauf hinweist, dass die offene Wahrscheinlichkeit, mit [Ca 2 +] erhöht. <img src="/files/ftp_upload/2269/2269fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2">

<ol><li>Methfessel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+measurements+on+Xenopus+laevis+oocytes%3A+currents+through+endogenous+channels+and+implanted+acetylcholine+receptor+and+sodium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch%22%5BJournal%5D)">Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels.</a> Pflügers Arch. 407, 577-588 (1986).</li>
<li>Toro, L., Wallner, M., Meera, P., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maxi-K+%28Ca%29%2C+Unique+Member+of+the+Voltage-Gated+K+Channel+Superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22News+Physiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Maxi-K (Ca), Unique Member of the Voltage-Gated K Channel Superfamily.</a> News Physiol. Sci. 13, 112-117 (1998).</li>
<li>Fettiplace, R., Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+hair+cell+tuning%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of hair cell tuning.</a> Annu. Rev. Physiol. 61, 809-834 (1999).</li>
<li>Du, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-sensitive+potassium+channelopathy+in+human+epilepsy+and+paroxysmal+movement+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Calcium-sensitive potassium channelopathy in human epilepsy and paroxysmal movement disorder.</a> Nat. Genet. 37, 733-738 (2005).</li>
<li>Ledoux, J., Werner, M. E., Brayden, J. E., Nelson, M. T., T, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-activated+potassium+channels+and+the+regulation+of+vascular+tone%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone.</a> Physiology (Bethesda). 21, 69-78 (2006).</li>
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<li>Magleby, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+mechanism+of+BK+%28Slo1%29+channels%3A+so+near%2C+yet+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gating mechanism of BK (Slo1) channels: so near, yet so far.</a> J. Gen. Physiol. 121, 81-96 (2003).</li>
<li>Latorre, R., Brauchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+conductance+Ca2%2B-activated+K%2B+%28BK%29+channel%3A+activation+by+Ca2%2B+and+voltage%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">Large conductance Ca2+-activated K+ (BK) channel: activation by Ca2+ and voltage.</a> Biol. Res. 39, 385-401 (2006).</li>
<li>Cox, D. H., Cui, J., Aldrich, R. W., W, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+gating+of+a+large+conductance+Ca-activated+K%2B+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Allosteric gating of a large conductance Ca-activated K+ channel.</a> J. Gen. Physiol. 110, 257-281 (1997).</li>
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<li>Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Slo1+BK+channels+by+Mg2%2B+coordinated+between+the+voltage+sensor+and+RCK1%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Activation of Slo1 BK channels by Mg2+ coordinated between the voltage sensor and RCK1.</a> 15, 1152-1159 (2008).</li>
<li>Lee, U. S., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%7Bbeta%7D+subunit-specific+modulations+of+BK+channel+function+by+a+mutation+associated+with+epilepsy+and+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">{beta} subunit-specific modulations of BK channel function by a mutation associated with epilepsy and dyskinesia.</a> J. Physiol. , 587-1481 (2009).</li>
</ol>

Die Eizelle Ausdruck System ist ideal für elektrophysiologische Charakterisierung von spannungsabhängigen Ionenkanälen aufgrund der relativ niedrigen Hintergrund der endogenen Kanäle. Darüber hinaus, da es sich um eine vorübergehende Expression System ist, bietet es eine effiziente Methode zur Durchführung Mutagenesestudie dieser Kanäle. Es ist jedoch zu beachten, dass die Eizelle Expressionssystem anders als in Säugerzellen ist, so kann es Unterschiede in post-translationale Modifikation und Verknüpfung mit verschieden...

<table><tbody><tr><td>Nanoject II Auto-Nanoliter-Injektor</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>P-97 Flaming/Brown-Mikropipettenzieher</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Perfusionsystem und elektronische Steuerung</td><td>AutoMate Scientific, Inc.</td><td>ValveLink 16</td><td>Innendurchmesser der Perfusionspitze: 100 Mikrometer</td></tr><tr><td>Invertiertes Mikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>Glaspipetten</td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown-Mikropipettenzieher</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Verstärker</td><td>Axon Instruments</td><td>AXOPATCH 200B</td><td></td></tr><tr><td>Computer-Schnittstelle</td><td>INSTRUTECH Corporation</td><td>ITC-18</td><td></td></tr><tr><td>Headstage</td><td>Axon Instruments</td><td>CV 203BU</td><td></td></tr></tbody></table>

patch-clamp-und perfusion techniken zur untersuchung von ionenkanälen ausgedrückt in xenopus oozyten

