Die Quantifizierung der Synapsen: eine Immunzytochemie-basierten Assay zur Synapse Anzahl Quantify

Eines der wichtigsten Ziele der Neurowissenschaften ist es, die molekularen Signale zu verstehen, die die frühen Stadien der Synapsenbildung steuern. Daher ist es unerlässlich geworden, objektive Ansätze zu entwickeln, um Veränderungen in der synaptischen Konnektivität zu quantifizieren. Um die Synapsenzahl in einer Vielzahl von experimentellen Präparaten zu quantifizieren, werden kultivierte Neuronen oder Kryoschnitt-Hirngewebepräparate mit selektiven prä- und postsynaptischen Markern gefärbt, um synaptische Kontaktpunkte zwischen Neuronen zu markieren.

Die Zellen oder das Gewebe werden dann auf einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet und es werden acht Bit-Bilder für jeden der Kanäle benötigt, die den beiden immunhistochemischen Markern entsprechen. Die Analyse der Bilder erfolgt mittels Bild J 1.29 mit puncta analyzer. Um das Ausmaß der Kolokalisation zwischen prä- und postsynaptischen Markern zu bestimmen, können dann Kolokalisationspunkte verwendet werden, um die Anzahl der in der Präparation vorhandenen Synapsen zu bestimmen.

Der Hauptvorteil der hier beschriebenen Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Elektronenmikroskopie besteht darin, dass der Synapsenassay eine wesentlich höhere Durchsatzanalyse und Quantifizierung der Synapsenzahl ermöglicht. Die Hauptimplikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose und Therapie klinischer Erkrankungen wie Alzheimer, Epilepsie oder Autismus, bei denen Anomalien und synaptische Konnektivität als Grundlage für die zugrunde liegende Pathologie in Betracht gezogen werden. Diese Technik kann verwendet werden, um Formen der Intervention zu identifizieren, die die Defizite reduzieren oder lindern können, die wir in der Fähigkeit der betroffenen Neuronen sehen, Synapsen miteinander zu bilden.

Obwohl diese Methode nützlich ist, um die Entwicklung des Gehirns zu untersuchen, kann sie auch auf andere Modellorganismen oder Organsysteme angewendet werden, in denen Sie daran interessiert sind, die Anzahl der Zell-zu-Zell-Kontakte zu untersuchen oder zu quantifizieren, für die Sie die Möglichkeit haben, jedes gegenüberliegende Gesicht jeder Kontaktstelle selektiv zu markieren. Präparation neuronaler Kulturen durch Plattieren von retinalen Ganglienzellen von Ratten, die von der Netzhaut von Ratten gereinigt und von P fünf bis sieben Tieren geerntet wurden, auf mit Poly de Lycin beschichteten Glasdeckgläsern. In einer 24-Well-Platte werden die Zellen vor der Transfektion drei bis fünf Tage lang bei 37 Grad Celsius wachsen gelassen.

Nach der Transfektion inkubieren Sie die Zellen für weitere sieben bis acht Tage, damit sich Synapsen entwickeln können, wenn die plattierten Zellen ausreichend gereift sind. Nehmen Sie das Nährmedium aus den Vertiefungen und geben Sie 500 Mikroliter vorwärmtes Formaldehyd mit 4 % para in jede Vertiefung, die sieben Minuten lang fixiert ist. Spülen Sie die Zellen nach der Fixierung bei Raumtemperatur dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung.

Es ist darauf zu achten, dass die Zellen in den Vertiefungen niemals austrocknen dürfen. Sobald ein Puffer aus einem Bohrloch entfernt wird, sollte er sofort durch den nächsten Puffer ersetzt werden. Bereiten Sie einen Blockierungspuffer vor, der 50 % normales Ziegenserum und 0,2 % Triton X 100 enthält.

Nachdem Sie PBS aus jeder Vertiefung entfernt haben, geben Sie 200 Mikroliter des Blockierungspuffers in jede Vertiefung und blockieren Sie sie 30 Minuten lang. Bei Raumtemperatur den Blockierungspuffer entfernen und dreimal spülen. Bereiten Sie mit PBS eine primäre Antikörperverdünnung in 90 % Antikörperpuffer und 10 % NGS-Lösung vor, die das prä- und postsynaptische Antikörperpaar Ihrer Wahl enthält.

Hier ein Kaninchen Antis Synapsin, ein präsynaptischer Marker und eine Maus Anti Homer. Ein postsynaptischer Marker wird verwendet: Zentrifuge, der Primärantikörper wird fünf Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit in einer Tischzentrifuge verdünnt, um alle gefällten Antikörper zu entfernen, und dann jeweils 200 Mikroliter Primärantikörperlösung hinzuzufügen. Legen Sie die Platte gut in einen befeuchteten Behälter, um ein Austrocknen der Primärlösung zu verhindern.

Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius im Anschluss an die Inkubation mit dem Primärantikörper. Spülen Sie jedes Mal gut aus. Mit PBS fügen Sie 200 Mikroliter der entsprechenden Sekundärantikörper hinzu, verdünnt auf 1000 in einem Antikörperpuffer, der 10 % NGS enthält.

Stellen Sie die Schale wie zuvor in die befeuchtete Kammer und inkubieren Sie sie nach der Inkubation mit Sekundärwaffen zwei Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Spülen Sie jedes Mal drei- bis viermal gut mit PBS aus. Geben Sie einen Tropfen Vector Shield Mount Medium mit DPI auf einen Objektträger.

Drehen Sie dann das Deckglas mit den Zellen auf den zu montierenden Tropfen. Zum Schluss tragen Sie Klarlack um die Ränder des Deckglases auf. Achten Sie darauf, dass die Deckgläser während der Anwendung nicht angestoßen oder verschoben werden.

Da sich dadurch die Zellen teilen, lassen Sie die Objektträger mindestens 30 Minuten an einem trockenen, dunklen Ort trocknen. Hier erfolgt die Bildgebung mit einem Fluoreszenzmikroskop zes axio imager, das mit entsprechenden Filtersets und einem 63-fachen Ölimmersionsobjektiv ausgestattet ist. Legen Sie einen Objektträger mit nicht transfizierten Zellen auf den Mikroskoptisch.

Wählen Sie mithilfe des DPI-Filtersatzes zur Visualisierung von Zellkernen Zellen aus, die mindestens zwei Zelldurchmesser von ihren nächsten Nachbarn entfernt sind. Die Verwendung von DPI für diesen Schritt hilft dabei, Verzerrungen zu vermeiden und die Zufälligkeit der Zellauswahl sicherzustellen. Rufen Sie für jede ausgewählte Zelle Acht-Bit-Bilder mit den entsprechenden Filtersätzen ab, in diesem Fall GFP und Texas Red.

Das überlagerte pseudofarbige Bild sollte prä- und postsynaptische Marker in Rot bzw. Grün zeigen. Legen Sie dann einen Objektträger mit transfizierten Zellen auf den Mikroskoptisch. Hier wurden die Zellen mit einem TD-Tomatenexpressionsvektor transfiziert.

Verwenden Sie diese Markierung, um Zellen wie zuvor auszuwählen. Für jede ausgewählte Zelle erhalten Sie acht Grubenbilder mit den entsprechenden Filtersätzen, in diesem Fall GFP, Texas Red und Sci fünf. Das überlagerte pseudofarbige Bild sollte die postsynaptischen Marker in Rot, Grün und Blau aufweisen.

Hier wird das Puncture Analyzer Program zur Quantifizierung der co-lokalisierten synaptischen Punktion eingesetzt. Das Puncta Analyzer Plugin wurde von Barry Walk geschrieben und ist auf Anfrage in Bild J 1.26 verfügbar. Öffnen Sie eines der gesammelten Bilder.

Verwenden Sie das kreisförmige Auswahlwerkzeug, um einen Bereich auszuwählen, der etwa einen Zellendurchmesser radial um den gewünschten SOR hat. Wenn der gewünschte Bereich ausgewählt ist, gehen Sie zum Plugins-Menü und wählen Sie Punktionsanalysator im Fenster mit den Analyseoptionen, das angezeigt wird: Roter Kanal Grüner Kanal auswählen. Die erste Datei subtrahiert den Hintergrund und legt die Ergebnisdatei fest.

Klicken Sie auf OK. Definieren Sie dann einen Speicherort, an dem die Ergebnisse gespeichert werden sollen. Diese Ergebnisse können zur weiteren Analyse in dem angezeigten Fenster nach Excel exportiert werden.

Stellen Sie als Nächstes sicher, dass ein rollender Kugelradius von 50 ausgewählt ist, und deaktivieren Sie die Option für den weißen Hintergrund. Diese Änderung ist nicht erforderlich, wird aber häufig von Benutzern der Anwendung bevorzugt. Um die Visualisierung zu vereinfachen, klicken Sie auf OK.

Es erscheint ein neues Fenster neben einer Maske, die dem Bild des roten Kanals entspricht. Stellen Sie die Schwelle so lange ein, bis die rote Maske so gut wie möglich mit möglichst vielen diskreten Einzelpunktionen korrespondiert. Ohne zu viel Lärm einzubringen, klicken Sie auf Fertig.

Legen Sie die minimale Interpunktgröße auf vier Pixel fest. Ändern Sie nichts anderes. Klicken Sie auf OK.

