Name: Die Quantifizierung der Synapsen: eine Immunzytochemie-basierten Assay zur Synapse Anzahl Quantify (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-16T17:30:00.000+00:00
Duration: 18 min 11 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Synapsen in neuronalen Kulturen und Hirnschnitten mittels Immunzytochemie quantifizieren. Diese Methode nutzt prä- und postsynaptische Marker zur Kolokalisationsanalyse.

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Puncta Analyzer Plug-in für Bild J von Barry Wark (aktuelle Adresse: Physion Consulting) geschrieben wurde im Labor von Ben A. Barres (Stanford University). Finanzierung; <ul><li> Alfred P. Sloan Foundation </li><li> Die Esther A. und Joseph Klingenstein Fund, Inc. </li><li> Broad Biomedical Research Foundation </li><li> Heilung für Huntington-Krankheit Initiative </li></ul>

<ol><li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological%2C+morphological%2C+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1, 791-803 (1988).</li>
<li>Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+signaling+interactions+that+promote+the+survival+and+growth+of+developing+retinal+ganglion+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture.</a> Neuron. 15, 805-819 (1995).</li>
<li>Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gabapentin+receptor+alpha2delta-1+is+a+neuronal+thrombospondin+receptor+responsible+for+excitatory+CNS+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gabapentin receptor alpha2delta-1 is a neuronal thrombospondin receptor responsible for excitatory CNS synaptogenesis.</a> Cell. 139, 380-392 (2009).</li>
<li>Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+efficacy+enhanced+by+glial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro.</a> Science. 277, 1684-1687 Forthcoming.</li>
<li>Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+synapse+number+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of synapse number by glia.</a> Science. 291, 657-661 (2001).</li>
<li>Christopherson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondins+are+astrocyte-secreted+proteins+that+promote+CNS+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis.</a> Cell. 120, 421-433 (2005).</li>
<li>Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+and+postnatal+development+of+retinocollicular+projections+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Prenatal and postnatal development of retinocollicular projections in the mouse.</a> J. Comp. Neurol. 230, 552-575 (1985).</li>
<li>Schmidt, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+retinotopic+connections%3A+selective+stabilization+by+an+activity-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Formation of retinotopic connections: selective stabilization by an activity-dependent mechanism.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 5, 65-84 (1985).</li>
<li>Sachs, G. M., Jacobson, M., Caviness, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+changes+in+arborization+patterns+of+murine+retinocollicular+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Postnatal changes in arborization patterns of murine retinocollicular axons.</a> J. Comp. Neurol. 246, 395-408 (1986).</li>
<li>Elmariah, S. B., Oh, E. J., Hughes, E. G., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+regulate+inhibitory+synapse+formation+via+Trk-mediated+modulation+of+postsynaptic+GABAA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes regulate inhibitory synapse formation via Trk-mediated modulation of postsynaptic GABAA receptors.</a> J. Neurosci. 25, 3638-3650 (2005).</li>
<li>Hughes, E. G., Elmariah, S. B., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+secreted+proteins+selectively+increase+hippocampal+GABAergic+length%2C+branching+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Moll.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte secreted proteins selectively increase hippocampal GABAergic length, branching and synaptogenesis.</a> Moll. Cell. Neurosci. 43, 136-145 (2010).</li>
</ol>

Die Synapse oben beschriebenen Test wird im Rahmen unserer experimentellen Ziele, wobei wir vor allem Fokus auf exzitatorische Projektionen RGCs basieren, entweder in gereinigtem Kultur oder im Gehirn Abschnitt. Wir haben eine Referenz Tabelle mit Antikörpern, die gut für die Kennzeichnung Synapsen (Tabelle 1). Diese Synapsen Test lässt sich an Synapsen bei jedem neuronalen Population oder einer anderen synaptischen Subtyp, für die es eine selektive prä-und postsynaptischen Marker zu quantif...

