Agar-Block Mikrokosmen für Controlled Pflanzengewebekultur Zersetzung durch aerobe Pilze

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen aeroben holzabbauenden Pilz in einem Petrischalen-Mikrokosmos zu impfen, in dem die Holzfeuchtigkeit und exogene Substrate streng kontrolliert werden. Dies wird erreicht, indem zunächst Mikrokosmen mit exakten Volumina bekannter Edia vorbereitet werden. Dann werden das zu zersetzende Holz und alle exogenen festen Substrate auf einem Kunststoffgitter auf der Agraroberfläche zusammengefügt, ohne dass der Kontakt zwischen den Substraten möglich ist.

Anschließend wird der Mikrokosmos mit dem Testpilz beimpft und inkubiert. Nach der Inkubation werden Holzschnitte geerntet, um den Massenverlust zu bestimmen und Gewebe für die Analyse vorzubereiten. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die den Grad der biologischen Degradation von Holz und die Rolle exogener Elementquellen durch Massenverlustmessungen, Beobachtungen der Myzelmorphologie und gezielte Elementanalysen wie die induktiv gekoppelte Plasmaspektroskopie zeigen.

Hallo, mein Name ist Brooke Jacobson aus dem Labor von Dr. Jonathan Schilling am Department of Bioproducts and Biosystems Engineering an der University of Minnesota. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren, bei dem Petrischalen als Mikroumgebungen für die Zersetzung des Pflanzengewebes durch aerobe Pilze verwendet werden. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Mechanismen der pilzlichen Lignocellulose-Zersetzung zu untersuchen.

Lignocellulose ist das Pflanzengewebe, das aus Lignin, Cellulose und Hemicellulose besteht. Das Gewebe, das wir am häufigsten untersuchen, ist Holzfehler, wobei die weniger technischen Aspekte der Konstruktion von Schneckenblöcken die häufigsten Ursachen für das Versagen und die Hauptursachen für die Variabilität zwischen den Studien sind, was die Videoveröffentlichung unserer Schneckenblockeinrichtung nützlich macht. Aus Erfahrung wissen wir, dass dieses Verfahren zu qualitativ hochwertigen Ergebnissen mit geringer Variabilität führt.

Also lasst uns loslegen. Verwenden Sie für diese Experimente Petrischale, die einen Zentimeter tiefer sind als typische Petrischale, um den Kopfraum über dem Holzblock zu vergrößern. Im Mikrokosmos.

Beginnen Sie mit der Vorbereitung des Mikrokosmos, indem Sie genug Edia für 20 Milliliter pro Petrischale herstellen, um kalzium- und eisenfrei zu sein. Ein Agar mit 15 g Agar wird in einen 500-Milliliter-Messkolben gegeben, der etwa 400 Milliliter deionisiertes Wasser enthält, ergänzt durch Zusätze. Verwenden Sie zuvor vorbereitete Stammlösungen, um der Mischung Mikronährstoffe hinzuzufügen.

Sobald die Nährstoffe zugegeben sind, wird der Messkolben bis zur 500-Milliliter-Linie gefüllt. Übertragen Sie anschließend das Medium in einen 1000-Milliliter-Kolben. Der Autoklav bei 121 Grad Celsius und 16 PSI für 20 Minuten.

Es ist darauf zu achten, daß ein Volumen von 500 μl je Kolben nicht überschritten wird, um zu vermeiden, daß sich das Agri vor der Verabreichung der Proben verfestigt. Lassen Sie das Medium nach dem Autoklavieren abkühlen, um Kondensation zu minimieren. Die Minimierung der Feuchtigkeit ist bei diesen Experimenten als Feuchtigkeitsgehalt oder mc von entscheidender Bedeutung.

Über 80% verursachen Anoxie im Gewebe. Begrenzen Sie den Zerfall durch aerobe Pilze und erhöhen Sie die Variabilität einmal. Kühl. Verwenden Sie ein tragbares Pipettenhilfsmittel und sterile 10-Milliliter-Polystyrolpipetten, um aseptisch zu arbeiten.

Übertragen Sie den Agar auf einen hohen Stapel Platten in einer Biosicherheitswerkbank. Schneiden Sie dann großzügig Kunststoffgitter zu, damit sie in die Plattenböden passen. Bereiten Sie nach dem Schneiden und gründlichen Waschen der Gitter mit Wasser und Seife die Maschengitter zum Trocknen und Autoklavieren für diese Demonstration vor.