Wiederholen Sie den vorherigen Schritt, diesmal für den grünen Kanal. Nachdem Sie dies mit dem grünen Kanal wiederholt haben, liefert das Plugin eine Quantifizierung, die den Puncta in jedem Kanal separat und einer co-lokalisierten Puncta zwischen den beiden Kanälen entspricht. Der hier gezeigte Synapsen-Assay kann auf Kryoschnitte aus dem Gehirn und auf jedes andere Gewebe des Nervensystems wie Rückenmark oder Netzhaut angewendet werden.

Vorausgesetzt, es gibt ein geeignetes prä- und postsynaptisches Markerpaar. Beginnen Sie mit der Entnahme von Hirngewebe von einer Maus, die durch Ausblutung und Überfluss mit PBS eingeschläfert wurde. Legen Sie das gesamte Gehirn über Nacht über Nacht in 4% Paraldehyd in PBS bei vier Grad Celsius.

Spülen Sie das Gehirn dreimal mit PBS aus. Kryo schützt das Gehirn, indem es in 30%ige Saccharose gegeben wird. In PBS.

Das Gewebe schwimmt zunächst bei vier Grad Celsius, bis das Gewebe zu Boden sinkt. In diesem Stadium ist der Kryoschutz abgeschlossen. Als nächstes betten Sie in einer Zwei-zu-Eins-Lösung von 20%iger Saccharose in OCT und PBS das Brainin in die gewünschte Orientierung für die Sektion ein.

Zum Beispiel sagittal oder koronal. Legen Sie dann eine flache Metallfläche auf einen Eimer mit Trockeneis. Legen Sie das eingebettete Gehirn darauf, um es einzufrieren, sobald es eingefroren ist, geben Sie das Gehirn in einen Gefrierbeutel und legen Sie es bis zu einem Jahr lang bei minus 80 Grad Celsius, bevor Sie es schneiden.

Mit einem Kryostaten wird das Gewebe in 12 bis 16 Mikrometer große Schnitte geschnitten und auf Objektträger montiert. Trocknen Sie anschließend die Objektträger, indem Sie sie in einen 37 Grad Celsius heißen Ofen legen. Spülen Sie sie dann dreimal mit PBS aus, um OCT-Reste zu entfernen.

Ein Paraffinstift wird verwendet, um eine hydrophobe Barriere um den Objektträger zu schaffen, und dem Objektträger wird ein Blockierungspuffer zugesetzt, der durch den Paraffinrand verhindert, dass er vom Objektträger abfließt. Legen Sie die Objektträger eine Stunde lang bei Raumtemperatur in 20% normales Ziegenserum in PBS, um den nächsten Platz zu blockieren. Die Abschnitte in Primärantikörpern wurden in PBS mit 0,3 % Triton und 10 % normalem Ziegenserum verdünnt.

Hier wird Kaninchen antit, PSD 95 zur Markierung glutamaterger, postsynaptischer Kompartimente und Meerschweinchen anti v glu zwei zur Markierung glutamaterger präsynaptischer Endungen verwendet. Legen Sie die Objektträger bei vier Grad Celsius und inkubieren Sie sie nach der Inkubation 36 bis 60 Stunden lang. Waschen Sie den primären Antikörper ab, indem Sie die Objektträger dreimal für jeweils 15 Minuten in PBS tauchen.

Achten Sie nach diesem Schritt darauf, die Objektträger vor direktem Licht zu schützen. Tragen Sie Sekundärantikörper auf, verdünnt von eins bis 200 in PBS mit 0,3 % Triton und 10 % normalem Ziegenserum. Hier, Ziege Anti-Meerschweinchen.

Alexa 4 8 8 und Ziege Anti Kaninchen. Zum Einsatz kommen Alexa 5, 9, 4. Zwei Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.

Waschen Sie die Objektträger, indem Sie sie viermal für jeweils 15 Minuten in PBS tauchen, um sie zu montieren. Geben Sie kleine Tropfen des Vektorschild-Montagemediums mit Dappy hinzu und decken Sie die Dias mit Deckgläsern ab. Tragen Sie Nagellack auf, um Bewegungen der Deckgläser zu hemmen.

Die Bildgebung des Gewebeschnitts sollte unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops mit geeigneten Lasern unter Verwendung eines 63-fachen Ölimmersionsobjektivs für jedes Schnittbild durchgeführt werden, serielle optische Schnitte in Abständen von 0,33 Mikrometern über eine Gesamttiefe von fünf Mikrometern für insgesamt 15 optische Schnitte. Von jedem Tier müssen mindestens drei Schnitte aufgenommen werden, und es müssen mindestens drei Tiere aus einer bestimmten Versuchsbedingung eingeschlossen werden. Generieren Sie Projektionen mit maximaler Intensität aus Gruppen von drei aufeinanderfolgenden Schnitten, was fünf Projektionen mit einer Tiefe von jeweils einem Mikrometer ergibt.