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Das Protokoll hier vorgestellten soll die Aktivierung der großen Leitfähigkeit, Spannungs-und Ca 2 +-aktivierten K + (BK) Kanäle zu studieren. Das Protokoll kann auch verwendet werden, um die Struktur-Funktions-Beziehung für andere Ionenkanäle und Neurotransmitter-Rezeptoren-1-Studie sein. BK-Kanäle sind weit verbreitet in verschiedenen Geweben exprimiert und haben in vielen physiologischen Funktionen, einschließlich der Regulierung der Kontraktion der glatten Muskulatur, Frequenzabstimmung von inneren Haarzellen und Regulierung der Freisetzung von Neurotransmittern 2-6 in Verbindung gebracht. BK-Kanäle werden durch Membran-Depolarisation und durch intrazelluläre Ca 2 + und Mg 2 + 6-9 aktiviert. Daher ist das Protokoll, mit dem sowohl die Membran-Spannung und die intrazelluläre Lösung zu kontrollieren. In diesem Protokoll wird Boten-RNA von BK-Kanälen in Xenopus laevis Oozyten (Stadium V-VI) von 2-5 Tagen Inkubation bei 18 ° C 10-13 gefolgt injiziert. Membrane Patches, die einzelne oder mehrere BK-Kanäle enthalten, werden mit der inside-out-Konfiguration mit Patch-Clamp-Techniken 10-13 herausgeschnitten. Die intrazellulären Seite der Patch mit der gewünschten Lösungen während der Aufnahme, so dass die Kanal-Aktivierung unter verschiedenen Bedingungen untersucht werden kann perfundiert. Zusammenfassend ist die mRNA von BK-Kanälen in Xenopus laevis Oozyten injiziert, um Kanal-Proteine ​​an der Eizelle Membran auszudrücken; Patch-Clamp-Techniken werden benutzt, um Ströme durch die Kanäle unter kontrollierten Spannung und intrazelluläre Lösungen aufnehmen.

Ionenstrom von BK-Kanälen aufgezeichnet wird mit Patch-Clamp-Techniken. BK-Kanäle sind in Ausdruck<em&gt; Xenopus Oozyten</em&gt; Durch die Injektion von Boten-RNA. Die intrazelluläre Lösung während Patch Clamp Messungen wird durch eine Perfusion System gesteuert.

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

Das hier vorgestellte Protokoll ist darauf ausgelegt, die Aktivierung der spannungs- und Ca2+-aktivierten K+-Kanäle mit großer Leitfähigkeit (BK-Kanäle) zu untersuchen. Das Protokoll kann ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Aktivierung von BK-Kanälen unter kontrollierter Spannung zu messen, während gleichzeitig die intrazelluläre Lösung gesteuert wird. Dies wird erreicht, indem BK-Kanäle zunächst durch Injektion von BK-Kanal-mRNA in Xenopus-Zellen exprimiert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht in der Vorbereitung des Perfusionsystems.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, eine Giga-Dichtung zwischen der Oozytenmembran und der Patch-Pipette zu bilden. Der letzte Schritt des Verfahrens ist das Auslösen des Membranflecks. Letztendlich zeigen Ergebnisse, die mit der Patch-Clamp-Technologie in Kombination mit einem Perfusionsystem erzielt wurden, dass BK-Kanäle durch Änderungen der Spannung und der Kalziumkonzentration aktiviert werden.Hallo, ich bin Jin Cho Young aus dem Labor von Dr. Jamie Zu an der Washington University. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, darunter auch Fragen zum molekularen Mechanismus der Ionenkanalaktivierung. Beginnen wir also.Der erste Schritt des Verfahrens beginnt einige Tage vor der Patch-Clamp-Messung und verwendet BK-Kanal-mRNA, die

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Forschung

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Biologie

Dies ist als eine Einführung in die Klemme Aufnahme von Xenopus laevis Oozyten Patch soll. Es deckt Dotterhaut Entfernung, Bildung einer Gigaohm Dichtung (Gigaseal) und die optionale Konvertierung der Patch auf die outside-out-Topologie.

Patch Clamp Recording von Ionenkanälen in Xenopus Oozyten exprimiert

Wir werden zeigen, wie man die Wirkung einer einzelnen Punktmutation auf die Funktion eines Ionenkanals zu studieren.