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Antigen </td><td> Spezies </td><td> Monoklonale / polyklonale </td><td> Verkäufer </td><td> Catalog Number </td><td> Verdünnung </td><td> Works in Kultur </td><td> Works in den Abschnitten </td></tr><tr><td rowspan="10"> Präsynaptische </td><td> Synapsin </td><td> Kaninchen </td><td> Polyklonale </td><td> Synaptic Systems </td><td> 106004 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Synapsin </td><td> Maus </td><td> Monoklonale </td><td> Synaptic Systems </td><td> 106001 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Fagott </td><td> Maus </td><td> Monoklonale </td><td> Assay Designs </td><td> VAM-PS003F </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Fagott </td><td> Guinea Pig </td><td> Polyklonale </td><td> Synaptic Systems </td><td> 141004 </td><td> 1:1000 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Synaptotagmin 1 </td><td> Kaninchen </td><td> Polyklonale </td><td> Synaptic Systems </td><td> 105002 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td> Synaptobrevin 2 (C1.69.1) </td><td> Maus </td><td> Monoklonale </td><td> Synaptic Systems </td><td> 104211 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Synaptophysin (C1.7.2) </td><td> Maus </td><td> Monoklonale </td><td> Synaptic Systems </td><td> 101011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGLUT1 </td><td> Maus </td><td> Monoklonale </td><td> Millipore </td><td> MAB5502 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGLUT1 </td><td> Meerschweinchen </td><td> Polyklonale </td><td> Millipore </td><td> AB5905 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGLUT2 </td><td> Meerschweinchen </td><td> Polyklonale </td><td> Millipore </td><td> AB2251 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td rowspan="6"> Postsynaptischen </td><td> PSD-95 (6G6-1C9-Klon) </td><td> Maus </td><td> Monoklonale </td><td> Affinity Bio-Reagenzien </td><td> MA1-045 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td> PSD-95 </td><td> Kaninchen </td><td> Polyklonale </td><td> Zymed </td><td> 51-6900 </td><td> 1:500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> Homer </td><td> Maus </td><td> Monoklonale </td><td> Synaptic Systems </td><td> 160011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Homer </td><td> Ratte </td><td> Polyklonale </td><td> Millipore </td><td> AB5875 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td> Kaninchen </td><td> Polyklonale </td><td> Synaptic Systems </td><td> 147003 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td> Maus </td><td> Monoklonale </td><td> Synaptic Systems </td><td> 147 </td><td> 1:200 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Listen Beispiele für gute prä-und postsynaptischen Markern, die wir erfolgreich in unseren Synapsen Assay genutzt haben. Seien Sie sich bewusst, dass dies nicht eine vollständige Liste aller verfügbaren Markern. Y = Ja, N = Nein, ND = nicht bestimmt. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Firma </td><td> Cat. Nein. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 20012-027 </td></tr><tr><td> Poly-D-Lysin </td><td> Sigma </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Cultrex </td><td> 3400-010-01 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Roche Diagnostics GmbH </td><td> 9002-93-1 </td></tr><tr><td> Normalem Ziegenserum </td><td> Gibco </td><td> 16210 </td></tr><tr><td> Vectashield mit DAPI </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-1200 </td></tr><tr><td> Oktober </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> Tris-Base (50 mM) </td><td> Fischer </td><td> BP152-5 </td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumin </td><td> Sigma </td><td> A2153 </td></tr><tr><td> L-Lysin </td><td> Sigma </td><td> L-1137 </td></tr><tr><td> 16% PFA-Lösung </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15711 </td></tr><tr><td> Granular PFA </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 19210 </td></tr><tr><td> 24-well Platte </td><td> Falke </td><td> 35-3047 </td></tr><tr><td> Ziege anti-Maus Alexa konjugierten Antikörpern </td><td> Invitrogen </td><td> --- </td></tr><tr><td> Versorgung </td><td> Firma </td><td> Cat. Nein. </td></tr><tr><td> 12mm, Nr. 0 Deckgläser </td><td> Karl Hecht GmbH </td><td> 1105209 </td></tr><tr><td> Nr. 1,5 Deckglas (für Scheiben) </td><td> VWR Scientific </td><td> 48393241 </td></tr><tr><td> Glasobjektträger </td><td> VWR Scientific </td><td> 48311-703 </td></tr></tbody></table>

die quantifizierung der synapsen: eine immunzytochemie-basierten assay zur synapse anzahl quantify

Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number

Eines der wichtigsten Ziele in den Neurowissenschaften ist es, die molekularen Signale, die frühen Stadien der Synapsenbildung anweisen, zu verstehen. Als solches ist es unumgänglich geworden, um objektive Ansätze zu entwickeln, um Veränderungen der synaptischen Verbindungen zu quantifizieren. Ausgehend vom Beispiel Fixierung dieses Protokoll Details, wie man Synapse Anzahl sowohl in dissoziierten neuronalen Kultur und in Hirnschnitten mittels Immunzytochemie quantifizieren. Mit Fach-spezifische Antikörper, label wir präsynaptischen Terminals sowie Standorte der postsynaptischen Spezialisierung. Wir definieren Synapsen als Punkte der Kolokalisation zwischen den Signalen, die von dieser Marker erzeugt. Die Zahl dieser Kolokalisationen wird unter Verwendung eines Plug in Puncta Analyzer (geschrieben von Bary Wark, auf Anfrage, c.eroglu @ cellbio.duke.edu) unter dem ImageJ-Software-Plattform. Die Synapse-Assay in diesem Protokoll beschrieben, kann auf jeden Nervengewebe oder Kultur Vorbereitung, für die Sie selektiv prä-und postsynaptischen Markern angewendet werden. Diese Synapsen Assay ist ein wertvolles Werkzeug, das weit in das Studium der synaptischen Entwicklung genutzt werden kann.

Dieses Protokoll beschreibt, wie zu Synapse Anzahl sowohl in dissoziierten neuronalen Kultur und in Hirnschnitten mittels Immunzytochemie quantifizieren. Mit Fach-spezifische Antikörper, label wir präsynaptischen Terminals sowie Standorte der postsynaptischen Spezialisierung. Wir definieren Synapsen als Punkte der Kolokalisation zwischen den Signalen, die von dieser Marker erzeugt.

Die Quantifizierung der Synapsen: eine Immunzytochemie-basierten Assay zur Synapse Anzahl Quantify

Eines der wichtigsten Ziele in den Neurowissenschaften ist es, die molekularen Signale zu verstehen, die die frühen Stadien der Synapsenbildung steuern. Daher ist es ...

Eines der wichtigsten Ziele der Neurowissenschaften ist es, die molekularen Signale zu verstehen, die die frühen Phasen der Synapsenbildung steuern. Daher ist es unerlässlich geworden, objektive Methoden zu entwickeln, um Veränderungen in der synaptischen Vernetzung zu quantifizieren. Um die Anzahl der Synapsen in verschiedenen experimentellen Präparationen zu bestimmen, werden kultivierte Neuronen oder gefrorene Schnittpräparate von Gehirngewebe mit selektiven prä- und postsynaptischen Markern gefärbt, um Kontaktstellen zwischen Neuronen sichtbar zu machen.Die Zellen oder Gewebe werden anschließend an einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet, wobei acht-Bit-Bilder für jeden der Kanäle erforderlich sind, die den beiden immunhistochemischen Markern entsprechen. Die Analyse der Bilder erfolgt mit ImageJ 1.29 unter Verwendung des Puncta-Analysators. Um das Ausmaß der Kolokalisation zwischen prä- und postsynaptischen Markern zu bestimmen, können die Kolokalisationstellen genutzt werden, um die Anzahl der in der Probe vorhandenen Synapsen zu ermitteln.Der Hauptvorteil dieser hier beschriebenen Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Elektronenmikroskopie liegt darin, dass der Synaps

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Die Fülle von Neurotransmitter-Rezeptoren an den Synapsen stark beeinflusst geclusterten synaptischen Stärke. Diese Methode quantifiziert fluoreszenzmarkierten Neurotransmitter-Rezeptoren in drei Dimensionen mit Single-Auflösung in...

Automatisierte Quantifizierung der Fluoreszenz-in Synaptic<em&gt; C elegans</em

Dieses Video zeigt die Bildgebung von lebenden Zellen der immunologischen Synapsentopologie und untersucht die Wechselwirkungen zwischen T-Lymphozyten und Epithelzellen, die fluoreszierende Antigene tragen. Die Fluoreszenzmikroskopie zeigt eine rote Zytoplasma-Verschiebung und gelbe Membranringe in Endothelzellen, was auf die Bildung immunologischer Synapsen hinweist.

Beurteilung der immunologischen Synapsentopologie durch Lebendzell-Bildgebung

Dieses Video zeigt die Immunfluoreszenzfärbung eines Maushirnschnitts, um die Verteilung eines spezifischen präsynaptischen Proteins zu quantifizieren. Der Prozess umfasst das Blockieren unspezifischer Stellen, das Aufbringen von Primärantikörpern für das Zielprotein und einen Referenzmarker, gefolgt von der Markierung von Sekundärantikörpern und der nuklearen Gegenfärbung. Der Referenzmarker gewährleistet eine genaue Quantifizierung, indem er eine konsistente Ausgangsbasis liefert, und die...