Es wird die Südliche Gelbkiefer oder SYP verwendet, da sie eine wichtige Holzquelle darstellt. Verwenden Sie im Wohnungsbau in den USA unbehandeltes Holz und schneiden Sie 19 x 19 Millimeter astfreie Blöcke aus einem einzigen Längsschnitt entlang der Faser. Schneiden Sie diese Länge in 19 Millimeter große Würfelblöcke

Teilen Sie die 19 Millimeter großen, würfelförmigen Blöcke entlang der Faser mit Meißel und Hammer statt mit einer Säge in zwei Hälften. So entsteht eine raue Blockkante mit der Vorderseite nach unten auf dem Kunststoffgewebe im Mikrokosmos agri block und eine glatte Oberkante zum Beschriften. Beschriften Sie die glatte Kante der Blöcke mit einem Bleistift, schneiden Sie genügend Blöcke ab, um die Behandlungen zu erfüllen, sowie die nicht beimpften Kontrollen, die sowohl als Kontaminationsmonitore als auch als Ausgangsdaten dienen und parallel für ofengetrocknetes Material konditioniert werden, legen Sie die Proben in Aluminiummolkepfannen und legen Sie sie für 48 Stunden bei 100 Grad Celsius in einen Konvektionsofen.

Übertragen Sie die Proben aus dem Ofen in ein Trockenmittel, um sie einmal abzukühlen. Kühl. Wiegen Sie die Proben vor, um das anfängliche Trockengewicht des Ofens zu bestimmen. Bereiten Sie abschließend die Proben, einschließlich Kunststoffgitter und Holz, für den Autoklaven vor, indem Sie sie fest mit Folie umwickeln, um die Benetzung zu minimieren.

Dies erfordert nicht, dass jede Probe einzeln verpackt wird, sondern dass die Dampfexposition gering und konstant ist. Autoklavieren Sie die markierten Proben eine Stunde lang bei 121 Grad Celsius und 16 PSI. In einer sterilen Biosicherheitswerkbank werden leere AEs, eine Quellplatte für das Inokulumnetz, das Pflanzensubstrat, exogene Materialien, ein Sharpie, Paraform-Streifen, Pinzetten und Transferwerkzeuge zusammengebaut.

Der nächste Schritt der Impfung besteht darin, die Gegenstände in den Agri zu geben und Petrischalen zu enthalten, um das Kontaminationsrisiko zu minimieren. Flammentransferwerkzeuge und Pinzetten mit 95%Ethanol, wie sie verwendet werden. Lege zuerst das Plastiknetz in die Petrischale.

Geben Sie dann hier das Holzsubstrat hinzu. Zwei Holzblöcke werden entlang der Länge des Netzes hinzugefügt, so dass Daten aus der frühen und späten Ernte gepaart werden können. Diese Blöcke werden Seite an Seite mit Getreide und mit Blick auf die Spitze der Quelle des Pilzinokulums hinzugefügt.

Fügen Sie als Nächstes die exogenen Materialien hinzu. Hier. Die Rolle von Gips wird beim Zerfall durch einen fadenförmigen Pilz getestet. Daher sollte der Pilz auf diese Gipsscheiben treffen, bevor er das Holz erreicht.

Zwischen jedem Block und jedem Inokulumpunkt auf dem Netz wird eine Gipsscheibe hinzugefügt. Achten Sie darauf, dass die Scheiben im Holz nicht mit den Scheiben in Berührung kommen, während Sie sie dicht beieinander halten. Für das Pilzinokulum verwenden Sie einen Korkburen mit der Nummer vier mit sieben Millimetern Durchmesser, um Pfropfen aus zweiwöchigen Kulturen herzustellen, die in 20 Millilitern Agar gezüchtet wurden.

Dies hilft, das Inokulumvolumen zu kontrollieren. Bei nicht geimpften Kontrollen ist es am besten, einen Stopfen von einer sterilen Platte hinzuzufügen. Lassen Sie keinen Kontakt zwischen dem Inokulum und den exogenen Substraten oder dem Holz zu, sondern platzieren Sie sie nahe beieinander.

Verwenden Sie einen Inokulumstopfen pro Block. Verschließen Sie das Geschirr mit Param, das mit einem Rasiermesser geschnitten wurde, halten Sie die Platten waagerecht und wickeln Sie den Param in einer gleichmäßigen, kontinuierlichen Bewegung ein. Beschriften Sie abschließend die Schalendeckel mit einem alkoholbeständigen Marker, indem Sie die Blocknummern direkt auf die jeweiligen Substrate etikettieren.

Zeichnen Sie auch Kreise über die Gipsscheiben. Übergeben Sie die Platten vorsichtig in einen biologischen Inkubator, um ein Anstoßen des Inhalts zu vermeiden und die Kondensation durch Temperaturschwankungen zu minimieren. Die hier verwendeten Bedingungen liegen bei 20 Grad Celsius und im Dunkeln führen Zeitreihenernten bis auf die letzte Ernte aseptisch durch.

Entfernen Sie in der fünften Erntewoche die gesamte Behandlungspartie. Besprühen Sie jede Unter- und Oberseite mit 70 % Ethanol und verwenden Sie eine geflammte Pinzette, um das Material in der Biosicherheitswerkbank zu entfernen. Mach Fotos, bevor du die Agri-Platten zerstörst, und konzentriere dich auf jeden Morph F oder jede Melone.