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

Optimierte Transfektion Strategie für Expression und elektrophysiologische Ableitung von rekombinantem Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T-Zellen

Wir beschreiben eine Methode zur Quantifizierung der Aktivität von K+-gegentransportierenden P-Typ-ATPasen durch heterologe Expression der Enzyme in Xenopus-Eizellen und Messung der Rb+- oder Li+-Aufnahme in einzelne Zellen mittels Atomabsorptionsspektrophotometrie. Die Methode ist eine empfindliche und sichere Alternative zu Radioisotopenflussexperimenten, die komplexe kinetische Studien ermöglicht.

Mess-Cation Transport von Na, K-und H, K-ATPase in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oozyten mittels Atomabsorptionsspektrometrie: Eine Alternative zu Radioisotopen Assays

Um häufigsten verwendeten Methoden, um zu studieren TRPV4 ergänzen, werden zwei Methoden beschrieben: Seine Mechanosensitivität kann durch Ca 2 +-Aequorin Luminometrie in transgenen Hefe auf hypo-osmotischen Herausforderung untersucht werden. Es kann auch in TRPV4-RNA untersucht werden injizierten Xenopus Oocyten durch Ganzzell-Zweielektroden-Spannungsklemmen-oder Patch-Clamp in Ein-Zelle oder entfernten Modus.

Hefe und luminometrischer Xenopus Eizelle Elektrophysiologische Untersuchungen des Molecular Mechanosensitivität von TRPV4

Die aufgeschnittenen Vaseline Lücke Ansatz werden geringe Geräuschaufnahmen von ionischen und Anschnittströme von spannungsabhängigen Ionenkanälen in Xenopus-Oozyten mit hoher Auflösung von schnellen Kanal Kinetik ausgedrückt zu erhalten. Mit geringen Modifikationen können Spannungsklemm Fluorometrie an den aufgeschnittenen Oozyte Protokoll gekoppelt werden.

Die<em&gt; Xenopus</em&gt; Eizelle Cut-open Vaseline Gap Voltage-Clamp-Technik Mit Fluorometrie

Beschrieben wird hier ein Verfahren zur Erlangung weite Strecken der aktuellen Aufnahme von einem Ionenkanal mit der Cell-Attached-Patch-Clamp-Technik. Diese Methode erlaubt die Beobachtung in Echtzeit, das Muster der Öffnungs-Schließ-Kanal-Konformationen, die die biologische Signal zugrunde liegen. Diese Daten informieren über Kanaleigenschaften in ungestörten biologischen Membranen.

Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

Optimierte Verfahren für die Isolierung einzelner Follikel, zytoplasmatische RNA-Mikroinjektionen, die Entfernung umgebender Zellschichten und die Proteinexpression in Xenopus-Eizellen werden beschrieben. Darüber hinaus wird eine einfache Methode für schnelle Lösungsänderungen in elektrophysiologischen Experimenten mit ligandengesteuerten Ionenkanälen vorgestellt.

Xenopus Oozyten: Optimierte Methoden für die Mikroinjektion, Entfernen von Follicular Zellschichten und schnelle Lösung Änderungen in elektrophysiologischen Experimenten

Dieser Artikel beschreibt eine Verbesserung der konventionellen Voltage-Clamp Fluorometry (VCF), bei der fluoreszierende unnatürliche Aminosäuren (fUAA) anstelle von Maleinimidfarbstoffen verwendet werden, um strukturelle Umlagerungen in Ionenkanälen zu untersuchen. Das Verfahren umfasst Xenopus- Oozyten-DNA-Injektion, RNA / fUAA-Coinjektion und gleichzeitige Strom- und Fluoreszenzmessungen.

Spannklemme Fluorometrie in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oozyten mit fluoreszierenden unnatürlichen Aminosäuren

Dies ist eine Anleitung zum Ändern der Form von Glas-Mikropipetten. Insbesondere durch Anwendung von Wärme und Luftdruck der Verjüngung ist ohne Erhöhung des Bahnöffnung verbreitert, was zu niedrigeren Pipette Widerstand. Dies ist entscheidend für rauscharme Aufnahmen von kleinen Zellen zu erhalten, sondern ist in vielen Anwendungen.

Pressure-Polieren Pipetten für verbesserte Patch-Clamp Recording

Lernen Sie Patch-Clamp-Techniken zur Aufzeichnung von BK-Kanalaktivierung in Xenopus-Oozyten mit Perfusionskontrolle. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen spannungs- und calciumabhängiger Ionenkanäle.

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