Quantifizierung der Verteilung eines präsynaptischen Proteins im Gehirn von Mäusen mittels Immunfluoreszenz

Quelle: McLeod, F., et al. Bewertung der Synapsendichte in Hirnschnitten von Hippocampus-Nagetieren. J. Vis. exp. (2017). Dieses Video demonstriert eine Methode zur Visualisierung synaptischer Marker in hippokampalen Hirnschnitten mittels konfokaler Immunfluoreszenzanalyse. Die Scheiben werden mit primären Antikörpern immungefärbt, die auf präsynaptische und postsynaptische Marker abzielen, gefolgt von Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern. Die markierten Marker werden dann mit Hilfe der...

Mikroskopische Analyse von Synapsen in Hippocampusschnitten der Maus mittels Immunfluoreszenz

Hier beschreiben wir einen kompletten Workflow für die qualitative und quantitative Analyse von immun Synapsen zwischen primären menschlichen T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen. Die Methode basiert auf bildgebende Durchflusszytometrie, ermöglicht die Erfassung und Auswertung von mehreren tausend Zelle Bildern innerhalb relativ kurzer Zeit.

Qualitative und Quantitative Analyse der immun Synapse im menschlichen System mit Hilfe von Imaging Durchflusszytometrie

Ein Protokoll für die präzise Identifizierung und Analyse von Synapsen im Hippokampus Scheiben mit Immunfluoreszenz ist in diesem Artikel beschrieben.

Bewertung der Synapse Dichte im Hippokampus Nagetier Gehirnscheiben

Wir beschreiben einen optischen Test zur synaptischen Vesikel (SV) recycling in kultivierten Neuronen. Kombinieren dieses Protokoll mit doppelten Transfektion einer präsynaptischen Marker und Protein des Interesses zum Ausdruck bringen kann wir finden präsynaptischen Websites, deren synaptischen Vesikel Recyclingkapazität, und bestimmen die Rolle des Proteins des Interesses.

Ein optischer Test zum synaptischen Vesicle Recycling in kultivierten Neuronen überexprimiert präsynaptischen Proteine

Hier beschreiben wir einen quantitativen Ansatz zur Bestimmung der Verteilung der synaptischen Protein im Verhältnis zu einer Marker Protein mit Immunfluoreszenz-Färbung, konfokalen Mikroskopie und Computer-basierte Analyse.

Quantifizierung der heterogenen Verteilung der synaptischen Protein im Gehirn Maus mit Immunfluoreszenz

Dieses Protokoll zeigt sowohl die immunologische Synapsenbildung als auch den anschließenden polarisierten Sekretorischen Verkehr zur immunologischen Synapse. Zelluläre Konjugate wurden zwischen einer superantigen-gepulsten Raji-Zelle (als Antigen-präsentierende Zelle) und einem Jurkat-Klon (als Effektorhelfer T-Lymphozyten) gebildet.

Bildgebung der humanen immunologischen Synapse

DetectSyn ist ein unvoreingenommener, schneller fluoreszierender Assay, der Veränderungen der relativen Synapsenzahl (prä- und postsynaptisches Engagement) über Behandlungen oder Krankheitszustände hinweg misst. Diese Technik verwendet eine Proximity-Ligationstechnik, die sowohl in kultivierten Neuronen als auch in festem Gewebe eingesetzt werden kann.

DetectSyn: Eine schnelle, unvoreingenommene fluoreszierende Methode zur Erkennung von Änderungen der Synapsendichte

Hier stellen wir zwei Protokolle zur Quantifizierung des mikroglialen Engulfments von vGLUT1-positiven Synapsen und pHRodo Red markierten rohen Synaptosomen mittels Durchflusszytometrie vor.

Quantifizierung des mikroglialen Engulfments von synaptischem Material mittels Durchflusszytometrie

Erfahren Sie, wie Sie Synapsen in neuronalen Kulturen und Hirnschnitten mittels Immunzytochemie quantifizieren. Diese Methode nutzt prä- und postsynaptische Marker zur Kolokalisationsanalyse.

Die Quantifizierung der Synapsen: eine Immunzytochemie-basierten Assay zur Synapse Anzahl Quantify

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