Diese werden mit Bild J quantifiziert, wie für RG Cs mit modifiziertem ROI beschrieben, um die Anzahl der Synapsen zu bestimmen, die in Abwesenheit von Astrozyten gebildet werden. Die Immunchemie wurde an dissoziiertem rgc durchgeführt, das mit basalen Wachstumsmedien behandelt wurde, wobei wie erwartet Antikörper gegen Fagott (rot und Homer) (grün) verwendet wurden. Es werden nur sehr wenige Punkte der synaptischen Kolokalisation beobachtet, um die Wirkung von Astrozyten-sezernierten Molekülen auf die Anzahl der in vitro gebildeten Synapsen zu bestimmen. Dissoziierte RG Cs wurden alle drei Tage für insgesamt 12 Tage nach der Färbung mit Maus-Astrozyten-konditionierten Medien behandelt.

In diesem Neuron waren zahlreiche Synapsen zu erkennen, die aber bald rot dargestellt sind. Homer ist in grün dissoziierten RDCs dargestellt, die mit zytoplasmatischen Lee-exprimierten TD-Tomaten transfiziert wurden, die nur mit basalem Wachstum behandelt wurden. Mittlere Synapsen sind nicht zu sehen.

Die TD-Tomate ist in Blau und die Synapse in Rot zu sehen. Es ist nur ein sehr geringes Signal für den postsynaptischen Marker Homer zu sehen, der in Grün dargestellt ist. Wenn dieselben Zellen chronisch mit Ratten-Astrozyten-konditioniertem Medium behandelt werden, sind viele Synapsen zu sehen.

TD Tomate ist hier in blau, Synapsin in rot und Homer in grün. Es wird ein gereinigtes RGC gezeigt, das mit Astrozytenkonditioniertem Medium behandelt und für Präsynapse in roten und postsynaptischen homergrünen Markerschwellenmasken gefärbt wurde, die mit Hilfe eines Punktionsanalysators erzeugt wurden, entsprechen den beiden vorhandenen Kanälen. Bei der Identifizierung von Punkten der Kolokalisierung gibt der Puncta-Analysator eine grafische Darstellung dieser Punkte aus.

Der Puncta-Analysator liefert eine numerische Ausgabe, die die Anzahl der diskreten Puncta angibt, die in beiden Kanälen und für Kolokalisationspunkte identifiziert wurden. Die Daten, die durch die Analyse dieses Neurons gewonnen wurden, veranschaulichen die Fähigkeit von Astrozyten-sezernierten Molekülen, die Bildung von Synapsen zu fördern, die hier als Synapsen-Assay gezeigt werden, in dem die Kolokalisation der prä- und postsynaptischen immunhistochemischen Markierung quantifiziert wurde, um die Potenzierung der Astrozyten-induzierten Synapsenbildung durch Überexpression des neuronalen Rezeptors für das wichtige Astrozyten-sezernierte synap-Genmolekül Thrombo Spon zu demonstrieren. In dieser Abbildung ist die durchschnittliche Anzahl von Synapsen pro Neuron dargestellt, die chronisch mit basalen Wachstumsmedien, GM, oder mit Astrozytenkonditionierten Medien behandelt wurden.

A-C-M-A-C-M fördert die Synapsenbildung in retinalen Ganglienzellen stärker als bei der Expression des Thrombo-Spon-Rezeptors im Vergleich zu Zellen bei der Expression eines leeren Vektors. Um die synaptische Dichte im Colliculus superior der Maus zu quantifizieren, wurden prä- und postsynaptische Kompartimente separat mit kompartimentspezifischen immunhistochemischen Markern markiert. Wie hier gezeigt, gab es einen Anstieg der Synapsenzahl vom siebten postnatalen Tag bis P 14.

Dies verdeutlicht die Zunahme der Synapsenzahl im Ulus superior über dieses Entwicklungszeitfenster. Sobald dieses Protokoll gemeistert ist, kann es in etwa zwei Tagen für dissoziierte neuronale Kulturen und in etwa fünf Tagen für Gehirnschnitte nach der Entnahme aus dem Tier nach diesem Verfahren abgeschlossen werden. Andere Methoden wie Elektrophysiologie und Elektronenmikroskopie werden verwendet, um zu überprüfen, ob die Änderungen der Synapsenzahl Veränderungen sowohl in funktionellen Synapsen als auch in ultrastrukturell normalen Synapsen widerspiegeln.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Immunhistochemie auf Ihre experimentelle Vorbereitung anwenden können, um die Synapsenzahl zu quantifizieren. Dieses Protokoll beschreibt, wie kompartimentspezifische Antikörper verwendet werden, um prä- und postsynaptische Kompartimente selektiv zu markieren. In diesem Zusammenhang definieren wir Synapsen als Kolokalisationspunkte zwischen den Signalen, die von jedem dieser Marker erhalten werden.