Entfernen Sie dann die zu behandelnden Blockaden. Rollen Sie überschüssiges Pha weg, aber achten Sie darauf, dass kein verrottetes Material aus dem Ofen verloren geht. Trocknen Sie die Blöcke in Aluminiumwannen und bestimmen Sie den Massenverlust mit den Frisch- und Trockengewichten der Steuerungen, um einen übermäßigen Docht zu überwachen.

Massenverlustdaten helfen bei der Messung des Zerfallsfortschritts und sind wichtige Daten. Wenn die Elementkonzentrationen auf der Basis des Grammgewichts berechnet werden sollen, müssen die prozentualen Daten normiert werden. Beschriften und verfolgen Sie für Statistiken alle dunkelbraunen Blöcke, die eindeutig durchnässt sind.

Vernichten Sie schließlich die Kulturen in autoklavierbaren Beuteln und sparen Sie dabei das Stütznetz aus Kunststoff und alle anderen Komponenten, die für zukünftige Experimente recycelt werden können. Mit dem Agri-Block-Mikrokosmos-Setup ruhen Kiefernholzblöcke auf Kunststoffgittern, um die Blöcke über den Agri-Kontakt zu heben. Kreisförmige Crains wuchsen in direktem Kontakt mit den Gipsoberflächen und in die Holzklötze.

Dieses Myzel stellt eine wichtige Verbindung zwischen Holz und exogenen Nährstoffquellen dar. Bei der Kontrolle dieser exogenen Materialquellen im Agar oder einem festen Material ist ein wesentlicher Vorteil eines Agri-Block-Designs gegenüber dem Bodenblock-Design der mittlere prozentuale Gewichtsverlust als Maß für das Ausmaß des Holzverfalls durch Ser Crain's nach fünf und 15 Wochen. Die Inkubation mit Kiefer in Agroblock-Mikrokosmen ist hier zu sehen.

Es gab keine Behandlungen. Fünf Millimolare Calciumchloride, die Agar mit mehr als 99 % reinem Gips oder 1 % eisenmodifiziertem Gips für jeden Erntebalken unter demselben Buchstaben zugesetzt werden, unterscheiden sich nicht signifikant. Da die Fehlerbalken die Standardabweichung darstellen, wurde ein Gewichtsverlust von mehr als 60 % bei den braunen verrotteten Kiefernblöcken der Kontrolle beobachtet, was dem Standardziel der American Society for Testing and Materials von mehr als 50 % Fäulnis entspricht.

Der durchschnittliche Variationskoeffizient des Zerfalls betrug in Woche 16 0,055. Neben einer geringen Variabilität wurde ein Behandlungseffekt beobachtet. Der Pilzzerfall wurde durch Calciumzusätze gehemmt, sei es in Form von Calciumchlorid oder als reiner Gips an den Agar.

Interessanterweise steigen die Zerfallsraten mit der Zugabe von Eisen zum Gips wieder an. Die Annahme, dass Eisen und nicht Kalzium ist, ist entscheidend für die Beobachtung der fünf Replikate in Woche 15 des Zerfalls. Durch die gleiche Braunfäule, den Testpilz, die kreisförmigen Lamine, verrät sich die Farbe des Myzels.

Unterschiede in den äußeren Hyphen zwischen den Behandlungen, Blöcke wurden entfernt und oben und getrocknet. Aufdeckung des Mangels an Mein in der kalziumfreien Behandlung. Die Vergilbung bei reinen Calciumbehandlungen und das Rostbild bei Eisenbehandlungen ergänzten die Behandlung.

Das Steuerelement stellt nicht inokulierte Blöcke zum Vergleich dar. Interessanterweise gehen die mein-Effekte bei Verwendung eines Mediums mit hohem Eisengehalt verloren. Insgesamt deutet dies darauf hin, dass dieser Pilz Eisen und nicht Kalzium verwendet.

In diesen Materialien haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie Sie mit einem Schneckenblock-Setup den biologischen Abbau von Pflanzengewebe durch aerobe filamentöse Pilze erfolgreich testen können. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, dass die Substrate nicht miteinander in Kontakt kommen, insbesondere das Pflanzengewebe und die Schnecke, den Feuchtigkeitsgehalt der Schnecke und der Blutplättchen minimieren und sicherstellen, dass sich der Inhalt jeder Platte vor der Inkubation nicht verschoben hat. Wenn Sie diese Variablen im Hinterkopf behalten, können Sie die Zerfallsumgebung viel besser kontrollieren, als wenn Sie einen Erdblock verwenden.

Sie können Daten mit einer statistischen Aussagekraft generieren, die zur Beantwortung Ihrer Forschungsfragen erforderlich ist. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.